高地鉤葉藤材薄壁細(xì)胞壁主要化學(xué)成分的微區(qū)分布1)

張菲菲 何偉 汪佑宏 馬建鋒

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥，230036) (國(guó)際竹藤中心)

棕櫚藤為棕櫚科(Palmae)省藤亞科(Calamoideae)類植物，天然分布于東半球的熱帶地區(qū)及鄰近區(qū)域。世界棕櫚藤總共有13個(gè)屬600～700種，其中我國(guó)自然分布有4屬(黃藤屬、省藤屬、鉤葉藤屬和多鱗藤屬)37種5變種，但有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的不到20種[1]。藤莖俗稱藤條，成熟后呈奶黃、乳白等顏色，除基部外被帶刺葉鞘所覆蓋；長(zhǎng)度從幾米至百余米、直徑從約3～80 mm甚至100 mm不等。藤條為僅次于木竹材的、具有多種用途的重要林產(chǎn)品，被廣泛用于制造桌、椅、沙發(fā)、床等藤制家具，以及各種藤編小飾品等，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。

棕櫚藤藤莖主要有維管束及環(huán)繞四周的薄壁組織構(gòu)成，而薄壁細(xì)胞的大量存在，賦予了棕櫚藤藤莖優(yōu)良的柔韌性[2-3]，有利于棕櫚藤的彎曲加工和編織利用。而目前，關(guān)于棕櫚藤的研究報(bào)道多見(jiàn)解剖構(gòu)造特征[4-5]，宏觀物理力學(xué)性質(zhì)[6-8]及化學(xué)性質(zhì)方面[7，9]。當(dāng)然，對(duì)棕櫚藤材細(xì)胞壁木質(zhì)素的微區(qū)分布也略有研究，如運(yùn)用可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)黃藤材導(dǎo)管分子[10]、纖維[11]及薄壁細(xì)胞[12]等細(xì)胞壁的木質(zhì)素微區(qū)分布進(jìn)行了探索。此外，劉杏娥等[13]結(jié)合共聚焦顯微熒光和拉曼光譜成像技術(shù)系統(tǒng)，對(duì)黃藤材藤莖中不同類型細(xì)胞以及同一細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域的木質(zhì)素化學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了分析。

就棕櫚藤材而言，關(guān)于薄壁組織細(xì)胞壁主要成分的微區(qū)分布尚未見(jiàn)報(bào)道。為構(gòu)建棕櫚藤材薄壁細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模型、加大棕櫚藤材的用途和使用率，對(duì)棕櫚藤材薄壁細(xì)胞壁主要成分的微區(qū)分布進(jìn)行研究，還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

1 材料與方法

高地鉤葉藤(PlectocomiahimalayanaGriff.)屬鉤葉藤屬，主要分布于我國(guó)云南西部、南部地區(qū)海拔1 450～1 800 m的竹林、山地常綠闊葉林中，大徑、攀援、叢生，一般僅用于編織較粗糙的藤器或扎欄[14]。

取生長(zhǎng)適中、健康的高地鉤葉藤1根，在距地面2 m處截取高約1 cm的試樣，軟化包埋處理后，用旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切取厚10 μm的完好的橫切面切片5片左右，室溫下用0.2 mol·L-1NaBH4溶液浸泡5～6 h，然后用蒸餾水洗凈并浸泡在蒸餾水中備用。LabRam XploRA顯微共聚焦拉曼光譜儀，KD1508A型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)等。

將存放在蒸餾水中的切片取出1片，固定在載玻片上，置于拉曼顯微鏡下，分別在藤皮、藤中及藤芯處各選擇1個(gè)完整的薄壁細(xì)胞、每個(gè)細(xì)胞壁上選擇至少3個(gè)點(diǎn)，利用LabRam XploRA顯微共聚焦拉曼光譜儀，采用逐點(diǎn)掃描顯微探針成像方法獲取光譜數(shù)據(jù)集，再利用LabSpec5軟件進(jìn)行處理。其中掃描步長(zhǎng)為0.8 μm，激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm，功率8 mW，單點(diǎn)采集時(shí)間1 s，狹縫寬度100 μm，孔隙大小為300 μm，拉曼光譜測(cè)試范圍為250～3 200 cm-1。為獲得較高的空間分辨率，采用了100倍油鏡(MPlan 100×，oil，NA=1.35)，計(jì)算機(jī)控制平臺(tái)的同步移動(dòng)、對(duì)3個(gè)薄壁細(xì)胞至少9個(gè)點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和數(shù)據(jù)處理。

