乳酸菌在腸道定植的影響因素及研究方法

秦文飛，宋 馨，夏永軍，艾連中，王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093）

聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家將益生菌定義為：當(dāng)給予宿主足夠數(shù)量的活微生物時(shí)，對(duì)宿主的健康有益[1]。乳酸菌是以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱，其作為益生菌家族中最重要的菌株之一，在參與調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、參與免疫應(yīng)答和抑制腸道病原菌的生長(zhǎng)繁殖等多種益生功能中發(fā)揮重要的作用[2-3]。而在人體內(nèi)乳酸菌數(shù)量和種類最豐富的地方是消化道，并且乳酸菌的種類和數(shù)量也因消化道部位不同而有較大差異[4]，其中在胃中的乳酸菌數(shù)量較少，主要是由于胃酸能將部分乳酸菌殺死，而在盲腸和結(jié)腸中乳酸菌的數(shù)量最多，能達(dá)到106～1010CFU/g。

在通常情況下，乳酸菌經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)后大部分將隨著胃腸道的蠕動(dòng)排出體外，只有少部分定植于腸道中[5]。而定植于腸道中是乳酸菌持續(xù)發(fā)揮其益生作用的前提，但是乳酸菌的定植能力會(huì)因種類的不同而存在差異，一般來說，對(duì)乳酸菌體內(nèi)定植能力的評(píng)價(jià)通常是從定植于體內(nèi)的數(shù)量和位點(diǎn)兩方面進(jìn)行，首先要求乳酸菌對(duì)胃酸、膽鹽有一定的耐受能力，保證菌株到達(dá)定植位點(diǎn)時(shí)有較高活性和增殖能力。并且乳酸菌只有在定植位點(diǎn)達(dá)到一定的數(shù)量，才可能成為局部?jī)?yōu)勢(shì)菌且在局部微環(huán)境起到調(diào)節(jié)腸道菌群作用并發(fā)揮其功能[6-7]。另外，乳酸菌在宿主腸道中的定植豐度也會(huì)影響到宿主的健康水平[8]。

乳酸菌腸道定植帶給宿主的諸多有益作用（如緩解便秘[9]、降低膽固醇[10]、減輕性結(jié)腸炎[11]及降低血糖[12]等）吸引眾多研究學(xué)者對(duì)其在腸道定植的機(jī)制進(jìn)行探究，旨在更加透徹地梳理其在宿主腸道內(nèi)進(jìn)行定植的過程，闡明乳酸菌在腸道定植的機(jī)制，輔助乳酸菌在實(shí)際應(yīng)用中更好地在腸道中定植，進(jìn)而持續(xù)發(fā)揮其特殊的益生功能。但是到目前為止，對(duì)乳酸菌在腸道定植的機(jī)制鮮有詳盡的闡述，其主要原因可能是復(fù)雜的腸道環(huán)境中存在較多的干擾因素，并且評(píng)估乳酸菌在腸道定植能力的方法還存在一定的局限性，難以精確地反映其與腸道之間發(fā)生的相互作用。本文綜述近年來報(bào)道的乳酸菌腸道定植的影響因素，并針對(duì)腸道菌群的復(fù)雜多樣性總結(jié)多種乳酸菌腸道定植的研究方法、定植模型及評(píng)估方法一系列關(guān)鍵技術(shù)，為進(jìn)一步闡明乳酸菌的腸道定植機(jī)制提供參考。

1 乳酸菌定植的影響因素

乳酸菌在宿主腸道中持久發(fā)揮生理功能的前提是必須能在宿主腸黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)生黏附并進(jìn)一步定植，在腸道中某個(gè)部位逐漸能形成穩(wěn)定的菌群。但是在復(fù)雜的腸道中，影響乳酸菌在宿主腸道定植的因素并不少，概括起來包括內(nèi)因和外因。內(nèi)因主要指菌體自身的一些理化特性，比如菌株黏附能力、自身的運(yùn)動(dòng)性、乳酸的分泌以及自身的增殖能力等。外因主要指環(huán)境狀態(tài)，比如宿主基因及體征因素、腸道菌群、胃酸和膽鹽的耐受性、飲食等。

