利用COI基因鑒別長(zhǎng)三角地區(qū)常見(jiàn)嗜尸性蠅類

徐旺，王禹，王嫚，王穎慧，王江峰

蘇州大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州215000

近年來(lái)，法醫(yī)昆蟲學(xué)的相關(guān)研究進(jìn)展十分迅速，研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)已獲得了大量嗜尸性蠅類的生長(zhǎng)發(fā)育數(shù)據(jù)?，F(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)人員通常利用形態(tài)學(xué)方法對(duì)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)出現(xiàn)的嗜尸性蠅類進(jìn)行種屬鑒別，結(jié)合相應(yīng)的蠅類生長(zhǎng)發(fā)育數(shù)據(jù)，即可有效地估計(jì)死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）[1]。

然而在實(shí)際工作中，形態(tài)學(xué)鑒別方法并不總是有效的。一方面，案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)收集的蠅類樣本可能為低齡幼蟲或蛹，有些樣本是不完整的，增加了利用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行種屬鑒別的難度。另一方面，大部分現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)人員缺乏昆蟲學(xué)知識(shí)，難以通過(guò)形態(tài)學(xué)方法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)的蠅類樣本進(jìn)行鑒定。

隨著DNA 檢測(cè)和分析技術(shù)的飛速發(fā)展，法醫(yī)昆蟲學(xué)領(lǐng)域逐漸嘗試應(yīng)用各種分子生物學(xué)方法對(duì)法醫(yī)學(xué)昆蟲（尤其是嗜尸性蠅類）進(jìn)行種屬鑒定，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[2]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFL）[3]等。然而大量研究[4-6]表明，DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）可以更有效地對(duì)嗜尸性蠅類進(jìn)行種屬鑒別。陳慶等[4]通過(guò)對(duì)線粒體DNA 上的細(xì)胞色素c 氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因1 076 bp序列的測(cè)定和比較分析，成功地將不同地點(diǎn)采集的7個(gè)嗜尸性蠅類物種進(jìn)行了區(qū)分，序列信息的聚集結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定的種類歸屬完全一致。GUO等[5]利用700bp的COⅠ基因序列和678 bp的period基因序列對(duì)9個(gè)麻蠅物種進(jìn)行了鑒定。MáRQUEZ-ACERO 等[6]通過(guò)分析599 bp 的COⅠ基因序列，鑒定了哥倫比亞地區(qū)的6 種麗蠅。在眾多基因中，線粒體DNA 的COⅠ基因被證實(shí)能夠?qū)Υ蟛糠质仁韵夘愇锓N進(jìn)行高效的區(qū)分，因此也是法醫(yī)昆蟲學(xué)分子鑒定研究中最常用的基因[4]。

雖然此前對(duì)于蠅類鑒定的研究很多，但是，研究所采用的蠅類樣本多為使用小塊肉或者小型動(dòng)物尸體放置于自然環(huán)境所采集的，且主要采集的是成蟲，這就存在以下問(wèn)題：（1）采集的蠅類可能只是在尸體環(huán)境停留而并不取食，并非嗜尸性蠅類。（2）樣本數(shù)量較少，多數(shù)蠅類物種只有1 只個(gè)體，難以保證所獲得序列的準(zhǔn)確性。（3）研究所采用的基因及其引物沒(méi)有統(tǒng)一的指標(biāo)。因此想要解決某一地區(qū)的嗜尸性蠅類的種屬鑒別問(wèn)題時(shí)不知道使用哪種引物和指標(biāo)，導(dǎo)致嗜尸性蠅類分子鑒定研究的推廣遇到阻礙。

鑒于以上原因，本研究的蟲源全部來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的種類，均來(lái)自長(zhǎng)三角地區(qū)，且在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁殖多代，并被證明是嗜尸性昆蟲，擬通過(guò)基于COⅠ基因片段序列對(duì)長(zhǎng)三角地區(qū)常見(jiàn)嗜尸性蠅類的種屬進(jìn)行分子鑒定，以期為推斷死亡時(shí)間提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 蟲源

