肝癌細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞外囊泡通過(guò)誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-6抑制T細(xì)胞功能①

陳永強(qiáng) 鄭 璐 王 鵬 王 露 張 玥 陳艷紅 周 娟 牛國(guó)平

（徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，徐州 221009）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在消化系統(tǒng)腫瘤中較為常見(jiàn)，其發(fā)生機(jī)制與病毒感染或慢性炎癥等密切相關(guān)，特別是炎癥因子IL-6 與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后關(guān)系密切［1］。研究證實(shí)，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放多種生物活性物質(zhì)誘導(dǎo)微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等發(fā)揮抑制腫瘤特異性T 細(xì)胞功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸［2-5］。其中，腫瘤來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由腫瘤細(xì)胞釋放入外周循環(huán)的囊泡，因其富含各種蛋白配體、脂質(zhì)和非編碼RNAs 等活性物質(zhì)參與誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成［2-6］。因此，本研究旨在探討肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 體外對(duì)外周血中單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中T 細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制，為今后臨床肝癌免疫治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和臨床標(biāo)本來(lái)源 C57BL/6小鼠，雌性6～8 周齡，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；IL-6敲除的C57BL/6 小鼠由蘇州大學(xué)張進(jìn)平教授惠贈(zèng)；人肝癌患者外周血和胸腹水標(biāo)本來(lái)源于徐州市中心醫(yī)院，該研究通過(guò)徐州市中心醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)的審查（XZXY-LJ-20200521-018）。

1.1.2 主要試劑和儀器 小鼠和人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自杭州聯(lián)科生物（70-MLSM1092、70-LSM02）；小鼠和人IL-2（200-02、212-12）、CD3 Monoclonal Antibody（05121-20、05122-20）和CD28 Monoclonal Antibody（10311-20、10312-20）購(gòu)自PeproTech 公司；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基（8120133，8120124）購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清（11011-8611）購(gòu)自浙江天杭生物公司；Anti-mouse CD4-APC（100516）、Anti-mouse CD8-FITC（100706）、Anti-mouse IFN-γ-PE（505808）、Anti-human CD4-APC（300514）、Anti-human CD8-APC（301014）、Anti-human IFN-γ-PE（502509）和小鼠IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒（431304）購(gòu)自Biolegend 公司；人IL-6 和IFN-γ 細(xì)胞因子流式熒光微球檢測(cè)試劑盒（20180013）購(gòu)自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司；人IL-6中和抗體購(gòu)自R&D公司（AF-206-NA）；細(xì)胞固定破膜劑（555414）、細(xì)胞因子刺激劑阻斷劑（550583）、流式細(xì)胞儀（FACS Calibur）均購(gòu)自BD 公司；粒徑分析儀（Zetasizer Pro）購(gòu)自Malvern PANalytical 公司；透射電子顯微鏡（JEM-1011）購(gòu)自JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞來(lái)源EVs 的提取與粒徑分析 小鼠腫瘤細(xì)胞株（Hepa1-6、EL4、B16F10 和LLC）和人肝癌細(xì)胞株（HepG2、HuH-7和Hep3B）均采用DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集上述腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，1 000 g 離心10 min 去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，然后將上清于12 000 g、4℃條件下離心30 min，隨后用PBS 將沉淀物洗滌2 次后即為腫瘤細(xì)胞來(lái)源的EVs。將小鼠肝癌Hepa1-6 和人肝癌HepG2 細(xì)胞株來(lái)源的EVs 重懸于PBS 中，采用粒徑分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析；將兩株細(xì)胞來(lái)源的EVs 高速離心使其壓縮緊密，棄上清后，經(jīng)固定、包埋、切片和染色后，采用透射電鏡進(jìn)行觀(guān)察拍照。

1.2.2 小鼠和人PBMCs 的分離 無(wú)菌條件下取C57BL/6小鼠肝素抗凝外周血和健康人肝素抗凝外周血，分別采用小鼠和人外周血淋巴細(xì)胞分離液按照操作說(shuō)明進(jìn)行分離，獲得小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（mPBMCs）和人外周血單個(gè)核細(xì)胞（hPBMCs）。