1.1 黏附能力

乳酸菌的各種表面成分介導(dǎo)了乳酸菌與其環(huán)境的接觸和相互作用，形成各菌株獨(dú)特的表面特性，對(duì)其在腸道生存有著至關(guān)重要的作用[13]。而乳酸菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附是其表面成分介導(dǎo)形成的一種物理表觀現(xiàn)象，有助于其在腸道定植、增強(qiáng)乳酸菌與腸道細(xì)胞之間的信號(hào)交流、抑制病原菌在腸道的定植和提高機(jī)體的免疫力等作用[14-15]。黏附通常認(rèn)為是定植的關(guān)鍵步驟[16]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，與黏附作用相關(guān)的主要是黏附素（如脂磷壁酸、S-層蛋白、脂多糖、肽聚糖等）的分泌及其與黏附素受體結(jié)合，而這些與乳酸菌自身表面的疏水性、自聚性、共聚性以及環(huán)境中的溫度、pH值和離子濃度等因素密切相關(guān)。

表面疏水性是一個(gè)理化概念，特指表面具有非極性成分的細(xì)菌在具有極性性質(zhì)的水中所表現(xiàn)出的非穩(wěn)態(tài)，從而引起非穩(wěn)態(tài)體系中的熱能和分子的重新排列。乳酸菌表面疏水性作為其細(xì)胞表面的一種普遍特性，是與宿主細(xì)胞之間的非特異性相互作用，是影響菌株黏附性的內(nèi)在因素，近年來被用來作為評(píng)價(jià)乳酸菌黏附性能的一個(gè)重要參數(shù)[13]。Todorov等[17]在評(píng)估乳酸菌益生特性的實(shí)驗(yàn)中，得出鼠李糖乳桿菌GG疏水性約為55%，約32%的菌株可以黏附于HT-29細(xì)胞；而戊糖乳桿菌ST712BZ疏水性較低（38%），但卻有63%的菌株能黏附在HT-29細(xì)胞上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株表面疏水性與HT-29細(xì)胞的黏附率呈負(fù)相關(guān)。但楊振泉等[18]的研究結(jié)果卻表明，戊糖片球菌的表面疏水性與Caco-2細(xì)胞黏附率呈顯著正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能與乳酸菌菌株種類、黏附細(xì)胞種類以及實(shí)驗(yàn)方法等因素有關(guān)。另外，菌株疏水性受乳酸菌表面蛋白、脂磷壁酸等因子的調(diào)節(jié)。并且表面疏水性作為間接評(píng)價(jià)黏附性的方法，只起到輔助判斷的作用，應(yīng)結(jié)合其他模型同時(shí)使用[19]。

乳酸菌的聚集能力（自聚性和共聚性）作為促進(jìn)其益生效應(yīng)的方式之一，Gupta等[20]認(rèn)為一株良好的益生菌的自聚集比例最小約為40%。也有研究表明益生菌的自聚性能可能影響其對(duì)腸上皮細(xì)胞和黏膜表面的黏附能力[21]。Kumar等[22]將乳酸片球菌NCDC 252在不同條件（溫度、重懸液）下檢測(cè)其自聚性，結(jié)果均表現(xiàn)出90%以上的聚集，在黏附實(shí)驗(yàn)中，乳酸片球菌NCDC 252對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞有較強(qiáng)的黏附能力，表明該菌株的自聚性與黏附性存在正相關(guān)性，并預(yù)測(cè)其在人和動(dòng)物腸道可能存在定植潛能。這一結(jié)論與宋雨心等[23]的研究結(jié)果一致，即自聚集能力強(qiáng)的乳酸菌往往與腸道上皮細(xì)胞有較強(qiáng)的黏附性，并且他們認(rèn)為乳酸菌自聚集能力可以作為篩選其黏附特性的首要指標(biāo)。另一方面，乳酸菌的自聚作用不僅可以形成生物膜屏障，還可以阻止致病菌的侵入和感染。在乳酸菌共聚性方面，許文杰等[24]認(rèn)為乳酸菌與致病菌的共聚性能力越高，與細(xì)胞的黏附率就越高。其對(duì)10 株乳桿菌與致病菌的共聚性以及與Caco-2細(xì)胞的黏附率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株C88與金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有很高的共聚力（40.03%和34.09%），與Caco-2細(xì)胞的黏附率也達(dá)到約500個(gè)細(xì)菌/100個(gè)細(xì)胞，并且菌株C88的共聚力和自聚力存在一定的相關(guān)性。這在García-Cayuela等[25]的研究中得到證實(shí)，他們發(fā)現(xiàn)乳酸菌的自聚性和共聚性存在正相關(guān)性。另外，具有與其他細(xì)菌（如病原體）共聚的能力可能使其比非共聚性生物體具有定植優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楹笳吒菀讖哪c道環(huán)境中清除。

