三種不同來源金線蓮的主要活性成分比較分析

楊 琳 ，張杭穎 ，陳 月 ，范靜秀 ，楊 帆 ，張君誠

(1.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院，藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心,福建 三明,365000;2福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州,350000)

金線蓮(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.)是華南地區(qū)重要特色中草藥，有“藥王”、“金草”美譽(yù)，長期受市場追捧，被列入福建省首批種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程支持項目。其具有抗氧、抗病毒和抗癌的功效，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，阻止細(xì)胞的退化、衰老，參與人體免疫調(diào)節(jié)，對提高人體免疫力，對肝、腎、肺等器官的慢性病康復(fù)和療養(yǎng)具有一定作用，福建中醫(yī)藥管理局也將其列為抗新冠病毒中藥的儲備品種[1-5]。國家衛(wèi)健委鑒于食用傳統(tǒng)已允許地方制定金線蓮食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)。但長期的過渡采摘和生態(tài)破壞使金線蓮的野生資源銳減，組織培養(yǎng)和林下栽培技術(shù)被廣泛運用于金線蓮培育[6-8]。但不同來源的金線蓮主要活性成分存在差異，主要成分安全與食用價值問題困擾著金線蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

金線蓮含有多種氨基酸、黃酮、多糖、生物堿、揮發(fā)油、甾醇等多種活性成分[8]，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等功效[1-5]。研究表明不同來源的金線蓮成分含量不盡相同。使用HPLC法檢測52批金線蓮樣品中12個核苷類成分含量，結(jié)果表明腺苷、尿苷、鳥苷、胞苷含量較高 (均值大于300 μg·g-1)，不同來源金線蓮核苷成分具有4類化學(xué)表型，含量之間存在差異[9]。鄭麗紅等分析了野生(來自福建南靖)、種植(組培4個月，種植3個月)和組織培養(yǎng)(組培4個月)三種金線蓮藥材中核苷類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在這三種金線蓮藥材中具有多種相同成分，就核苷及堿基類成分的總含量而言，組培最高(2.201 3 mg/g)，種植其次(1.856 8 mg/g)、野生最低(1.663 9 mg/g)[10]。野生來源的金線蓮與組培金線蓮中微量元素的含量有較大差異，但水分和灰分含量的差別不大[11]。組織培養(yǎng)不同來源的金線蓮含水率差異較小，醇溶性浸出物成分差異顯著，且醇溶性浸出物含量與總黃酮含量呈正相關(guān)，含水率、多糖含量與醇溶性浸出物、總黃酮呈負(fù)相關(guān)[12]。另外，張藏蔓等建立野生、組織培養(yǎng)和種植不同來源金線蓮的HPLC指紋圖譜，并比較不同來源金線蓮及其近緣植物整體的差異，為完善金線蓮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗依據(jù)[13]。對不同基原金線蓮植物的化學(xué)成分比較結(jié)果表明，福建金線蓮組培植株、臺灣金線蓮組培植株和福建金線蓮林下種植植株化學(xué)成分組成及含量非常相似[14]。對云南省3個主要金線蓮栽培品種的活性成分比較分析發(fā)現(xiàn)，滇越金線蘭總黃酮和氨基酸總量顯著高于2個福建品種[15]。栽培金線蓮生物量及活性成分隨著移栽時間延長總多酚及總黃酮含量緩慢增長，總多酚和總黃酮在種植滿150 d達(dá)到最大值，而多糖含量則遞減[16]。在已報道的文獻(xiàn)中，有對組織培養(yǎng)、林下種植和野生金線蓮核苷類物質(zhì)、微量元素、多糖和總黃酮等含量的比較分析。但組織培養(yǎng)、林下種植和野生金線蓮的來源品系各不相同，其活性成分的含量差異并不能為產(chǎn)品替代提供直接依據(jù)。

