富血小板血漿對大鼠光老化皮膚中膠原蛋白和氧化應(yīng)激的影響

侯紹蔚，米希婷，武曉華 ,趙愛玲

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；2.大同市第五人民醫(yī)院，山西大同 037009；3.山西大同大學(xué)第一臨床醫(yī)院，山西大同 037009）

皮膚是人體最外層的屏障，與環(huán)境直接接觸，可以通過感知環(huán)境來調(diào)節(jié)局部和全局的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[1]。皮膚老化是一種復(fù)雜的生物現(xiàn)象，可分為內(nèi)在老化和外在老化。面部皮膚老化是一種影響皮膚和面部深層結(jié)構(gòu)的退行性過程，主要由內(nèi)在(年齡)因素所引起，但也與外在因素有關(guān)，尤其是紫外線輻射。內(nèi)在老化主要是由基因決定的，它通過結(jié)締組織緩慢的、部分可逆的退化來影響皮膚，其方式與大多數(shù)內(nèi)部器官相似。外源性老化，通常稱為光老化，由環(huán)境暴露引起，主要是紫外線輻射。持續(xù)暴露在紫外線輻射下，可以導(dǎo)致膠原蛋白變性，彈性蛋白結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能和完整性下降，導(dǎo)致皮膚失去光澤和彈性，出現(xiàn)老化跡象，甚至在年輕人中出現(xiàn)過早衰老的表現(xiàn)[2]。其臨床特征是干燥、色素沉著、松弛和深層皺紋[3]。

再生醫(yī)學(xué)是一個新興的領(lǐng)域，其重點是基于細(xì)胞和組織的治療，適用于整形手術(shù)，包括皮膚的老化。其機制主要是將未分化的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分化細(xì)胞，最終完成重建和修復(fù)效果。此外，干細(xì)胞能分泌多種生長因子、細(xì)胞因子和生物活性分子，刺激組織再生，從這個意義上講，由于富血小板血漿（plateletrich plasma,PRP）中各種生物因子的存在，如血小板來源生長因子、轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，可以促進成纖維細(xì)胞的活化和膠原蛋白的合成，也被描述為具有再生效應(yīng)[4]。由于PRP 是自體血小板濃縮物，制備簡單，容易獲得，在改善皮膚光老化方面有較多研究[5]。本研究將探討PRP 對光老化Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

18 只3～4 月齡的健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量260～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；SOD 活性檢測試劑盒和丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CollagenⅠ抗體和CollagenⅢ抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮膚光老化模型建立

根據(jù)文獻報道的照射方案并稍作修改進行紫外線照射[6]：大鼠背部剪毛，置于自制的紫外燈照射箱中進行照射，每周照射5 d,連續(xù)照射14周。第1周每天照射20 min，第二周增加5 min,從第30 d開始保持每天照射30 min直至建模結(jié)束。

1.2.2 PRP的制備

腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉大鼠，用預(yù)先吸入0.3 mL 3.2%枸櫞酸鈉溶液的注射器穿刺至左心室收集動脈全血3 mL，共計60 mL。PRP的制備過程包括2個離心步驟。將全血在18 ℃下以300 r/min的速度離心5 min，收集全部血漿及交界面下3 mm液體，然后將其轉(zhuǎn)移至另一離心管中在18 ℃下以700 r/min的速度離心17 min。在第2 個離心步驟之后，棄去上層3/4液體,剩余液體搖勻即得PRP。加入10%CaCl2和25 IU/mL 人血漿凝血酶進行血小板活化，在37 ℃孵育1 h，在4 ℃下持續(xù)16 h。激活的PRP 于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 PRP注射治療大鼠光老化皮膚

紫外燈照射14 周后,大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周后實施干預(yù)。建模大鼠隨機分為2 組,每組6 只，分別為生理鹽水注射組和PRP 注射組(干預(yù)4 周)，正常大鼠(6 只)為對照組。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，在背部照射區(qū)域于真皮層內(nèi)注射1 mL PRP,每只大鼠均勻注射20 個點,每點注射0.5 mL,模型組注射生理鹽水，PRP 治療組注射激活的PRP，正常對照組不注射。

1.2.4 Western bolt法檢測皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達

將紫外線照射背部皮膚提取的蛋白(50 μg)用10% SDS-PAGE 不連續(xù)凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。然后分別加兔抗Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和GAPDH（1∶1000）一抗,4 ℃冰箱孵育過夜。次日加相應(yīng)HRP 偶聯(lián)的羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育2 h。加ECL-Plus 顯色液顯色，使用Bio-Rad 凝膠成像分析儀檢測條帶強度。結(jié)果以檢測蛋白條帶光密度與GAPDH 的光密度比值表示。