另外，pH值和鈣離子濃度也影響著乳酸菌在宿主腸道中的黏附。外部環(huán)境pH值的變化對(duì)乳酸菌的黏附存在較大的影響，在酸性環(huán)境更有利于乳酸菌的黏附[26]。Bergonzelli等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在pH 5.0時(shí)與Caco-2細(xì)胞有較強(qiáng)的黏附能力，但是在pH 7.0時(shí)幾乎不發(fā)生黏附，表明乳酸菌的黏附存在pH值依賴性。另外，Larsena等[28]向乳酸的生長(zhǎng)環(huán)境菌中添加鈣離子，結(jié)果顯示，植物乳桿菌Q47、約氏乳桿菌NCC533和羅伊氏乳桿菌DSM12246等黏附能力明顯提升，鈣離子能促進(jìn)黏附可能是因?yàn)榧せ盍蒜}離子介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)菌與細(xì)胞表面受體間的特異性結(jié)合[4]。另外，蔣建軍等[29]通過改變鈣離子濃度發(fā)現(xiàn)，鈣離子濃度為2 mmol/L時(shí)豬小腸黏膜上皮細(xì)胞黏附乳酸桿菌數(shù)量最多，表明鈣離子濃度也影響乳酸桿菌對(duì)豬小腸黏膜上皮細(xì)胞的黏附率。

1.2 乳酸菌的運(yùn)動(dòng)性

乳酸菌在自然界中種類很多，分布極廣。但是絕大多數(shù)的乳酸菌并不具備運(yùn)動(dòng)的能力[30]。而宿主是通過胃腸道的蠕動(dòng)輸送物質(zhì)，在這種環(huán)境下，乳酸菌在胃腸道的時(shí)間以及菌株本身的運(yùn)動(dòng)性會(huì)影響乳酸菌在腸道中的滯留時(shí)間。Kajikawa等[31]從雞糞便中分離得到一株敏捷乳桿菌BKN88，通過對(duì)motB基因的突變構(gòu)建了一株有鞭毛但不能運(yùn)動(dòng)的敏捷乳桿菌BKN134，在無菌小鼠模型中，野生型BKN88和突變型BKN134在糞便標(biāo)本中的數(shù)量均穩(wěn)定維持在1010CFU/g，二者并沒有差異；但是在小腸局部取樣計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)回腸黏膜中野生型BKN88數(shù)量比突變型BKN134高出約10 倍。另外，在體外實(shí)驗(yàn)中，具有運(yùn)動(dòng)性的菌株BKN88易與黏蛋白發(fā)生黏連，模擬黏液層穿透實(shí)驗(yàn)表明，運(yùn)動(dòng)的菌株更易穿透黏液層，表明具有運(yùn)動(dòng)性的敏捷乳桿菌更容易在黏液層占據(jù)生態(tài)位，有利于自身進(jìn)一步增殖，并在腸道中滯留時(shí)間會(huì)有延長(zhǎng)。任世英等[32]從泡菜中篩選出一株具有運(yùn)動(dòng)性的鼠李糖乳桿菌屬A5，該菌株有較廣的抑菌譜，對(duì)酸有良好的耐受性，表明該菌株可能在腸道中有較好的定植潛能。

