小葉楊葉片光合特性與解剖結(jié)構(gòu)對干旱及復(fù)水的響應(yīng)

高鈿惠，尚佳州，宋立婷，王衛(wèi)鋒

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,030801,山西晉中)

干旱是全球范圍內(nèi)樹木死亡的重要原因[1]。隨著全球降雨不均勻性逐漸增大，干旱半干旱地區(qū)的干旱發(fā)生頻率、持續(xù)時(shí)間以及嚴(yán)重程度都將進(jìn)一步增加[2]。楊樹(Populusspp.)是樹木生理學(xué)及分子生物學(xué)研究的模式樹種[3]，其作為三北地區(qū)防護(hù)林主要樹種，在改善生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮重要作用，但由于長期干旱，該地區(qū)的大面積楊樹林形成“小老樹”，甚至死亡[4]。

干旱脅迫作為植物所受逆境脅迫中最重要的非生物因素，嚴(yán)重限制植物的生長發(fā)育及分布[5]。干旱處理下根系合成ABA(abscisic acid)信號并運(yùn)輸至莖和葉器官[6]，進(jìn)而通過一系列結(jié)構(gòu)和生理生化變化以適應(yīng)干旱，如促進(jìn)細(xì)根發(fā)育、增加根冠比、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度以增強(qiáng)根系吸水能力[7]，增厚葉片、關(guān)閉氣孔以減少水分散失[8]。但干旱脅迫也會(huì)誘發(fā)活性氧積累進(jìn)而導(dǎo)致光合色素降解、Rubisco酶活性降低等光合機(jī)構(gòu)破壞[9]。樹木在干旱環(huán)境中的存活不僅體現(xiàn)在干旱過程中的響應(yīng)與適應(yīng)性，干旱解除后復(fù)水期間光合速率等生理指標(biāo)的恢復(fù)能力也很重要[10]。而目前研究多集中在對干旱脅迫的適應(yīng)變化，卻忽略了旱后復(fù)水的恢復(fù)能力[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，植物在適度干旱后復(fù)水會(huì)產(chǎn)生補(bǔ)償效應(yīng)，光合速率提高，生物量積累加快，表明旱后復(fù)水可提高植物生產(chǎn)力[12]。

小葉楊(Populussimonii)具耐旱、耐寒、耐鹽堿等特性，是我國北方重要的鄉(xiāng)土樹種，三北防護(hù)林營造過程中廣泛應(yīng)用。筆者以小葉楊扦插幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，通過盆栽稱量法控制土壤水分，研究干旱及復(fù)水對其生長、氣體交換、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和熒光、葉解剖結(jié)構(gòu)及生物量與非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(non-structural carbohydrate，NSC)的積累與分配的影響，研究結(jié)果有助于闡明干旱環(huán)境下小葉楊的響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制，并可為北方半干旱地區(qū)楊樹人工林可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)地位于山西晉中山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站，E 112°34′44″、N 37°25′47″，海拔796 m，屬暖溫帶大陸性氣候。該地年均溫10.4 ℃，有效積溫3 250～3 500 ℃，無霜期160～190 d，年均降水量397 mm，年均潛在蒸發(fā)量1 765.9 mm。

2 研究方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020年4月1日于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站選用高35 cm、直徑30 cm的塑料桶，每桶裝風(fēng)干過篩土18 kg，桶底鋪2層直徑2～3 cm的石子，石子上覆一層300目的尼龍布使之與土壤隔離。通過插入桶底的硬質(zhì)塑料管澆水，以使土壤均勻吸水而避免板結(jié)。土壤取自林業(yè)站附近地表土，土壤質(zhì)地為砂質(zhì)壤土，其基本理化性質(zhì)為pH 8.29，全氮1.06 g/kg，有效氮48.76 mg/kg，有效磷9.57 mg/kg，速效鉀123.3 mg/kg，有機(jī)質(zhì)14.64 g/kg，全鹽量0.097%，田間持水量26.94%。將小葉楊插條扦插入土壤中，正常供水(土壤含水量為田間持水量的75%±5%)，緩苗2個(gè)月。6月1日選取長勢良好且一致的幼苗30株，隨機(jī)分為3組，對照6株，中度干旱和重度干旱各12株，采用單因素方差分析保證各組間初始株高和地徑無顯著差異；并設(shè)置3個(gè)水分梯度，分別為CK(對照，田間持水量的75%±5%)，MS(中度干旱，田間持水量的50%±5%)、SS(重度干旱，田間持水量的25%±5%)；3個(gè)月后隨機(jī)選取中度干旱和重度干旱各6株，復(fù)水至田間持水量的75%±5%。每日17:00以盆栽稱量法稱量補(bǔ)水。復(fù)水前測定一次氣體交換參數(shù)、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及熒光參數(shù)等指標(biāo)，復(fù)水1月后再次測定氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉片解剖結(jié)構(gòu)等指標(biāo)并收獲植株。