1.2.5 皮膚中氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA和SOD的檢測

取紫外線照射背部皮膚提取的蛋白，然后分別使用試劑盒檢測MDA和SOD的水平。具體操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件Graphpad Prism 5進行分析處理，結(jié)果均以來表示，2 組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 外觀變化

紫外燈連續(xù)照射14 周后,模型組大鼠背部皮膚出現(xiàn)深大的靜態(tài)紋和明顯的皮膚脫屑和色素沉著。與模型組相比，PRP 治療組大鼠皮膚外觀明顯改善，表現(xiàn)為皮膚彈性明顯好轉(zhuǎn)，粗大靜態(tài)皺紋減少，無脫屑和明顯色素沉著。

2.2 Western bolt 法檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠背部皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，PRP 治療組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達明顯增加（P＜0.05，圖1）。

圖1 PRP治療對Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

2.3 皮膚中氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA和SOD的變化

與對照組比較，模型組大鼠背部皮膚中SOD 活性明顯降低，MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。PRP 治療能夠顯著提高SOD的活性（P＜0.001），減少MDA的水平（P＜0.001，圖2），抑制氧化應(yīng)激損傷。

圖2 PRP治療對MDA和SOD的影響

3 討論

PRP 是一種從血液中提取的血小板超生理濃度的自體血漿，PRP 中包括800 多種生物活性分子[7]，如活化血小板α顆粒釋放的促分裂和趨化生長因子：血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和上皮生長因子等。這些成分可能通過上調(diào)負(fù)責(zé)細(xì)胞增殖和分化、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)合成的基因來影響組織修復(fù)和其他細(xì)胞事件[5]。血小板濃縮物已用于組織再生[8]。PRP 注射治療老化皮膚也得到了廣泛的應(yīng)用。吳文伯等研究證實PRP 可以改善大鼠光老化皮膚[9]，本實驗也證實了這一結(jié)論。我們用紫外燈照射大鼠14 周建立光老化模型，建模完成后PRP 注射組干預(yù)4 周，從外觀上看，和模型組比較，PRP治療組大鼠皮膚外觀明顯改善，皮膚彈性明顯好轉(zhuǎn)，粗大靜態(tài)皺紋減少，無脫屑和明顯色素沉著。

光老化皮膚在顯微鏡下可觀察到表皮增生、真皮彈性增生、膠原降解和炎癥浸潤等特征[10]。紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷和炎癥損傷已被證實在光老化的發(fā)病機制中起重要作用[11]。一般來說，活性氧水平是由抗氧化劑調(diào)節(jié)的,如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。但是如果氧化/抗氧化系統(tǒng)這個平衡點被紫外線輻射破壞，氧化應(yīng)激會發(fā)生在皮膚深層，導(dǎo)致皮膚細(xì)胞成分的氧化損傷，即可導(dǎo)致光損傷、光老化和光癌發(fā)生[12]。紫外線照射引起的過量活性氧會激活I(lǐng)kB 激酶導(dǎo)致IkB 磷酸化和核因子-B（nuclear factor kappa B,NF-κB）的活化，從而促進多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如白介素10（interleukin10,IL-10）、IL-6、IL-1 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α），促進細(xì)胞壞死和凋亡。同時也會增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，引起皮膚松弛、皺紋和紅斑，從而導(dǎo)致光老化[13]。由于PRP 中含有大量生長因子，在光老化皮膚處注射PRP，可以促進局部成纖維細(xì)胞增殖分化，加快其合成膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的速度，從而改善光老化皮膚[14]。

在本研究中，為了探討PRP 治療光老化皮膚的機制，我們檢測了皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達，并且檢測了反應(yīng)氧化應(yīng)激的兩個重要指標(biāo)MDA含量和SOD 活性。結(jié)果表明，光老化皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達降低，MDA 含量升高，SOD 活性降低。PRP 治療后，氧化應(yīng)激損傷降低，MDA 含量降低，而SOD 活性升高，同時，皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達升高。

綜上所述，PRP 治療可以明顯改善光老化皮膚，促進皮膚中膠原蛋白的合成，其機制可能與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。但是關(guān)于PRP 治療光老化皮膚的確切機制需要進一步進行深入的研究。