1.3 乳酸的分泌

乳酸是一種弱有機(jī)酸，是乳酸菌自身的一種代謝產(chǎn)物，在生長(zhǎng)繁殖過程中，它可將90%的代謝糖轉(zhuǎn)化為乳酸，對(duì)自身周圍的微環(huán)境產(chǎn)生影響[33]。Wu Chongde等[34]通過在培養(yǎng)基中添加乳酸改變培養(yǎng)基中的pH值，在初始pH值為6.5時(shí)，干酪乳桿菌Zhang（CGMCC No. 1697）及其耐酸性突變菌株（CCTCC No. M2010292）的生物量并沒有差異，但是隨著pH值降低到4.3時(shí)，野生型菌株的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，比突變型菌株的生物量少了57%。當(dāng)pH值調(diào)整到3.3時(shí)，7 h后，只有不到0.01%的野生型菌株存活，而突變體的存活率超過10%。但是也有研究表明，可以通過添加血紅素和醌類物質(zhì)使乳酸菌進(jìn)行有氧呼吸，改變代謝途徑，減少乳酸的積累[35-36]。乳酸菌通過利用外源血紅素進(jìn)行有氧呼吸，其在有氧條件下生物量提高，產(chǎn)酸量減少，菌體活力顯著提高。另外，Hall[37]、Mao Ning[38]等的研究表明乳酸菌產(chǎn)生的乳酸能夠改變小鼠腸道中的pH值，從而顯著抑制霍亂弧菌在腸道中的定植。

1.4 與腸道菌群的作用

乳酸菌能同腸道病原菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而讓病原菌因缺營(yíng)養(yǎng)而無法生長(zhǎng)；另外，乳酸菌還與腸道中的細(xì)菌協(xié)同作用，促進(jìn)其在腸道中的定植；它還能通過分泌細(xì)菌素、雙乙酰、乳酸等物質(zhì)對(duì)部分細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，促使腸道菌群達(dá)到平衡，也對(duì)致病菌的生長(zhǎng)和毒素的黏附具有一定的拮抗作用[39]。Kingamkono等[40]利用植物乳桿菌299 V對(duì)米粥進(jìn)行發(fā)酵，讓健康兒童以每天1 次、一周3 次的頻率食用，并在第7天、第13天等時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組宿主腸道里的病原菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，食用發(fā)酵米粥的兒童腸道中總致病菌明顯減少。Lash等[41]對(duì)植物乳桿菌ATCC801進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌株可以抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，該植物乳桿菌分泌的細(xì)胞素對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。舒中玉等[42]研究也發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌能夠提高腸道菌群豐度，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)。但是腸道微生物群非常復(fù)雜，個(gè)體之間差異很大，想要完全了解腸道菌群與乳酸菌之間的作用并不是很容易，還需要更加深入的探究。

1.5 宿主基因與體征因素

宿主基因型和體征因素（性別、年齡、疾病與健康等）會(huì)影響乳酸菌在腸道中的定植。郭飛翔等[43]通過不同培養(yǎng)基對(duì)巴馬人群來源的乳酸菌菌群數(shù)量進(jìn)行分離比較，發(fā)現(xiàn)分離的桿菌數(shù)要多于球菌數(shù)，女性腸道乳酸菌總數(shù)略高于男性，青少年組的腸道中乳酸菌數(shù)量最多，隨著年齡的增長(zhǎng)，乳酸菌的數(shù)量逐漸減少，但是長(zhǎng)壽組中的乳酸菌數(shù)量還保持在一個(gè)很高的水平。另外，徐鳳等[44]對(duì)2 月齡斷奶羔羊、8 月齡和2 歲山羊瘤胃及回腸黏膜刮取物中的乳酸菌進(jìn)行了分離，隨著山羊年齡的增加，分離到的乳酸菌種類逐漸增多。