1.2.3 檢測(cè)小鼠腫瘤細(xì)胞來(lái)源EVs 對(duì)mPBMCs 分泌IL-6 及T 細(xì)胞分泌IFN-γ 的影響 將方法1.2.2中分離獲得的mPBMCs 重懸于含有小鼠重組IL-2、抗CD3 抗體、抗CD28 抗體和胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)基中，分別加入24 孔板中，1×106個(gè)/（ml·孔），然后加入不同濃度的EVs（0、1、3和10 μg/ml），培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并按照小鼠IL-6 ELISA 檢測(cè)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組IL-6 的分泌水平；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ 的比例，具體檢測(cè)步驟：收集細(xì)胞前5 h 加入細(xì)胞因子刺激阻斷劑2 μl/ml，細(xì)胞用PBS 洗滌1 次，每管細(xì)胞加入2 μl 的CD4-APC 和anti-mouse CD8-FITC 室溫染色20 min 后，用PBS 洗滌1 次，渦旋重懸細(xì)胞后加入250 μl 的細(xì)胞固定-破膜劑進(jìn)行固定破膜20 min，PBS 洗滌1 次后加入2 μl 的anti-mouse IFN-γ-PE 室溫染色30 min，PBS 洗滌1 次，重懸于0.5 ml 的PBS中。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 檢測(cè)人肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs 對(duì)hPBMCs 分泌IL-6 及T 細(xì)胞分泌IFN-γ 的影響 將方法1.2.2 中分離獲得的hPBMCs重懸于含有人重組IL-2、抗CD3抗體、抗CD28 抗體和胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)基中，分別加入24 孔板中，2×106個(gè)/（ml·孔），然后加入3 μg/ml 的肝癌細(xì)胞株和肝癌患者腹水來(lái)源的EVs 或聯(lián)合加入50 ng/ml 的IL-6 中和抗體，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 和IFN-γ 的分泌水平，具體檢測(cè)步驟：首先向流式管中分別依次加入25 μl 的實(shí)驗(yàn)緩沖液、捕獲微球抗體、每組細(xì)胞培養(yǎng)上清標(biāo)本和檢測(cè)抗體，室溫避光振蕩孵育2 h，向所有管中加入25 μl SA-PE，繼續(xù)室溫避光振蕩孵育0.5 h，然后每管中加入500 μl 1×洗滌緩沖液，渦旋數(shù)秒，500 g 離心5 min，緩慢傾倒出液體，再向每管中加入200 μl洗滌緩沖液，渦旋10 s將微球重懸，立即上機(jī)檢測(cè)；而IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例檢測(cè)方法參照方法1.2.3，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用One-Way ANOVA 和Tukey-Kramer 檢驗(yàn)；兩組間比較使用非配對(duì)Student'st檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs粒徑分析 采用粒徑分析儀檢測(cè)分析小鼠肝癌Hepa1-6和人肝癌HepG2細(xì)胞株來(lái)源的EVs，結(jié)果顯示：小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞株來(lái)源的EVs 直徑主要分布于150～1 000 nm 之間，平均直徑為（250.5±60.85）nm（圖1A、C）；而人肝癌HepG2細(xì)胞株來(lái)源的EVs直徑也主要分布于150～1 000 nm之間，平均直徑為（301.6±84.92）nm（圖1B、D）。

圖1 肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs粒徑分析和形態(tài)觀(guān)察Fig.1 Particle size distribution and morphological observation ofisolated EVs from hepatocellular carcinoma cells

2.2 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ 檢測(cè)T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平是評(píng)估其功能的重要指標(biāo)。mPBMCs 經(jīng)不同濃度的小鼠肝癌Hepa1-6 細(xì)胞來(lái)源的EVs（0、1、3、10 μg/ml）誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著EVs濃度增加，IFN-γ+CD4+T 細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞的比例均顯著低于對(duì)照組（圖2）。提示：小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞來(lái)源的EVs 體外可顯著抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ的功能。

圖2 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響Fig.2 Effect of EVs derived from mouse hepatocarcinoma cells on IFN-γ secretion by effector T cells

2.3 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 誘導(dǎo)mPBMCs 分泌IL-6 將不同濃度的小鼠肝癌Hepa1-6 細(xì)胞來(lái)源的EVs（0、1、3、10 μg/ml）分別與mPBMCs 共培養(yǎng)72 h后，ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，1 μg/ml 的EVs 即可顯著誘導(dǎo)IL-6分泌，隨著EVs濃度的增加，IL-6的分泌量也顯著增高（圖3A）。另外，小鼠B16F10、EL4 和LLC 細(xì)胞來(lái)源的EVs 均可顯著誘導(dǎo)mPBMCs 分泌IL-6，其中Hepa1-6細(xì)胞來(lái)源的EVs誘導(dǎo)IL-6的分泌量最高（圖3B）。300 μl的小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)上清（culture media，CM）以及等體積培養(yǎng)上清高速離心獲得的EVs 可以顯著促進(jìn)mPBMCs 分泌IL-6，而300 μl 通過(guò)高速離心去除EVs 的培養(yǎng)上清（EVs-depleted CM）誘導(dǎo)mPBMCs分泌IL-6的量顯著降低（圖3C）。以上結(jié)果提示：小鼠肝癌Hepa1-6 細(xì)胞來(lái)源的EVs 是誘導(dǎo)mPBMCs 分泌IL-6 的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖3 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs誘導(dǎo)mPBMCs分泌IL-6Fig.3 Mouse hepatocellular carcinoma cell-derived EVs induce mPBMCs to secrete IL-6

