芥子堿對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及機制研究①

高 遠 李 冀 韓東衛(wèi)（黑龍江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，哈爾濱 150040）

肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是主要的致死性惡性腫瘤之一。根據(jù)組織病理學特征，肝癌可分為：肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌以及混合型肝癌等類型，其中肝細胞癌最為常見，占肝癌總數(shù)的90%以上［1］。流行病學調(diào)查顯示，2018 年全球范圍內(nèi)肝癌發(fā)病人數(shù)占惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的4.7%，死亡人數(shù)占腫瘤致死的8.2%，我國肝癌新發(fā)患者占全球肝癌新發(fā)患者的45%，同時，因肝癌致死的患者占全球的43%，且其發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)還在逐年增加［2-3］。目前臨床上對于肝癌患者主要采取手術(shù)、介入、放療、化療及分子靶向治療等手段。早期患者以手術(shù)治療為主，但肝癌發(fā)病隱匿、進展快，同時又缺乏早期診斷手段，大部分患者確診時已經(jīng)處于中晚期，失去手術(shù)治療機會，化療和分子靶向治療是其主要治療手段，而化療藥在殺傷腫瘤細胞的同時，會不可避免地損傷正常細胞，且長期使用化療會使腫瘤細胞出現(xiàn)耐藥性，導致藥效降低［4-5］。因此，探尋低毒、有效的化療藥物或輔助藥物降低化療藥物毒性、提高藥效是當前臨床醫(yī)生關(guān)注的重點。

芥子堿（sinapine）是一種季銨鹽生物堿，廣泛存在于油菜、芥菜等十字花科植物中，既往研究表明，芥子堿具有一定的抗腫瘤作用，但其在肝癌中的作用報道較少［6-8］。本研究通過細胞實驗和裸鼠皮下荷瘤動物實驗，借助高通量測序等手段，初步探究芥子堿抗肝癌作用及其可能的作用機制，為后續(xù)進行化療藥物增敏實驗及臨床上作為肝癌患者的輔助性治療藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 HepG2 人肝癌細胞系和LO2 人正常肝細胞系購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶和1%青、鏈霉素雙抗購自武漢賽維爾生物科技公司；芥子堿購自上海源葉生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）和細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗p53（#2527）、p21（#2947）、GAPDH（#5174）、Bax（#5023）和Bcl-2（#4223）單克隆抗體均購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2 人肝癌細胞和LO2 人正常肝細胞用DMEM 完全培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2）常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，待培養(yǎng)瓶中細胞匯合度達90%后鋪板進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞活力檢測 將HepG2 細胞按照1×104個/孔均勻接種于96 孔板，待細胞貼壁后，用不同濃度的芥子堿（0、25、50、100、200 和500 μmol/L）處理24 h 和48 h。在相應(yīng)時間點，加入10 μl CCK-8試劑，空白組中加入100 μl 含10%CCK-8 試劑的培養(yǎng)基，37℃避光孵育1 h 后，檢測各孔吸光度值（A450）。細胞活力（%）=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.3 細胞凋亡率檢測 將HepG2 細胞均勻接種于6 孔板，待細胞匯合度達60%～70%后，換液并加入含有芥子堿的培養(yǎng)基，調(diào)整各孔中芥子堿濃度依次為0、25、50、100 μmol/L，24 h后收集細胞（保留上清液中的細胞），用500 μl結(jié)合緩沖液重懸后依次加入5μl Annexin V/FITC 和5 μl PI，室溫下避光孵育20 min，隨即用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 用芥子堿（0、50 μmol/L）處理HepG2 細胞24 h 后，RIPA 提取總蛋白，BCA 法常規(guī)定量后調(diào)整蛋白濃度為2 μg/μl，取20 μg 總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)膜、封閉后，將PVDF 膜置于相應(yīng)一抗（稀釋比為1∶1 000）中在4℃冰箱孵育過夜，用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h后，ECL試劑盒顯影，隨后進行曝光分析。

1.2.5 RNA-Seq 測序分析 收集50 μmol/L 芥子堿處理24 h后的肝癌細胞和對照組細胞，采用Trizol法提取總RNA，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行RNA-Seq 測序分析，使用R 軟件進行差異基因篩選，認為符合|log2Fold Change|＞1 且P-value＜0.05的基因為差異基因，使用GSEA 4.0.4軟件進行基因集富集分析。