依據(jù)《中國(guó)常見(jiàn)蠅類檢索表》進(jìn)行形態(tài)學(xué)種類鑒定，本研究中的7 個(gè)蠅類物種分別為大頭金蠅Chrysomya megacephala、緋顏裸金蠅Chrysomya rufifacies、巨尾阿麗蠅Aldrichina grahami、廄腐蠅Muscina stabulans、棕尾別麻蠅Boettcherisca peregrina、絲光綠蠅Lucilia sericata和肥軀金蠅Chrysomya pinguis，分別在2015—2019 年采自于野外動(dòng)物尸體上，并經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室多代培養(yǎng)，遺傳穩(wěn)定（表1）。

表1 嗜尸性蠅類的生物學(xué)分類Tab.1 Biological classification of necrophagous flies

1.2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

使用HighPrep? Insect DNA 試劑盒（美國(guó)Mag-Bio Genomics 公司），根據(jù)說(shuō)明書操作提取全基因組DNA。本研究的各個(gè)物種均來(lái)自該物種的同一母體，所以不進(jìn)行種內(nèi)遺傳差異檢測(cè)，每個(gè)蠅類物種取2～5只進(jìn)行DNA 提取，每個(gè)個(gè)體提取得到20 μL 的DNA樣本。

通過(guò)COⅠ基因的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為：LCO-1490（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3'）和HCO-2198（5'-TAAACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA-3'）。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括2 μL（50～200 ng/μL）的模板DNA、12.5 μL 的2×GoTaq?綠色Master Mix（美國(guó)Promega 公司）、各1 μL 的上下游引物（50 μmol/L），添加無(wú)核酸酶水至反應(yīng)體系為25 μL。PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95 ℃2 min；95 ℃30 s，45 ℃30 s，73 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；73 ℃5 min，于4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司按Sanger 測(cè)序方法完成測(cè)序。

1.3 序列分析

使用SnapGene Viewer 4.3.11 軟件（美國(guó)Insightful Science 公司）查看測(cè)序結(jié)果，對(duì)比正反向測(cè)序結(jié)果拼接獲得目的序列。將序列上傳至GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank），經(jīng)BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查詢與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已知核酸序列進(jìn)行序列同源性搜索比對(duì)。通過(guò)MEGA 7.0.26 軟件（https://www.megasoftware.net/）以Kimura 2-parameter模型計(jì)算堿基組成和種間進(jìn)化分歧率，以鄰接法（neighbor joining method，NJ）和非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并以鱗翅目的小地老虎Agrotis ipsilon作為外群，Bootstrap 值為500。

2 結(jié)果

2.1 種間進(jìn)化分歧率分析

種間進(jìn)化分歧率（表2）結(jié)果顯示，種間進(jìn)化分歧率最大的是廄腐蠅與棕尾別麻蠅，達(dá)到了15.3%；而種間進(jìn)化分歧率最低的是大頭金蠅與肥軀金蠅，為2.2%。

表2 種間進(jìn)化分歧率Tab.2 Sequence divergence between species（%）

2.2 堿基組成分析

將正反向序列拼接后，獲得658 bp 的目的序列（表3）。本研究中蠅類物種的平均堿基組成為A（30.14%）、T（38.23%）、C（15.98%）、G（15.65%），其中A+T（68.37%）遠(yuǎn)高于C+G（31.63%）。

表3 COI基因序列的核苷酸頻率分布Tab.3 Summary of nucleotide frequency distribution for COI gene sequences（%）

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

本研究中的蠅類物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示，7個(gè)雙翅目物種聚集在一起，且均與作為外群的鱗翅目的小地老虎距離較遠(yuǎn)。在兩種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，大頭金蠅、肥軀金蠅和緋顏裸金蠅3 個(gè)物種均聚集在一簇，且支持度較高（＞95%）。在NJ 樹(shù)中，多個(gè)分支的支持度極低（＜50%），且與生物學(xué)分類（表1）并不一致，如蠅科的廄腐蠅與麻蠅科的棕尾別麻蠅聚集成了一簇；而在UPGMA 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，5 個(gè)麗蠅科的物種聚集成簇，其與廄腐蠅（蠅科）間的距離相較于棕尾別麻蠅（麻蠅科）間更近，且各分支支持度均較高（＞85%），與生物學(xué)分類（表1）相符。故傾向于接受UPGMA 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果。

圖1 COI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree for COI gene sequences