2.2 指標(biāo)測定

葉片氣體交換參數(shù)測定：每處理6株重復(fù)，每株各隨機(jī)選取2片健康功能葉。于晴朗天氣上午10:00～11:00使用便攜式光合儀(Li-6400XT，Li-COR，USA)測定，參數(shù)設(shè)定為葉溫25 ℃，紅藍(lán)光源光強(qiáng)1 500 μmol/(m2·s)，流速500 μmol/s，測定葉片凈光合速率(Pn, μmol/(m2·s))、氣孔導(dǎo)度(Gs, mol/(m2·s))、胞間CO2濃度(Ci, μmol/mol)、大氣CO2濃度(Ca，μmol/mol)和蒸騰速率(Tr, mmol/(m2·s))，并計(jì)算瞬時(shí)水分利用效率(water utilization efficiency, WUE=Pn/Tr, μmol/mmol)和Ci/Ca[5]。

葉綠素a熒光參數(shù)測定：每處理6株重復(fù)，每株各隨機(jī)選取1片健康功能葉，葉片暗適應(yīng)30 min后，用葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2500，德國，WALZ)先測定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)；打開活化光約5 min至熒光值穩(wěn)定后，再測定穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)、最大熒光(F′m)、最小熒光(F′o)；計(jì)算得到光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量(ΦPSⅡ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(non photochemical quenching coefficient, NPQ)、電子傳遞速率(electron transport rate, ETR)。

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：每處理6株重復(fù)，每株各隨機(jī)選取1片健康功能葉，使用乙醇提取比色法測定[13]。

葉片形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)測定：每處理6株重復(fù)，每株各隨機(jī)選取3片健康功能葉用于單葉面積、單葉干質(zhì)量及相對含水量(relative water content, RWC)測定，再選取1片用于葉片解剖及氣孔特性測定。取回葉片先稱量鮮質(zhì)量，然后用掃描儀(DS-50000，EPSON，Japan)掃描圖片并用ImageJ軟件測量單葉面積，讓其吸水至飽和后稱量其飽和質(zhì)量，再于105 ℃殺青1 h 后75 ℃烘至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量，RWC=((鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和質(zhì)量-干質(zhì)量))×100%，比葉質(zhì)量(leaf mass per area, LMA)=葉干質(zhì)量/葉面積。采用指甲油印跡法測定上下表皮氣孔密度與氣孔長度，并于葉片中部切取1 cm×1 cm方塊，F(xiàn)AA固定后采用石蠟切片法，在生物顯微鏡(CX31，日本，Olympus)下拍照并測量葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度等參數(shù)。

器官生物量及NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：分別用卷尺和游標(biāo)卡尺測量株高和地徑。收獲植株后將其分為根、莖、葉3部分并將根系沖洗干凈，105 ℃殺青1 h 后75 ℃烘至恒質(zhì)量并稱量干質(zhì)量，粉碎過200目篩。用苯酚-硫酸法測定NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)[14]。并計(jì)算整株總干質(zhì)量及各器官生物量分配比例。

2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖。用SPSS 13.0的one-way ANOVA中Duncan多重比較(P<0.05)進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 干旱脅迫下小葉楊幼苗光合特性的變化

中度干旱下Pn未顯著下降，而重度干旱下Pn較CK顯著降低了9.00%。Gs、Ci和Tr均隨干旱脅迫的加劇呈下降趨勢，且SS處理下降幅度較大。SS下WUE由于Gs顯著降低導(dǎo)致Tr大幅下降而顯著上升，Ci/Ca由于Gs顯著降低導(dǎo)致Ci下降而顯著降低(圖1)。