1.2.6 裸鼠成瘤實驗 新購裸鼠待適應(yīng)環(huán)境后，隨機分為對照組和實驗組。將HepG2 細胞接種在裸鼠背部皮下，接種量約為5×106個/只，接種后隔天觀察，1 周后開始腹腔注射，實驗組裸鼠注射芥子堿（2 mg/kg），對照組裸鼠注射同等體積的DMSO。每隔3 d 用卡尺測量皮下腫瘤的長、短徑，4 周后處死裸鼠，瘤體組織液氮凍存用于后續(xù)實驗。皮下瘤的體積=瘤體長徑×瘤體短徑2/2。

1.3 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS20.0 軟件和R3.6.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組或多組間比較使用t檢驗或方差分析。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芥子堿對肝癌HepG2 細胞活力的影響 隨著芥子堿藥物濃度的增加和作用時間的延長，HepG2細胞活力顯著降低；芥子堿對LO2 細胞活力影響較小，表明芥子堿能時間和濃度依賴地抑制HepG2 細胞活力。見圖1。

圖1 芥子堿對LO2和HepG2細胞活力的影響Fig.1 Effect of sinapine on cell viability of LO2 and HepG2 cells

2.2 芥子堿對肝癌HepG2 細胞凋亡的影響 采用PI和Annexin V/FITC熒光染料結(jié)合流式細胞術(shù)檢測芥子堿對肝癌HepG2 細胞凋亡的影響。結(jié)果表明，芥子堿能誘導HepG2 細胞凋亡，且隨著芥子堿藥物濃度的增加，細胞凋亡率顯著提高。見圖2。

圖2 芥子堿誘導HepG2細胞凋亡Fig.2 Sinapine induced apoptosis of HepG2 cells

2.3 芥子堿對肝癌HepG2 細胞p53 信號通路的影響 芥子堿處理后，HepG2 細胞中有869 個基因表達水平發(fā)生改變，其中334 個基因表達水平上調(diào)，535 個基因表達水平下調(diào)（圖3A）；對基因表達矩陣進行基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，p53 信號通路顯著富集（圖3B、C）。因此，本研究進一步檢測芥子堿（50 μmol/L）對HepG2 細胞中p53、p21 及其下游凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的影響。Western blot 結(jié)果表明，芥子堿處理后，HepG2 細胞中p53、p21 及Bax 蛋白水平顯著增加，Bcl-2 蛋白水平顯著降低（圖3D、E）。

圖3 芥子堿對肝癌HepG2細胞p53信號通路的影響Fig.3 Effect of sinapine on p53 signal pathway of HepG2 cells

2.4 敲低p53 基因阻遏芥子堿對細胞活力和凋亡的影響 為進一步驗證p53信號通路在芥子堿影響HepG2 細胞活力和凋亡中的作用，本研究設(shè)計p53特異性siRNA，由圖4 可知，p53 特異性siRNA 能顯著敲低p53 蛋白水平（圖4A、B）。CCK-8 結(jié)果表明，敲低p53 能減輕芥子堿（50 μmol/L）對HepG2 肝癌細胞活力的抑制作用（圖4C），且敲低p53 能減緩芥子堿（50 μmol/L）誘導的細胞凋亡（圖4D）。以上結(jié)果表明，芥子堿通過激活p53 信號通路抑制HepG2細胞活力、誘導細胞凋亡。

圖4 敲低p53基因阻遏芥子堿對細胞活力和凋亡的影響Fig.4 Knockdown of p53 suppresses the effect of sinapine on cell viability and apoptosis

2.5 芥子堿對裸鼠皮下腫瘤生長的影響 為進一步驗證芥子堿在體抗肝癌作用，本研究通過皮下接種肝癌HepG2 細胞，構(gòu)建裸鼠皮下腫瘤模型，接種1 周后通過腹腔注射芥子堿，定期監(jiān)測皮下腫瘤的生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芥子堿能顯著抑制裸鼠皮下腫瘤的生長（圖5A）；對腫瘤組織進行蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理的肝癌組織中p53、p21 及Bax 水平顯著升高，Bcl-2 表達水平顯著降低（圖5B、C），進一步說明芥子堿可能通過激活肝癌細胞中p53信號通路從而發(fā)揮對肝癌的抑制作用。