2.4 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 通過(guò)誘導(dǎo)PBMCs 分泌IL-6 抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ 為了證明小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ 是否通過(guò)IL-6，將3 μg/ml 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 分別與野生型（wild type，WT）mPBMCs和IL-6敲除（knock out，KO）mPBMCs共培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：小鼠肝癌Hepa1-6 細(xì)胞來(lái)源的EVs 可顯著抑制WT mPBMCs 中CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ；而在IL-6 KO 的mPBMCs 中，小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ無(wú)抑制作用，相反可以顯著促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞分泌IFN-γ（圖4）。以上結(jié)果提示：小鼠肝癌Hepa1-6 細(xì)胞來(lái)源的EVs主要通過(guò)誘導(dǎo)mPBMCs 分泌IL-6 發(fā)揮抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ的作用。

圖4 小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs通過(guò)誘導(dǎo)PBMCs分泌IL-6發(fā)揮抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ的作用Fig.4 Mouse hepatocellular carcinoma cell-derived EVs can effectively inhibit T-cell IFN-γ secretion via IL-6 secreted by PBMCs

2.5 人肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs 通過(guò)誘導(dǎo)hPBMCs 分泌IL-6 抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ 為進(jìn)一步證明上述結(jié)果，首先檢測(cè)發(fā)現(xiàn)12 例臨床原發(fā)性肝癌患者（liver cancer patients，LCPs）外周血中IL-6 水平顯著高于健康志愿者（healthy donors，HDs）（圖5A）。隨后，將從3 株人肝癌細(xì)胞（HepG2、HuH7 和Hep3B）培養(yǎng)上清中分離的EVs（LCC-EVs）和5 例肝癌腹水中分離的EVs（LCA-EVs）分別與hPBMCs 共培養(yǎng)72 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：LCC-EVs 和LCA-EVs 均可顯著誘導(dǎo)IL-6 的分泌和抑制IFN-γ 的分泌（圖5B～D）；當(dāng)上述LLC 和LCA 來(lái)源的EVs 分別聯(lián)合加入IL-6 中和抗體（αIL-6）時(shí)，EVs 抑制的IFN-γ 又顯著恢復(fù)（圖5C、D）。提示：人肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs也通過(guò)誘導(dǎo)hPBMCs 分泌IL-6 發(fā)揮抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ的作用。

圖5 人肝癌細(xì)胞來(lái)源EVs 通過(guò)誘導(dǎo)分泌IL-6 發(fā)揮抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ的作用Fig.5 Human hepatocellular carcinoma cell-derived EVs can inhibit T-cell IFN-γ secretion via IL-6

3 討論

EVs 主要由直徑30～150 nm 的外泌體和150～1 000 nm 的微泡組成，是細(xì)胞間重要的信號(hào)傳遞媒介［7］。本研究通過(guò)差速離心獲得肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 粒徑主要分布于150～1 000 nm 之間。文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)HSP72/TLR2-MyD88 誘導(dǎo)MDSCs 分泌IL-6 繼而活化stat3 信號(hào)通路增強(qiáng)其免疫抑制功能［8］；同時(shí)，腫瘤來(lái)源外泌體通過(guò)膜分子HSP72/HSP105 與TLR2/4 相互作用誘導(dǎo)DC 分泌IL-6 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌MMP-9 實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［9］。而最新研究發(fā)現(xiàn)，外泌體膜表面PD-L1與PD-1相互作用直接發(fā)揮抑制T 細(xì)胞的功能［4，10］。與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，本研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 體外可以誘導(dǎo)PBMCs 分泌高水平的IL-6，同時(shí)也可以顯著抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ。

文獻(xiàn)報(bào)道IL-6 是一種多效性的細(xì)胞因子，不僅可以促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，也可以發(fā)揮抗炎作用［11］。在促炎方面，IL-6 主要通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2 和抑制Fas/FasL 的表達(dá)促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞的存活和增殖［12］。與之相反，在抑制炎癥反應(yīng)方面，主要通過(guò)抑制Th1 細(xì)胞的分化及CD8+T 細(xì)胞的功能［13-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 可以誘導(dǎo)野生型小鼠PBMCs 分泌IL-6 并抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ，而在IL-6 缺陷的小鼠PBMCs 中，EVs 對(duì)CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ 無(wú)影響，相反可以促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Th1 方向分化；而在人PBMCs 中，當(dāng)聯(lián)合加入IL-6 中和抗體后，可顯著恢復(fù)人肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 對(duì)T 細(xì)胞分泌IFN-γ 的抑制作用。結(jié)果說(shuō)明，肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 體外主要通過(guò)誘導(dǎo)分泌IL-6發(fā)揮抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ的功能。

綜上，本研究證明小鼠和人肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs 粒徑主要分布于150～1 000 nm 之間，體外主要通過(guò)誘導(dǎo)分泌IL-6 發(fā)揮抑制T 細(xì)胞分泌IFN-γ 的功能，該研究結(jié)果為后期臨床肝癌患者聯(lián)合IL-6 中和抗體治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，關(guān)于肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs攜帶何種關(guān)鍵功能分子及其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。