MS處理的葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降，而SS處理的葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)則顯著上升(表1)。Fv/Fm、ΦPSⅡ及ETR均隨干旱脅迫程度加劇呈降低趨勢，而NPQ和qP無顯著變化(表2)。

表1 干旱脅迫下小葉楊幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

表2 干旱脅迫下小葉楊幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化Tab.2 Changes of chlorophyll fluorescence parameter in Populus simonii seedlings under drought stress

單葉面積與單葉干質(zhì)量隨干旱脅迫加劇呈下降趨勢，LMA則隨干旱加劇先升后降，而RWC無顯著變化。MS處理下除上表皮氣孔長度顯著增加外，上、下表皮氣孔密度及下表皮氣孔長度均顯著降低；而SS處理上、下表皮氣孔長度均顯著降低且低于CK，氣孔密度均顯著增加且高于CK(表3)。

表3 干旱脅迫下小葉楊幼苗葉片形態(tài)的變化Tab.3 Changes of leaf morphology in Populus simonii seedlings under drought stress

3.2 復(fù)水后小葉楊幼苗光合特性的變化

復(fù)水1月后，MS處理的Pn顯著低于CK，而SS處理的Pn顯著上升且與CK無顯著差異。MS處理下Gs與Tr未明顯下降，Ci與Ci/Ca顯著上升，WUE則顯著降低；而SS處理的Gs、Tr、Ci與Ci/Ca較CK顯著降低，WUE則顯著升高。復(fù)水處理的Pn、Gs與Tr較干旱處理均顯著上升，除RM處理的Pn與CK無顯著差異外，其余均顯著高于CK，且RS處理的Pn較CK增加41.98%。RM處理的Ci、Ci/Ca與WUE較MS處理未發(fā)生顯著變化，而RS處理的Ci較SS顯著升高，WUE則顯著降低(圖2)。

同一小圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。CK(對照，田間持水量的75%±5%)，MS(中度干旱，田間持水量的50%±5%)，SS(重度干旱，田間持水量的25%±5%)。下同。Different letters in the same figure represent significant difference at 0.05 level. CK (control, 75%±5% of field capacity), MS (moderate drought, 50%±5% of field capacity) and SS(severe drought, 25%±5% of field capacity). The same below. 圖1 干旱脅迫下小葉楊幼苗氣體交換參數(shù)的變化Fig.1 Changes of gas exchange parameter in Populus simonii seedlings under drought stress

復(fù)水1月后，MS處理的Fv/Fm、ΦPSⅡ及ETR顯著降低，NPQ顯著升高；而SS處理的Fv/Fm、ΦPSⅡ及ETR則顯著上升，NPQ顯著降低，且SS處理的Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR及NPQ較CK均無顯著差異。但1個(gè)月的復(fù)水處理未對葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生顯著影響(表4)。

表4 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Tab.4 Effects of drought and re-watering on the chlorophyll fluorescence parameter of Populus simonii seedlings

復(fù)水1月后，干旱處理的單葉面積與單葉干質(zhì)量依然隨干旱脅迫加劇呈下降趨勢，而LMA顯著上升。上表皮與柵欄組織厚度隨干旱脅迫加劇呈下降趨勢，MS處理下海綿組織與葉片厚度顯著升高，柵海比與緊密度顯著降低；而SS處理的海綿組織、下表皮及葉片厚度顯著下降且顯著低于CK，柵海比與緊密度顯著升高且顯著高于CK。1個(gè)月的復(fù)水處理未對單葉面積、單葉干質(zhì)量以及LMA產(chǎn)生顯著影響，但復(fù)水處理的上表皮與柵欄組織厚度較干旱處理則顯著上升。RM處理的海綿組織厚度較MS處理顯著降低，柵海比與緊密度顯著升高；而RS處理的海綿組織厚度較SS處理則顯著升高，柵海比與緊密度顯著降低(表5)。

表5 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗葉形態(tài)解剖的影響Tab.5 Effects of drought and re-watering on the leaf morphological anatomy of Populus simonii seedlings

