應(yīng)用CD83 和HSF5 鑒別生前與死后皮膚燒傷

趙龍瑞，肖靜，尚晴，李濤，劉新社，官方霖

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710061

在法醫(yī)學(xué)實踐中，火場發(fā)現(xiàn)的尸體常常需要辨別是生前燒死還是死后焚尸，其主要依據(jù)是尸體是否存在生活反應(yīng)。傳統(tǒng)法醫(yī)學(xué)鑒定主要基于皮膚紅斑和水皰，呼吸道和（或）消化道內(nèi)的煙灰沉積以及血液中碳氧血紅蛋白濃度升高進行判斷。但法醫(yī)病理學(xué)實踐中發(fā)現(xiàn)：在死后焚尸案例中尤其是死亡時間與焚尸時間十分接近時皮膚紅斑和水皰也會出現(xiàn)；在開放露天的火場中，呼吸道和消化道煙灰沉積以及血液中碳氧血紅蛋白濃度升高的現(xiàn)象可能不會發(fā)生，火場中的尸體更需要明確是燒死還是死后焚尸。因此，法醫(yī)學(xué)實踐中需要更為科學(xué)、精準(zhǔn)、高效的方法對生前燒死和死后燒傷進行鑒別。

白細胞分化群83（cluster of differentiation 83，CD83）編碼的蛋白質(zhì)是受體免疫球蛋白家族成員之一，參與抗原呈遞、免疫抑制等生命過程[1-2]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子5（heat shock transcription factor 5，HSF5）是轉(zhuǎn)錄因子熱休克因子家族成員之一，有研究[3]表明，HSF5 在細胞周期、細胞凋亡方面可能有重要作用。

在前期研究[4]中，本課題組建立了小鼠燒傷模型，使用芯片技術(shù)檢測出24 個差異表達的microRNA（其中19 個上調(diào)，5 個下調(diào)），并通過京都基因和基因組百科庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）、基因本體（gene ontology，GO）分析等篩選出293 個上游表達基因，其中CD83 和HSF5 基因表達水平變化較為明顯。基于以上研究結(jié)果，本研究將CD83 及HSF5 作為目標(biāo)基因，通過建立小鼠皮膚燒傷模型，檢測燒傷皮膚中CD83 及HSF5 的mRNA 變化，并在法醫(yī)學(xué)尸體解剖皮膚檢材中驗證，以期探索其在法醫(yī)學(xué)實踐中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚深Ⅱ度燒傷模型制作及檢材提取

采用由西安交通大學(xué)動物實驗管理中心提供的健康雄性BALB/c 小鼠［7～8 周齡，（25±3）g］進行動物實驗，分為生前燒傷組、空白對照組和死后燒傷組。

生前燒傷組按照參考文獻[4]進行建模：腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，使用電動剃毛刀剃除小鼠背部毛發(fā)，暴露背部皮膚。使用加熱至100 ℃的銅梳（30 mm×10 mm）燒灼小鼠背部皮膚，持續(xù)4 s，0.5 h 后腹腔注射過量0.3%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）處死所有小鼠，室溫（24 ℃）保存。通過組織學(xué)驗證[4]，此過程可造成小鼠背部皮膚深Ⅱ度燒傷。生前燒傷組的小鼠依次在其處死后0、6、12、24、48、72、96、120 h 進行取材（每時間點各3 只）。仔細將小鼠背部皮膚與肌肉進行分離，使用外科剪取燒傷處皮膚5 mm×5 mm，取樣后立刻將其置于液氮中保存待檢。

空白對照組和死后燒傷組每組各3 只小鼠，采用前述方法麻醉脫毛并處死，空白對照組皮膚樣本取自未損傷的小鼠，死后燒傷組樣本取自處死小鼠0.5 h后，按照上述方法制造燒傷模型后取小鼠皮膚，取材大小均為5 mm×5 mm。動物實驗由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)，所有實驗過程均得到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審核、批準(zhǔn)（審批號20190103）。