本文分別采用了超聲波輔助提取－紫外分光光度計法、食品中氨基酸的測定方法(GB/T 5009.1242016)和堿性酒石酸銅滴定法，檢測野生(采自福建德化地區(qū)的尖葉金線蓮，葉卵圓形，葉片墨綠，葉脈金色，經(jīng)三明學(xué)院張君誠教授鑒定為蘭科開唇蘭屬植物金線蓮，以下簡稱野生)、組織培養(yǎng)(以福建德化的尖葉金線蓮為外植體，組織培養(yǎng)4個月，以下簡稱組培)和林下種植(以福建德化的尖葉金線蓮為外植體，組織培養(yǎng)4個月后移栽至林下種植10個月，以下簡稱種植)三種同一品系不同來源金線蓮中的總黃酮、氨基酸及多糖含量，比較分析三種不同來源金線蓮的主要活性成分的差異，綜合評價不同來源金線蓮的藥用價值，探討人工栽培金線蓮替代野生金線蓮的可行性，為產(chǎn)品質(zhì)量提升和產(chǎn)品市場擴(kuò)充提供參考。

1 材料與方法

1.1 三種來源金線蓮樣品制備

野生金線蓮采自福建德化地區(qū)的尖葉金線蓮，葉卵圓形，葉片墨綠，葉脈金色，經(jīng)三明學(xué)院張君誠教授鑒定。組織培養(yǎng)金線蓮以福建德化的尖葉金線蓮為外植體，組織培養(yǎng)4個月后長成完整植株。林下種植金線蓮是取組織培養(yǎng)4個月后長成完整植株的金線蓮，移栽至闊葉林林下種植10個月。

1.2 總黃酮的提取和檢測

取長勢一致的野生、組培和種植金線蓮全株，洗凈、使用真空干燥箱6050（深圳市艾斯科儀器設(shè)備有限公司）55℃烘干至恒重，再使用食物處理器MR9401（廣東新寶電器股份有限公司）粉碎植物樣品，用95%的乙醇定容至25 mL，采用超聲波輔助提取－紫外分光光度計法，參照姚歡歡等使用的《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）》中的實驗方法[17]，設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)，三次技術(shù)重復(fù)，取平均值。

1.3 氨基酸的提取和檢測

取長勢一致的野生、組培和種植金線蓮全株，洗凈晾干后，參照劉偉等使用的GB/T 5009.124－2016《食品中氨基酸的測定》中的實驗方法[18]，用手持式高速勻漿機(jī)CS-10（上海測博，上海）打成勻漿，最后用氨基酸自動分析儀測定氨基酸的含量，設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)，三次技術(shù)重復(fù)，取平均值。

1.4 多糖的提取和檢測

取長勢一致的野生、組培和種植金線蓮全株，參照朱旭偉等使用的《保健食品功效成分檢測方法（2002年版）》中的堿性酒石酸銅滴定法[19]，測定金線蓮中多糖含量，設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)，三次技術(shù)重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量比較

三種不同來源金線蓮中總黃酮含量的結(jié)果顯示：組培來源的金線蓮總黃酮含量為0.28 g/100g，種植金線蓮和野生金線蓮總黃酮含量均為0.30 g/100g，但三者差異不顯著，結(jié)果見圖1。黃酮廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中，總數(shù)大約有4千多種。它是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生。金線蓮中，黃酮含量的高低是評價其藥用價值的重要指標(biāo)。由實驗結(jié)果可知，組培、種植和野生金線蓮盡管來源不同，生長時間存在差異，但總黃酮含量并不存在明顯差異。有研究顯示，野生金線蓮總黃酮含量(1.434%)高于組織培養(yǎng)來源的金線蓮(0.916%)，兩者之間呈現(xiàn)顯著水平差異[20]；種植金線蓮(組織培養(yǎng)5個月移栽林下種植6個月)中五種黃酮類化合物的總含量(2.911 mg/g)是組培金線蓮的4倍(0.706 mg/g)[21]；移栽3月齡以上的金線蓮總黃酮含量高于組織培養(yǎng)的金線蓮[22]。但也有研究表明，臺灣種源的組培金線蓮總黃酮含量(7.62 mg/g)略高于臺灣種源(6.06 mg/g)、云南種源(7.09 mg/g)和廣西種源(5.34 mg/g)的野生金線蓮總黃酮含量[23]。因此，野生、種植和組培金線蓮總黃酮含量與外植體的來源、生長時間等因素密切相關(guān)。