RM(中度干旱后復(fù)水，復(fù)水至田間持水量的75%±5%)，RS(重度干旱后復(fù)水，復(fù)水至田間持水量的75%±5%)，下同。RM (moderate drought followed by re-water，re-watering to 75%±5% of field capacity) and RS (severe drought followed by re-water，re-watering to 75%±5% of field capacity). The same below. 圖2 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗氣體交換參數(shù)的影響Fig.2 Effects of drought and re-watering on the gas exchange parameter of Populus simonii seedlings

3.3 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗生長狀況、干物質(zhì)與NSC積累的影響

干旱脅迫下植株生長受到抑制，株高、地徑、葉片數(shù)以及根、莖、葉干質(zhì)量和單株總干質(zhì)量均隨干旱加劇呈降低趨勢，而根冠比增加。干旱脅迫下，小葉楊株高與地徑生長均受抑制，但MS和SS處理的株高較CK分別下降了34.54%和50.24%，而地徑較CK分別下降了20.24%和31.59%，表明干旱脅迫下小葉楊對縱向生長的抑制強(qiáng)于橫向生長。1個(gè)月的復(fù)水處理未對植株生長及干物質(zhì)積累產(chǎn)生顯著影響(表6)。

表6 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗生長狀況及干物質(zhì)積累的影響Tab.6 Effects of drought and re-watering on growth and dry matter accumulation of Populus simonii seedlings

圖3進(jìn)一步量化干旱及復(fù)水下小葉楊幼苗各器官間生物量分配的變化。根生物量分配比例因干旱脅迫顯著增加，但MS與SS間無顯著差異。莖生物量分配比例顯著降低，葉生物量分配比例無顯著變化。復(fù)水處理較干旱處理無顯著變化(圖3)。

相同條柱不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。Different letters in the same figure and column represent significant difference at 0.05 level. The same below. 圖3 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗根莖葉生物量分配比例的影響Fig.3 Effects of drought and re-watering on biomass distribution percentage of Populus simonii seedlings

干旱脅迫后，小葉楊幼苗各器官可溶性糖與總NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升，莖木材中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。MS處理下，上部葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低而根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高；在SS處理下，上部葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高且高于CK，而根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)則降低且與CK無顯著差異。1個(gè)月的復(fù)水處理未對淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)產(chǎn)生顯著影響，上部功能葉的可溶性糖與總NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較干旱處理則顯著上升，而莖和根中可溶性糖與總NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)則降低(圖4)。

圖4 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗根莖葉NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of drought and re-watering on the content of NSC of Populus simonii seedlings

4 討論

4.1 小葉楊幼苗光合能力對干旱及復(fù)水的響應(yīng)

重度干旱下小葉楊幼苗Gs顯著降低，Pn與Tr下降，WUE顯著升高，表明小葉楊通過關(guān)閉氣孔降低Gs，以犧牲碳固定為代價(jià)，減少水分散失，提高水分利用效率，從而抵御干旱，為典型的節(jié)水型抗旱，這與群眾楊(Populus×popularis‘35-44’)[4]表現(xiàn)相似；同時(shí)，PS Ⅱ反應(yīng)中心開放比例及光合電子傳遞速率下降、光化學(xué)活性減弱也是Pn降低的原因。Pn的降低將導(dǎo)致光能過剩而損傷光合機(jī)構(gòu)，小葉楊則通過NPQ的上升增強(qiáng)熱耗散而保護(hù)光合機(jī)構(gòu)。

隨干旱強(qiáng)度的增加，葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出先降后升的趨勢，且SS處理的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于CK，這與在側(cè)柏(Platycladusorientalis)[15]的研究中相似。MS處理下光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，其一可以防止葉片過量吸收光能，減少光抑制對光合機(jī)構(gòu)的損傷，其二可以減少葉綠素合成中葉片氮素的消耗，將多余的氮素用于Rubisco酶的合成，提高Rubisco酶含量[16]；而SS處理下光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，這可能是由于干旱脅迫導(dǎo)致葉片生長受抑制而產(chǎn)生的濃縮效應(yīng)所致[17]，也可能是由于小葉楊在極端干旱下逐漸適應(yīng)干旱脅迫并做出相應(yīng)生理響應(yīng)，但2種水分條件下響應(yīng)差異的具體分子生理機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