另外，在沒有大的干擾的情況下，宿主腸道內(nèi)的菌群在一段時(shí)間內(nèi)大多是穩(wěn)定的。但抗生素等藥物的服用以及食物不耐受、吸收不良和瀉藥等引起的腹瀉已被證明能迅速（但通常是短暫的）降低宿主腸道菌群豐富度[45-46]。Tropini等[46]以6～12 周齡的小鼠為模型宿主，通過在飲用水中添加體積分?jǐn)?shù)15%聚乙二醇誘發(fā)小鼠產(chǎn)生輕度滲透性腹瀉，結(jié)果表明，聚乙二醇處理會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群多樣性下降，顯著地改變微生物群落。Cabral等[47]采用4 周齡雌性C57BL/6J小鼠為宿主模型，用阿莫西林、環(huán)丙沙星或鹽酸多西環(huán)素添加至飲用水中，與對(duì)照組相比，阿莫西林顯著降低除擬桿菌門等之外的幾乎所有物種的相對(duì)豐度。相反，鹽酸多西環(huán)素和環(huán)丙沙星都降低了幾種擬桿菌門的相對(duì)豐度，同時(shí)增加了厚壁菌門相對(duì)豐度。以上研究中雖并沒有在目科屬水平上進(jìn)行進(jìn)一步的豐度測(cè)定，但是乳酸菌廣泛存在于宿主腸道中，且其屬于厚壁菌門，在抗生素服用以及腹瀉的條件下可能會(huì)影響其在腸道中的定植。

1.6 胃酸和膽鹽的耐受性

乳酸菌在腸道中定植的首要條件是對(duì)胃酸和小腸膽鹽具有一定的耐受性，因?yàn)槿梭w胃酸環(huán)境（pH 3）和小腸高膽鹽環(huán)境（膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%～0.3%）[48]會(huì)殺死部分的乳酸菌或?qū)ζ浠钚援a(chǎn)生抑制作用，乳酸菌以較高數(shù)量和活性到達(dá)小腸中有利于其在腸道中的黏附定植。然而乳酸菌的個(gè)體差異性對(duì)酸和膽鹽的耐受性存在差異。Liong等[49]對(duì)比了11 株乳酸菌對(duì)酸、膽鹽的耐受性，在耐酸實(shí)驗(yàn)中嗜酸乳桿菌ATCC 4962、干酪乳桿菌ASCC290和干酪乳桿菌ASCC292在pH 2.0下培養(yǎng)2 h后其數(shù)量超過107CFU/mL，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸能力。而干酪乳桿菌ASCC1520、干酪乳桿菌ASCC1521、干酪乳桿菌 ASCC279、干酪乳桿菌ATCC 15820、干酪乳桿菌 CSCC2607對(duì)酸較敏感，培養(yǎng)2 h后數(shù)量?jī)H存104CFU/mL。在膽鹽實(shí)驗(yàn)中，嗜酸乳桿菌ATCC 4356在有膽鹽（牛膽汁和膽酸）和無膽鹽的情況下生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出顯著差異，而干酪乳桿菌ASCC 290在有牛膽汁的情況下生長(zhǎng)受到抑制。

目前，通過包埋的方式有望解決這些影響菌株在腸道成功定植的問題。Anselmo等[50]通過采用殼聚糖和海藻酸鈉對(duì)菌株進(jìn)行逐層包封，使其菌株在通過胃腸道時(shí)減少損傷，同時(shí)包埋材料的使用也會(huì)影響菌株對(duì)腸道的黏附。Ding等[51]將鼠李乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、唾液乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌型Bl-O4和Bi-07型乳酸乳桿菌8 種益生菌采用藻酸鹽進(jìn)行微膠囊化處理。結(jié)果表明，微膠囊化提高了菌株在酸性條件、膽鹽作用下的存活率。另外，Watson等[52]通過生物技術(shù)手段在乳酸菌中克隆和表達(dá)Bile基因，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%豬膽汁的耐受性實(shí)驗(yàn)中，工程乳酸菌比野生型菌株的生物量高出約316 倍，在小鼠胃腸道中的存活率（在糞便測(cè)定）也顯著得到提高。