3 討論

本研究從3 個(gè)科的蠅類（麗蠅科、麻蠅科和蠅科）中提取線粒體COⅠ基因，采用的蠅類樣本均來(lái)自經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室多代培養(yǎng)的種群。本研究的主要目的是驗(yàn)證通過(guò)COⅠ基因?qū)﹂L(zhǎng)三角地區(qū)的常見(jiàn)嗜尸性蠅類進(jìn)行分子鑒定的可靠性。

利用UPGMA 對(duì)雙翅目3 科7 種常見(jiàn)嗜尸性蠅類樣本構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，近緣種屬形成姊妹簇或樹(shù)形的分支部分，再構(gòu)成不同科的進(jìn)化樹(shù)分支。聚類效果較好，且與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。整體上可以將7 種蠅類分麗蠅科、蠅科、麻蠅科三大分支，所有樣本均位于某一特定的分支上，盡管不能對(duì)所有物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，但對(duì)物種的鑒定起到了很好的驗(yàn)證和補(bǔ)充。

線粒體DNA 的進(jìn)化和遺傳速度快，不需要基因重組。因此，在評(píng)估昆蟲類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面，線粒體DNA 比核DNA 更具優(yōu)勢(shì)[7]。其中，COⅠ基因已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)上重要的蠅類鑒定[8]。然而，基因條形碼技術(shù)對(duì)近源物種進(jìn)行鑒定時(shí)的效果并不十分理想。例如，BHARTI 等[9]通過(guò)使用一段1 423 bp的COⅠ基因片段對(duì)印度地區(qū)的常見(jiàn)嗜尸性麗蠅進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明當(dāng)使用該基因片段時(shí)，星島金蠅Chrysomya chani和大頭金蠅2 個(gè)物種的種間進(jìn)化分歧率極低（0.11%），無(wú)法將這兩個(gè)物種進(jìn)行區(qū)分。因此，DNA 條形碼技術(shù)并不能解決所有的種屬鑒別的問(wèn)題。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，同時(shí)使用多個(gè)基因進(jìn)行分子鑒定是有必要的，這樣可以增加鑒定的準(zhǔn)確率。

為了可靠地進(jìn)行物種的分子鑒定，目標(biāo)種群具有較高的種間遺傳多樣性（＞3%）是非常重要的[10-11]。在本研究中，除了大頭金蠅和肥軀金蠅2 個(gè)物種之間的種間進(jìn)化分歧率（2.2%）小于3%以外，其他物種間均大于3%，可以很好地區(qū)分這些物種。大頭金蠅和肥軀金蠅之間的進(jìn)化分歧率較低是可以解釋的，因?yàn)閮烧呤墙次锓N，并且先前也有研究[12]表明，近源的金蠅物種有非常低的種間進(jìn)化分歧率。因此，可能需要增加其他基因片段，如核基因ITS2或cytb等[13]，有待進(jìn)一步研究。

對(duì)所得樣本的COⅠ基因進(jìn)行核苷酸頻率分析，結(jié)果顯示堿基組成具有明顯的AT 偏倚，這與此前的大多數(shù)研究一致[14]。根據(jù)本研究中UPGMA 法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，麗蠅科與蠅科物種間的距離相較于麗蠅科與麻蠅科更近，這說(shuō)明麗蠅科與蠅科的親緣關(guān)系可能更為密切，該結(jié)果也與卓犖等[15]的研究結(jié)果相符合。不同科的蠅類物種分別位于進(jìn)化樹(shù)上的不同分支，且各分支的Bootstrap 檢驗(yàn)可信度均大于85，說(shuō)明聚類結(jié)果較可靠，能夠有效區(qū)分。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中位于同一分支的兩對(duì)物種間的種間進(jìn)化分歧率為各物種間進(jìn)化分歧率中最低，證實(shí)了結(jié)果的可靠性。

總而言之，本研究驗(yàn)證了分子鑒定技術(shù)在長(zhǎng)三角地區(qū)常見(jiàn)嗜尸性蠅類種屬鑒別中的可行性，同時(shí)證實(shí)了COⅠ基因片段序列能夠較為準(zhǔn)確地對(duì)不同蠅種的種屬進(jìn)行鑒別。今后的研究，既要對(duì)嗜尸性蠅類物種進(jìn)行全面的研究，也要對(duì)其他嗜尸性昆蟲進(jìn)行分子鑒定的探究，從而為PMI 推斷提供有力的支撐。