圖1 三種不同來源金線蓮的總黃酮含量

2.2 氨基酸含量比較

野生金線蓮、組培金線蓮和種植金線蓮中16種氨基酸的總含量分別為1.60、0.58、1.13 g/100g。野生金線蓮16種氨基酸的總含量分別是組培和種植金線蓮的2.76倍和1.42倍(圖2，表1)。三種不同來源金線蓮的氨基酸均以天冬氨酸為主，其含量占16種氨基酸總含量的36.88%(野外)、17.24%(組培)、22.12%(種植)。谷氨酸和亮氨酸的含量分居第二、第三位。蛋氨酸含量在檢測的16種氨基酸中含量最低，在組培金線蓮中的含量低至無法檢測。組培金線蓮16種氨基酸含量均小于種植和野生金線蓮。種植金線蓮的蘇氨酸、亮氨酸和脯氨酸的氨基酸含量與野生金線蓮組相等，天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸含量分別少于野生金線蓮0.24、0.02 g/100g，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸含量比野生金線蓮少0.01 g/100g(表1)。由此可知，野生金線蓮16種氨基酸含量均高于種植和組培金線蓮，且差異顯著。其它研究表明，種原地為福建、廣東、浙江、江西和貴州的組培金線蓮總氨基酸量為11.38%～17.06%，其中天門冬氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量明顯高于其他氨基酸組分[24]。金線蓮各氨基酸含量以天冬氨酸最高，蛋氨酸含量最低，組培和野生來源的金線蓮游離氨基酸含量范圍為1.91%～7.92%，且組培金線蓮游離氨基酸含量較高，培養(yǎng)基種的6-AB含量會影響游離氨基酸富集[25]。

圖2 不同來源金線蓮中總氨基酸含量

表1 三種不同來源金線蓮中主要氨基酸含量對比表

人體必需氨基酸是指人體不能通過自己合成來滿足人體需要，必需通過食物獲得的氨基酸，包括：蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和色氨酸。三種不同來源金線蓮中，除組培來源的金線蓮未測到蛋氨酸含量外，其他人體必需氨基酸均在三種來源的金線蓮中被檢測到(表1,圖3)。圖3線段圍成的面積表示不同來源金線蓮中部分成人必需氨基酸的總和，分別為0.45 g/100g(野生)、0.4 g/100g(林下)、0.22 g/100g(組培)。亮氨酸在人體必需氨基酸中含量最高，在野外、組培和種植金線蓮中的含量分別為0.10、0.06和0.10 g/100g。三種不同來源的金線蓮中人體必需氨基酸總量占16種氨基酸總量的比例分別為28.13%(野生)、37.93%(組培)、35.40%(種植)。有研究表明，不同種源地的組培金線蓮必需氨基酸為2.81%～4.47%，丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸為金線蓮的特征性氨基酸[24]。

圖3 三種不同來源金線蓮中部分成人必需氨基酸的含量對比圖

嬰兒必需氨基酸除了人體必需的氨基酸外，還包括精氨酸，早產(chǎn)兒必需氨基酸還包含精氨酸和酪氨酸。有研究顯示，左旋精氨酸和組氨酸有增強(qiáng)心臟停博液的效果，對嬰兒及早產(chǎn)兒心肌具有保護(hù)作用[26]，精氨酸對新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎和胎兒宮內(nèi)生長受限等有一定預(yù)防作用[27]。三種不同來源的金線蓮中，嬰兒及早產(chǎn)兒必需氨基酸的含量如表1和圖4所示，占16種氨基酸總含量的比例中，種植金線蓮最高(45.13%)，組培金線蓮次之(44.83%)，野生金線蓮最低(36.88%)。