高地鉤葉藤薄壁細(xì)胞次生壁一般3～7層，壁層厚度285～900 nm，層與層之間有空隙。試驗(yàn)中薄壁細(xì)胞次生壁為7層，依據(jù)壁層厚度、拉曼光斑大小及掃描步長(zhǎng)等因素，由外向里將薄壁細(xì)胞次生壁依次分成SⅠ(1～2層)、SⅡ(3～5層)和SⅢ(6～7層)3部分進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄壁細(xì)胞纖維素與木質(zhì)素的微區(qū)分布線譜

圖1為薄壁細(xì)胞SⅡ(次生壁中部)的平均拉曼光譜，其中纖維素的主要特征峰為2 890、1 324、1 114、1 090和378 cm-1；木質(zhì)素的主要特征峰為1 680和1 601 cm-1。拉曼位移2 890 cm-1歸屬于纖維素C—H和CH2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 601 cm-1是苯環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，378 cm-1歸屬于纖維素β—D葡萄糖甘鍵。拉曼位移1 680 cm-1歸屬于松柏醇或紫丁香醇和松柏醛或紫丁香醛結(jié)構(gòu)，1 601 cm-1歸屬于苯環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)。拉曼位移1 090 cm-1是重原子(CC和CO)的伸縮振動(dòng)(見(jiàn)表1)。

圖1 薄壁細(xì)胞壁SⅡ?qū)悠骄庾V

表1 薄壁細(xì)胞壁SⅡ?qū)又饕M分的平均拉曼光譜分布[18-19]

圖2(a)為薄壁細(xì)胞壁5個(gè)不同形態(tài)區(qū)，即細(xì)胞角隅處(CC)，復(fù)合胞間層(CML)，次生壁外部(SⅠ)，次生壁中部(SⅡ)及次生壁內(nèi)部(SⅢ)的平均光譜圖，線譜范圍為900～3 200 cm-1。從圖中可以看出CC中2 937 cm-1特征峰的信號(hào)很強(qiáng)，而2 890 cm-1處的信號(hào)幾乎被其覆蓋，CC形態(tài)區(qū)拉曼信號(hào)譜圖整個(gè)基線遠(yuǎn)高于其他形態(tài)區(qū)。CML、SⅠ、SⅡ和SⅢ處2 937 cm-1特征峰的信號(hào)均比2 890 cm-1處信號(hào)強(qiáng)。

圖2(a)經(jīng)譜線分析處理得到圖2(b)和圖2(c)。圖2(b)比較了CC、CML和SⅡ3個(gè)形態(tài)區(qū)的拉曼光譜，從中可以看出2 890 cm-1特征峰處的拉曼強(qiáng)度為CC處最小，說(shuō)明CC處纖維素的集團(tuán)數(shù)量比最低；CML與SⅡ處在2 890 cm-1特征峰處的拉曼強(qiáng)度沒(méi)有差別。另一特征峰1 601 cm-1處的拉曼強(qiáng)度由大到小為CC、CML、SⅡ，說(shuō)明木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比又大到小為CC、CML、SⅡ，這與Cybulska J et al.[15]對(duì)蘋(píng)果組織研究的結(jié)果完全一致，與劉杏娥等[13]、汪佑宏等[11]研究的黃藤材纖維細(xì)胞壁及薄壁細(xì)胞壁[12]上木質(zhì)素的分布也相似，單就細(xì)胞角隅處木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比最高的觀點(diǎn)而言，與Richter S et al.[16]及Sun L et al.[17]的觀點(diǎn)也是相同的。

圖2(c)比較了SⅠ、SⅡ和SⅢ3個(gè)形態(tài)區(qū)的拉曼光譜，從中可以看出3個(gè)形態(tài)區(qū)在2 890 cm-1特征峰和1 601 cm-1特征峰兩處的拉曼強(qiáng)度均差別不大，說(shuō)明這3個(gè)形態(tài)區(qū)纖維素的集團(tuán)數(shù)量比與木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比區(qū)別較小。而黃藤材導(dǎo)管分子細(xì)胞次生壁上木質(zhì)素由外向內(nèi)呈“S型”分布，但差異不大[10]；原因可能是由于薄壁細(xì)胞次生壁太薄，拉曼光斑直徑大于次生壁各壁層厚度，導(dǎo)致細(xì)胞壁層間信號(hào)重合，以及壁層間存在空隙共同所致。