干旱下葉片變小且數(shù)量降低，有利于葉片減少水分消耗和散熱[18]。中度干旱下LMA顯著上升，海綿組織增厚，可增加葉片中水分傳輸阻力與距離；同時(shí)，較厚的海綿組織也可增加葉內(nèi)散射光，減少光量子透射損失，從而提高葉片光能利用率[19]。重度干旱下柵欄組織、海綿組織及葉片總厚度均顯著降低，可能是由于過度水分虧缺導(dǎo)致葉肉細(xì)胞生長受阻，細(xì)胞體積減小。但該處理下LMA卻顯著增加，其原因可能是細(xì)胞壁密度增加[20]，也有可能是細(xì)胞壁增厚。重度干旱下葉片氣孔變小變密有利于減少蒸騰作用并能提高水分利用效率，從而提高幼苗抗旱能力[21]。

復(fù)水未對Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和NPQ產(chǎn)生顯著影響，而顯著增加了Gs與Tr以及Pn，且RS處理的Pn產(chǎn)生了明顯的補(bǔ)償作用，其原因可能是復(fù)水前重度干旱處理的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和柵海比高于正常供水。1個(gè)月的復(fù)水未對單葉面積、單葉干質(zhì)量及LMA產(chǎn)生明顯影響，而促進(jìn)上表皮和柵欄組織生長；復(fù)水后海綿組織厚度趨向于CK，即MS處理海綿組織變厚而在復(fù)水后變薄，SS處理海綿組織變薄而在復(fù)水后變厚。

4.2 干旱及復(fù)水對小葉楊幼苗生長與干物質(zhì)分配的影響

小葉楊幼苗遭受干旱脅迫后株高降低，地徑變細(xì)，葉片變小甚至脫落，各器官生物量積累減小而可溶性糖及總NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有不同程度的增加，表明干旱脅迫下小葉楊通過犧牲植株生長，尤其是地上部生長，從而將更多光合產(chǎn)物以可溶性糖等非結(jié)構(gòu)性碳水化合物形式儲(chǔ)存，一方面，抑制地上部生長可減少水分及同化物消耗，另一方面，較多的NSC儲(chǔ)存有利于植株在干旱等逆境下的生存；同時(shí)，在干旱下小葉楊將更多光合產(chǎn)物投資于根中，有利于根獲取更多的礦質(zhì)營養(yǎng)及水分，這也符合植物的最優(yōu)分配理論[22]。干旱脅迫下，小葉楊莖木材和根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低而可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，一方面有利于提高其莖的栓塞修復(fù)能力，以應(yīng)對干旱脅迫下頻發(fā)的導(dǎo)管栓塞[23]；另一方面增加根中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降低細(xì)胞滲透勢，有利于增強(qiáng)根系的吸水能力[7]。

復(fù)水后小葉楊樹皮和根系中可溶性糖及總NSC濃度降低，這表明小葉楊導(dǎo)管栓塞修復(fù)及形成層恢復(fù)活動(dòng)更多消耗的是樹皮和根系中儲(chǔ)存的可溶性糖[24]。且復(fù)水后小葉楊光合速率顯著增加，光合固碳能力增強(qiáng)，從而提高上部葉的可溶性糖及淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

5 結(jié)論

干旱下小葉楊葉片小而厚、氣孔小而密，以減少蒸騰；根系生物量分配與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，以增強(qiáng)根系吸水，同時(shí)地上部生長降低以減少水分和能量消耗；莖中可溶性糖與總NSC儲(chǔ)量增加，可能有助于提高莖栓塞修復(fù)能力。中度干旱下小葉楊通過葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低、NPQ增加的策略減少光抑制對光合機(jī)構(gòu)的損傷，并通過增厚海綿組織提高葉片光能利用率及儲(chǔ)水能力；而重度干旱下則通過關(guān)閉氣孔降低Gs與Tr，以降低Pn犧牲碳固定為代價(jià)維持葉片水分狀況。重度干旱復(fù)水后小葉楊的葉片光合作用產(chǎn)生了明顯的補(bǔ)償作用，原因可能是重度干旱下葉綠素含量和柵海比增加。復(fù)水后樹皮和根系中的可溶性糖明顯降低。雖然光合速率完全恢復(fù)或超過正常對照，但1個(gè)月內(nèi)整株生物量積累與分配并未發(fā)生顯著變化。