1.7 飲食

飲食被認(rèn)為是能調(diào)節(jié)胃腸道菌群組成和代謝活動(dòng)重要的環(huán)境因素之一，是影響腸道菌群的主要因素。Shepherd等[53]將卵形擬桿菌NB001以細(xì)菌菌落總數(shù)約為108CFU喂食小鼠，平衡7 d后喂食紫菜多糖。NB001菌株在腸道中的豐度得到顯著增長(zhǎng)（4～6個(gè)數(shù)量級(jí)），并可通過調(diào)節(jié)紫菜多糖的含量調(diào)節(jié)菌株在小鼠腸道中的豐度。另外，Sonnenburg等[54]在飼糧中添加菊粉后喂食老鼠，在飼糧變化前后，糞便總細(xì)菌密度并沒有顯著差異，在改變以菊粉為基礎(chǔ)的飼糧后，多形擬桿菌的相對(duì)豐度從第6天的（74±3）%增加到第21天的（84±5）%，表明菊粉能夠促進(jìn)擬桿菌在腸道中增殖。

2 乳酸菌腸道定植的研究方法

乳酸菌的益生功效通常是特定菌株產(chǎn)生的，而很大程度上腸道定植能力決定了其益生功效的高低。因此，在非常復(fù)雜的腸道微生物群中追蹤單一菌株非常重要，必須采用特定的方法在菌株水平進(jìn)行識(shí)別，以便檢測(cè)胃腸道中特定乳酸菌的定植和豐度，這對(duì)于菌株整體功能性的評(píng)價(jià)、篩選以及工業(yè)應(yīng)用具有重要的意義。目前，對(duì)乳酸菌菌株在腸道定植能力的評(píng)估，一般采用體外模擬實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

圖1 乳酸菌定植能力評(píng)估流程Fig. 1 Flowchart for the evaluation of LAB colonization ability

在體外模型選擇中主要是考慮乳酸菌的黏附能力，因?yàn)轲じ酵ǔ１徽J(rèn)為是定植的關(guān)鍵一步[16]，近年來很多研究者將其作為評(píng)估其菌腸道定植的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，常用的有Caco-2、HT-29及HT-29 MXT細(xì)胞等細(xì)胞系建立的模型[55-57]，可以模擬宿主細(xì)胞與微生物的直接接觸，并對(duì)其黏附率進(jìn)行測(cè)定。大量的研究證實(shí)，體外細(xì)胞模型能夠簡(jiǎn)單、快速、直觀有效地檢測(cè)益生菌的黏附能力[58-59]。而活體實(shí)驗(yàn)主要是以小鼠、人體等作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。對(duì)人體主要是采用收集糞便的方式進(jìn)行分析，而對(duì)小鼠可采用取糞便、活體成像以及對(duì)活體腸道黏液層取樣分析進(jìn)行判定。但是，體外模型通常沒有考慮活體宿主的先天免疫反應(yīng)和腸道微生物群落[60]。因此，體外模型并不能可靠地預(yù)測(cè)菌株在復(fù)雜的活體內(nèi)的真實(shí)情況[61]；并且對(duì)于其腸道黏附能力的檢測(cè)尚未建立精確、經(jīng)濟(jì)高效、省時(shí)省力的理想模型。而活體實(shí)驗(yàn)雖能更能體現(xiàn)菌株在宿主腸道中的定植情況，但是如何能精確地判定乳酸菌在宿主中的定植情況，還存在很大的挑戰(zhàn)，需要開發(fā)更加快速方法且可靠的工具來鑒別和量化[62]，并由此來對(duì)乳酸菌進(jìn)入宿主腸道后的定植情況進(jìn)行評(píng)估。