1.2 人體皮膚燒傷樣本提取

人體皮膚燒傷樣本取自死亡原因為重度燒傷或伴一氧化碳（CO）中毒的法醫(yī)學(xué)尸體解剖實際案例，其中男性樣本10 例，女性樣本5 例，對照組取自相同案例未受損傷處皮膚。利用Agilent RNA 6000 Nano 試劑盒（美國Agilent 公司）結(jié)合Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）檢測RNA 完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN），詳細信息見表1。解剖時仔細將取材部位皮膚和肌肉進行分離，并在燒傷和未燒傷部位皮膚各取5 mm×5 mm，置于裝有2.0 mL RNA 穩(wěn)定保存液（RNAlaterTMstabilization solution，RNAlater）的離心管中，并迅速放入液氮中保存。本研究由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)，所有實驗過程均得到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審核、批準(zhǔn)（審批號20190103）。

表1 案例資料Tab.1 Cases information

1.3 RT-qPCR

使用PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）獲得總RNA 的cDNA 拷貝。使用ECOTMReal-Time PCR 系統(tǒng)（美國Illumina 公司）和SYBR?Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa 公司）在48 孔反應(yīng)板上進行RT-qPCR 實驗。選用GAPDH作為RT-qPCR 的內(nèi)參，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，1 個循環(huán)；95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；95 ℃15 s，55 ℃15 s，95 ℃15 s，1 個循環(huán)。反應(yīng)體系：2×Realtime PCR Mix 5.0 μL，內(nèi)參及目的基因的上下游引物各0.5μL，無菌無酶水3.0μL，cDNA 1.0 μL，總體積為10.0 μL，通過2-ΔΔCt方法確定其相對表達水平?；蛱禺愋砸镄畔⒁姳?。

表2 RT-qPCR 特異性引物序列Tab.2 Specific primer sequences for RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣本均進行3 次RT-qPCR 實驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用非參數(shù)Mann WhitneyU檢驗進行個體間的比較，通過Spearman’s Rho 檢驗分別進行RIN 與年齡、性別、死后經(jīng)過時間（postmortem interval，PMI）等參數(shù)的相關(guān)性分析。選用Graphpad prism 7.0（美國GraphPad Software 公司）和Stat-View（美國StatView 公司）進行統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。同時計算mRNA 相對含量在組間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），F(xiàn)C 值越大，差異越顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚燒傷樣本

與死后燒傷組和空白對照組相比，生前燒傷組（死后0 h）CD83 和HSF5 的mRNA 水平升高（P＜0.05，表3）。CD83 的mRNA 水平升高在死后96 h 仍可明顯檢出，而HSF5的mRNA 水平升高可以持續(xù)至死后72 h（表3）。生前燒傷組（死后0 h）、死后燒傷組和空白對照組RIN 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但隨著PMI 的延長，生前燒傷組RIN 逐漸降低（表4）。

表3 不同PMI下CD83 和HSF5 的差異倍數(shù)Tab.3 Fold change of CD83 and HSF5 at different PMI（n=3，xˉ ±s）

表4 死后120 h 內(nèi)RIN 變化Tab.4 RIN changes within PMI 0 h and 120 h（n=3，）

表4 死后120 h 內(nèi)RIN 變化Tab.4 RIN changes within PMI 0 h and 120 h（n=3，）

2.2 人體皮膚燒傷樣本

與人體正常皮膚相比，在15 例（男性10 例，女性5 例）尸體樣本中，11 例（男性7 例，女性4 例，59 h≤PMI≤75 h，3.4≤RIN≤5.0）CD83 和HSF5 的mRNA 升高（P＜0.05），4 例（男性3 例，女性1 例，52 h≤PMI≤73 h，3.9≤RIN≤4.9）變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 人體檢材中燒傷與未燒傷處皮膚CD83 和HSF5 差異倍數(shù)Tab.5 Fold changes of CD83 and HSF5 in human burned and unburned skin samples（n=3，）

表5 人體檢材中燒傷與未燒傷處皮膚CD83 和HSF5 差異倍數(shù)Tab.5 Fold changes of CD83 and HSF5 in human burned and unburned skin samples（n=3，）