圖5 芥子堿對在體腫瘤生長及腫瘤組織中p53信號通路的影響Fig.5 Effect of sinapine on tumor growth in vivo and p53 signaling pathway in tumor tissues

3 討論

芥子堿作為一種來源廣泛的天然中藥材，具有多種藥理學作用，包括抑制新生血管生成、抗炎、抗氧化、降低血壓、平喘等，其副作用較小，但大量服用可能引起惡心、嘔吐等胃腸道刺激反應(yīng)［9-11］。目前，關(guān)于芥子堿的抗腫瘤活性也有相關(guān)報道。GUO等［7］研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿可通過抑制P-gp（P-glycoprotein）蛋白的表達從而發(fā)揮對結(jié)腸癌Caco-2 細胞的抑制作用；GUO 等［8］研究表明，芥子堿可通過下調(diào)ERK1/2-NF-κB 信號通路活性逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7 細胞對阿霉素的抵抗，這些研究提示芥子堿能在體外抑制腫瘤細胞，同時可能作為潛在的輔助化療藥物。因此，本研究基于芥子堿的抗腫瘤活性，研究芥子堿對肝癌HepG2 細胞活力、凋亡及在體腫瘤生長的影響，并借助RNA 測序和生物信息學分析，初步探究其作用機制。

本研究使用不同濃度的芥子堿處理肝癌HepG2 細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芥子堿能抑制肝癌HepG2 細胞活力，并表現(xiàn)出時間和濃度依賴。同時，裸鼠荷瘤實驗也表明，芥子堿能抑制裸鼠皮下腫瘤的生長，說明芥子堿能在體內(nèi)、體外發(fā)揮抗肝癌作用。誘導細胞凋亡是藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的常見機制，因此，本研究檢測芥子堿對肝癌HepG2 細胞凋亡的影響。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，HepG2 細胞凋亡率顯著升高，表明芥子堿能誘導肝癌細胞凋亡。為進一步探究芥子堿抗肝癌的作用機制，本研究借助RNA-Seq 測序手段，對芥子堿處理后改變的基因進行大規(guī)模篩選，以便明確其可能影響的生物學過程和信號通路。分析基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理后，HepG2 細胞中有869 個基因表達水平發(fā)生改變，同時對基因表達矩陣進行基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，p53 信號通路顯著富集，表明p53 信號通路可能在芥子堿誘導的腫瘤細胞凋亡和細胞活力降低過程中具有重要作用。

p53 作為經(jīng)典的抑癌基因，在各種類型腫瘤中的作用被廣泛報道，其本身可作為細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，啟動下游如p21、Gadd45、Bax 等靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、周期、凋亡及DNA 損傷等生物學過程［12-13］；同時，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化及棕櫚酰化等各種轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控，參與調(diào)控使得生物學過程更為復雜，且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理后，肝癌細胞和肝癌樣本中p53、p21 及Bax蛋白水平顯著增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低，說明芥子堿處理能引起p53信號通路的激活。為進一步明確p53信號通路的激活在芥子堿誘導的細胞凋亡和細胞活力下降中的作用，本研究檢測在p53 敲低的細胞中，芥子堿對細胞活力和細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)敲低p53 能部分阻遏芥子堿誘導的細胞凋亡和細胞活力下降，進一步表明芥子堿通過激活p53 信號通路發(fā)揮抗肝癌作用，同時，由于敲低p53只能部分阻遏芥子堿對肝癌細胞的作用，說明其他生物學過程或信號通路可能也發(fā)揮一定作用，這有待后續(xù)進一步探索。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理能引起p21蛋白水平上調(diào)，p21作為參與細胞周期調(diào)控的重要負性調(diào)控蛋白，通過抑制CDK（cyclin dependent kinase）家族蛋白活性，影響細胞周期進程［16］，因此，芥子堿也可能通過誘導細胞周期阻滯從而發(fā)揮抗肝癌作用。不過，本研究尚未深入探究芥子堿激活p53 信號通路的具體機制，這有待后續(xù)進一步探索。

綜上所述，芥子堿可通過激活p53 信號通路在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗肝癌作用，后續(xù)應(yīng)進一步深入探究芥子堿能否與化療藥物配伍使用及其對化療藥物藥效的影響，以期為芥子堿用于臨床肝癌患者的治療提供基礎(chǔ)。