2.1 平板計(jì)數(shù)法

平板計(jì)數(shù)作為傳統(tǒng)對(duì)腸道分離物或糞便進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法，一般采用兩種方式。一是通過不同的培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的分離選擇；二是通過在培養(yǎng)基中添加抗生素對(duì)特定的菌株進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。Lee等[63]將擬桿菌引入無菌小鼠，并通過平板計(jì)數(shù)法評(píng)估其在腸道中的定植能力。Kajikawa等[31]對(duì)野生型和突變菌株經(jīng)抗生素（鏈霉素）處理后在雌性Balb/c小鼠的定植進(jìn)行了評(píng)估。實(shí)驗(yàn)通過收集小腸和盲腸的標(biāo)本，采用粗略分批灌洗法對(duì)小腸局部黏液層進(jìn)行沖洗并對(duì)乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。但此方法獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常準(zhǔn)確性并不高，而且操作繁瑣。但它仍然是用來了解腸道微生態(tài)菌群組成與作用最重要的方法。

平板計(jì)數(shù)技術(shù)是衡量細(xì)胞生存能力的標(biāo)準(zhǔn)方法，但并不能實(shí)時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于腸道菌群構(gòu)成復(fù)雜性和樣本在處理過程中較多的干擾因素，有些腸道微生物不能在體外進(jìn)行培養(yǎng)，且平板計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差，因此選擇能替代平板計(jì)數(shù)法且特異性好、準(zhǔn)確性較高的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

2.2 熒光標(biāo)記法

熒光標(biāo)記依靠熒光物物質(zhì)對(duì)菌株進(jìn)行標(biāo)記或者通過將熒光基因?qū)刖昊蛑?，使其在宿主中表達(dá)熒光物質(zhì)，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株在腸道中定植位點(diǎn)和繁殖速度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并采用流式細(xì)胞儀、熒光成像儀或熒光顯微鏡等儀器進(jìn)行分析。

2.2.1 熒光物質(zhì)標(biāo)記

目前，大多數(shù)的細(xì)菌還不能進(jìn)行基因操作，無法實(shí)現(xiàn)基因標(biāo)記，而熒光物質(zhì)標(biāo)記因操作相對(duì)簡(jiǎn)單而被用于細(xì)菌標(biāo)記。羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，cFDA-SE）是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，它可以透過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后可以偶發(fā)性地并不可逆地和細(xì)胞內(nèi)蛋白的賴氨酸殘基或其他氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，并標(biāo)記這些蛋白，由于cFDA-SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均勻和穩(wěn)定，每分裂一次，子代細(xì)胞的熒光會(huì)減弱一半，因此可以通過檢測(cè)其熒光強(qiáng)度對(duì)菌株的傳代速度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析[64-65]。Lee等[66]以BALB/c老鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用細(xì)胞增殖示蹤熒光探針cFDA-SE對(duì)干酪乳桿菌在小腸的定植潛力進(jìn)行探究，并用流式細(xì)胞儀對(duì)干酪乳桿菌在腸道不同部位的倍增時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。Fogliano等[67]將可可中不溶于水的組分體外消化酶解后添加到體外結(jié)腸模型中，并采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)模型中的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果乳酸桿菌數(shù)量顯著增加。劉倩等[68]采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠李糖乳桿菌P15和干酪乳桿菌，并刮取牙鲆的胃、盲囊和前腸的黏液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在熒光顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)黏附的乳酸菌個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)在盲囊和腸道中干酪乳桿菌的黏附率顯著高于鼠李糖乳桿菌P15，但兩者對(duì)胃的黏附差異無顯著性。采用熒光物質(zhì)標(biāo)記的不足之處是標(biāo)記效率并不高，還可能會(huì)改變細(xì)菌的表面性質(zhì)，從而影響到其他性質(zhì)測(cè)定的準(zhǔn)確性[19]。