2.2 薄壁細(xì)胞拉曼成像

在顯微鏡下的試材橫切面上，選擇適合的薄壁細(xì)胞進(jìn)行拉曼掃描并成像。由于纖維素的拉曼光譜信噪比在2 890 cm-1處最大，能夠得到較清晰的分布圖像，而木質(zhì)素的主要特征峰在1 601 cm-1處具有較好的信噪比，因此本研究選擇在2 780～3 060 cm-1(用C—H以及C—H2伸縮振動(dòng)的空間分布規(guī)律來(lái)代表薄壁細(xì)胞中纖維素的分布)，1 550～1 640 cm-1(用苯環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)的空間分布規(guī)律來(lái)代表薄壁細(xì)胞中木質(zhì)素的分布)以及1 026～1 195 cm-1(C—C和C—O—C伸縮振動(dòng)的空間分布規(guī)律來(lái)代表薄壁細(xì)胞中半纖維素的分布)3個(gè)振動(dòng)區(qū)分別進(jìn)行拉曼成像，結(jié)果如圖3所示。圖3(a)為顯微鏡下選擇的細(xì)胞區(qū)域，(b)、(c)、(d)分別為薄壁細(xì)胞中纖維素、木質(zhì)素、半纖維素的空間分布圖；其中(b)的成像振動(dòng)區(qū)主要特征峰是2 890 cm-1，是C—H以及C—H2伸縮振動(dòng)，(c)的成像振動(dòng)區(qū)主要特征峰是1 601 cm-1，是苯環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，而(d)的成像振動(dòng)區(qū)主要特征峰是1 090 cm-1，是重原子(CC和CO)的伸縮振動(dòng)，對(duì)應(yīng)的主要組分是纖維素、木聚糖、葡甘露聚糖。

如圖3(b)所示，在薄壁細(xì)胞中可以明顯的看出，纖維素在次生壁層(S)上的拉曼信號(hào)最強(qiáng)(對(duì)比度最亮)，說(shuō)明此處纖維素的集團(tuán)數(shù)量比最高；復(fù)合胞間層(CML)的纖維素集團(tuán)數(shù)量比次之；而細(xì)胞角隅(CC)處的纖維素的拉曼信號(hào)非常弱(對(duì)比度很暗)，說(shuō)明CC處纖維素的集團(tuán)數(shù)量比很低。此外，還能明顯的看出細(xì)胞壁的水平方向的拉曼信號(hào)對(duì)比度比垂直方向暗，說(shuō)明該薄壁細(xì)胞壁上的纖維素集團(tuán)數(shù)量比水平方向低于垂直方向。

圖3(c)所示，CC處木質(zhì)素拉曼信號(hào)最強(qiáng)(對(duì)比度最亮)，CML處木質(zhì)素拉曼信號(hào)強(qiáng)度僅次于CC處，而S上的木質(zhì)素拉曼信號(hào)強(qiáng)度比較弱，說(shuō)明CC處的木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比最高，CML次之，S上的木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比較低，這與前文中對(duì)薄壁細(xì)胞壁木質(zhì)素的微區(qū)分布線譜分析結(jié)果是一致的。

圖3(d)中可以看出S層上拉曼信號(hào)對(duì)比度較亮，CML次之，CC處的對(duì)比度很暗，說(shuō)明S層上的半纖維素集團(tuán)數(shù)量比最高，CML次之，CC處集團(tuán)數(shù)量比最低。此外，成像圖中薄壁細(xì)胞壁水平方向拉曼信號(hào)對(duì)比度明顯比垂直方向亮，說(shuō)明半纖維素集團(tuán)數(shù)量比水平方向高于于垂直方向，與纖維素的情況相反。

3 結(jié)論與討論

高地鉤葉藤薄壁細(xì)胞壁上纖維素、半纖維素集團(tuán)數(shù)量比由高至低依次是次生壁(S)、復(fù)合胞間層(CML)、細(xì)胞角隅(CC)處，而木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比恰恰相反。薄壁細(xì)胞的次生壁外部(SⅠ)、中部(SⅡ)和內(nèi)部(SⅢ)3個(gè)形態(tài)區(qū)纖維素集團(tuán)數(shù)量比、木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比差別均較小；CML與SⅡ處纖維素集團(tuán)數(shù)量比沒(méi)有差別，但SⅡ木質(zhì)素集團(tuán)數(shù)量比小于CML。此外，薄壁細(xì)胞壁的纖維素集團(tuán)數(shù)量比水平方向低于垂直方向，而半維素集團(tuán)數(shù)量比水平方向高于于垂直方向，與纖維素的情況相反。

(a)與薄壁細(xì)胞壁中纖維素;(b)木質(zhì)素;(c)半纖維素;(d)分布圖像。