注：1）與未損傷皮膚相比，P＜0.05。

3 討論

在火場發(fā)現(xiàn)尸體時，法醫(yī)需要謹慎評估死亡原因和死亡方式，即判斷是否存在殺人后焚尸以掩蓋案件真相的可能。然而，傳統(tǒng)的鑒定指標(biāo)如尸體皮膚紅斑、呼吸道煙塵等在法醫(yī)病理實踐過程中可能會存在不明確甚至缺失的情況，這些情況的出現(xiàn)提示尋找準(zhǔn)確可靠的生活反應(yīng)指標(biāo)的重要性。據(jù)報道[5-6]，一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可用于探究生活反應(yīng)。GAUCHOTTE 等[7]認為，CD15 及類胰蛋白酶是生活反應(yīng)存在的可靠標(biāo)志物。目前有關(guān)生前燒傷與死后焚尸的生活反應(yīng)鑒別研究較少，免疫組織化學(xué)研究[8-10]表明，生前燒死尸體的呼吸道和肺部中熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）表達水平升高。KUBO 等[11]研究認為，生前燒死尸體皮膚中水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）的mRNA 表達明顯增加。然而在實際檢案中，相關(guān)指標(biāo)缺乏統(tǒng)一的量化標(biāo)準(zhǔn)，無法進行科學(xué)精準(zhǔn)的檢測，尤其是免疫組織化學(xué)法等受取材等因素的影響，顯微鏡下觀察可能會出現(xiàn)漏檢錯檢的情況，進行鏡檢也較為耗時費力，而針對mRNA 的檢測則更為精確高效，但針對燒傷相關(guān)基因檢測并未形成系統(tǒng)。皮膚是人體最大的器官，覆蓋人體表面，在火場中，皮膚作為第一接觸熱源的組織器官，相對呼吸道、血液等，反應(yīng)更為靈敏、直接。因此，本研究通過對皮膚燒傷動物模型和人體燒傷樣本的研究，以期尋找有實際應(yīng)用價值的生活反應(yīng)指標(biāo)。

對小鼠的研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，生前燒傷皮膚中CD83 和HSF5 的mRNA 水平明顯升高，而死后燒傷組并沒有明顯變化，提示CD83 及HSF5 傷后反應(yīng)靈敏。針對尸體隨時間推移存在不同程度的死后變化現(xiàn)象，實驗通過對不同時間點的RIN 變化進行了觀測。RIN 反映RNA 的降解情況，最小值為1，表示RNA 完全降解；最大值為10，表示RNA 完整、未降解[12]。本研究中，RIN 隨著時間增加而降低，符合死后mRNA 降解的一般變化。與空白對照組相比，生前燒傷組于死后0 h CD83 和HSF5 表達量明顯增加，且隨著時間推移，表達量有所降低，但CD83 表達量在死后96 h 仍明顯高于空白對照組，HSF5 表達量增加也可以持續(xù)至死后72 h。這些結(jié)果表明，即使尸體存在腐敗、自溶等死后現(xiàn)象，CD83 和HSF5 的mRNA 高表達在一定時間內(nèi)仍可檢測出，有望成為鑒別生前燒傷生活反應(yīng)指標(biāo)。為進一步探索CD83 和HSF5 的法醫(yī)學(xué)實際應(yīng)用價值，檢測15 例人體皮膚燒傷樣本的mRNA 水平變化，為減少mRNA 降解對本實驗的影響，實驗測量了所有人體樣本的RIN，結(jié)果顯示所有樣本的RIN 均大于3，提示樣本mRNA 的完整性較好。在15 例人體樣本中，11 例CD83 和HSF5 的mRNA 升高，4 例沒有明顯變化，該情況是否與個體差異有關(guān)還要進一步驗證?？傮w來講，本研究由于客觀條件受限，符合實驗要求的燒傷人體樣本數(shù)量不足，無法對人體樣本相同部位mRNA 進行檢測，未排除不同人體部位mRNA 表達水平可能不一致的情況，以上問題都可能對結(jié)果造成影響。后續(xù)研究我們將進一步完善各種不足，深入探究燒傷皮膚中的mRNA 變化，尋找可靠的生活反應(yīng)指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過建立小鼠皮膚燒傷模型以及人體燒傷組織樣本驗證，探索了CD83 及HSF5 在鑒別生前燒傷和死后焚尸中的實際應(yīng)用價值，CD83 和HSF5 mRNA 有望作為皮膚燒傷生活反應(yīng)指標(biāo)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實踐。