圖4 三種不同來源金線蓮中嬰兒及早產(chǎn)兒的必需氨基酸的含量對比圖

綜上，雖然野生金線蓮的總氨基酸含量高于組培和種植金線蓮，但是其成人必需氨基酸、嬰兒必需氨基酸含量占比都低于組培和種植金線蓮。組培和種植金線蓮中成人必需氨基酸和嬰兒必需氨基酸占16種總氨基酸的比例相近，但組培金線蓮生長周期(4個月)較種植金線蓮(14個月)短。

2.3 多糖含量比較

金線蓮多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌和降血糖等多種功能。通過堿性酒石酸銅滴定法檢測，組培、種植和野生來源的金線蓮多糖含量分別為1.00、1.70、0.60 g/100g(圖5)。種植金線蓮多糖含量高于組培和野生金線蓮，分別是它們的1.70倍和2.83倍。組培金線蓮生長周期(4個月)比種植金線蓮周期(14個月)短，比野生金線蓮獲取方便，且多糖含量高。有文獻(xiàn)報道，組織培養(yǎng)和野生來源的金線蓮多糖含量變化范圍在7.50%～15.31%，組織培養(yǎng)金線蓮的多糖含量高于野生來源的金線蓮[27]。金闊葉林林下栽培苗金線蓮的多糖含量高于繁殖瓶苗和大棚栽培苗，其中林下栽培3個月的多糖含量最高[28]。對組培和種植金線蓮多糖含量的動態(tài)檢測結(jié)果表明，它們的變化均呈“雙峰”曲線式增長[29]。另外，不同栽培時間金線蓮各組織的多糖含量也存在差異，處于蕾期、花期的金線蓮，其根部的多糖含量最高，其他時期則以莖、葉的多糖含量高[28]。據(jù)此，組培和種植來源的金線蓮多糖含量與生長時間、海拔、取樣組織、提取檢測方法等因素相關(guān)。

圖5 三種來源金線蓮中多糖含量的比較分析

3 結(jié)論

種植金線蓮與野生金線蓮的總黃酮含量大體相同，均為0.30 g/100g，組培來源的金線蓮中總黃酮含量(0.28 g/100g)最低，但三者差異不顯著。三種來源的金線蓮中天冬氨酸含量最高，谷氨酸次之，蛋氨酸最低。組培金線蓮16種主要氨基酸的含量均小于種植金線蓮，種植金線蓮部分氨基酸含量和總氨基酸含量小于野生金線蓮。種植金線蓮多糖含量(1.70 g/100g)高于組培來源的金線蓮(1.00 g/100g)和野生來源的金線蓮(0.60 g/100g)。綜上，不同來源的金線蓮含有黃酮、氨基酸和多糖的比例不同。野生金線蓮在市場中的價格較高，但總黃酮含量與組培和種植金線蓮差異并不顯著，多糖含量甚至低于組培和種植金線蓮。其總氨基酸含量雖然比種植和金線蓮高，但人體必需氨基酸和嬰幼兒必需氨基酸的所占比例比組培和種植的金線蓮低。三種來源金線蓮中，林下種植金線蓮的總黃酮、氨基酸和多糖含量與野生金線蓮相近，可作為三種有效成分提取利用的有利原料。

作者貢獻(xiàn)：

楊琳是本研究的實驗設(shè)計和實驗研究的執(zhí)行人，陳月、范靜秀完成資料整理及論文初稿的寫作；張杭穎、楊帆參與實驗設(shè)計和試驗結(jié)果分析，張君誠是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。