2.2.2 熒光基因標(biāo)記

盡管熒光染料的種類繁多，但采用熒光物質(zhì)標(biāo)記常常會(huì)出現(xiàn)光信號(hào)丟失，造成假陰性的結(jié)果，且成像效果易受體內(nèi)生物分子的影響，所用的熒光物質(zhì)存在一定的安全隱患。因此開發(fā)其他的標(biāo)記方法就顯得更加重要了。van Zyl等[69]通過同源重組將編碼紅色熒光蛋白的mCherry基因整合到植物乳桿菌423基因組的非功能區(qū)。mCherry基因的表達(dá)并沒有改變植物乳桿菌423的生長(zhǎng)速度，對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生也沒有影響，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體外對(duì)小鼠腸道進(jìn)行熒光活體成像，確定植物乳桿菌423在小鼠的盲腸和結(jié)腸中發(fā)生定植。北婷婷[70]利用紅色熒光蛋白dsred2（具有熒光強(qiáng)度高、檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)）標(biāo)記鼠李糖乳桿菌05-28，然后將其灌胃小鼠，取小鼠各腸道制作石蠟切片，利用熒光顯微鏡觀察重組菌株在小鼠腸道黏附情況。發(fā)現(xiàn)在3 h后小鼠腸道各部位均能檢測(cè)到重組菌株，4 d后達(dá)到定植的高峰，第15天小鼠各腸道均未檢測(cè)到重組菌株，表明該菌株在腸道中的定植偏好順序依次為回腸、結(jié)腸、空腸、十二指腸。另外，董浩等[71]以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因應(yīng)用于示蹤重組乳酸乳球菌在小鼠體內(nèi)的位點(diǎn)，采用熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)小鼠胃腸道都存在一定數(shù)量的重組乳酸乳球菌。

為解決同源菌種在腸道定植問題，Whitaker等[72]將綠色熒光基因和紅色熒光基因（對(duì)照）導(dǎo)入擬桿菌VPI-5482中，并將其灌喂小鼠，進(jìn)行熒光成像分析。當(dāng)同時(shí)定植時(shí)，對(duì)近端結(jié)腸的管腔和隱窩的成像結(jié)果顯示，兩株菌在兩個(gè)位置的豐度大致相同，然而，當(dāng)先對(duì)小鼠進(jìn)行7 d灌喂表達(dá)紅色熒光基因的擬桿菌VPI-5482后，再對(duì)其引入表達(dá)綠色熒光基因的擬桿菌VPI-5482，僅在24 h后管腔內(nèi)表達(dá)綠色熒光基因的擬桿菌VPI-5482的水平就顯著降低，而且這種變化在官腔隱窩處的定植中更為顯著。Shephsed等[53]利用帶有紅色熒光基因的野生型多形擬桿菌對(duì)小鼠進(jìn)行喂食，7 d后，用綠色熒光蛋白標(biāo)記并攜帶有21個(gè)利用海藻多糖基因的多形擬桿菌進(jìn)行喂食，當(dāng)飲食中不加入海藻多糖，帶綠色熒光基因的菌株不能夠成功定植；加入海藻多糖后，帶綠色熒光基因菌株能夠定植在結(jié)腸。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

在復(fù)雜的腸道菌群中，采用熒光物質(zhì)和熒光標(biāo)記菌株的效果會(huì)受到熒光信號(hào)強(qiáng)弱、熒光穩(wěn)定性以及是否需要外源激發(fā)光等的影響。而采用PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）能對(duì)其進(jìn)行定量分析，并且具有耗時(shí)短、結(jié)果準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。但這兩種方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)菌株中存在的特異性DNA片段的選擇要求較嚴(yán)格，并且需要通過對(duì)該片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，才能在菌株水平上對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。Nation等[73]利用qPCR技術(shù)，通過特異性基因（tuf）引物對(duì)嬰兒糞便中的羅伊氏乳桿菌進(jìn)行定量分析。這種方法在陸文偉等[74]的研究中也得到了應(yīng)用，他們將副干酪乳桿菌LC01灌胃老鼠，采用副干酪乳桿菌種屬特異性引物對(duì)老鼠糞便進(jìn)行qPCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株并不能長(zhǎng)期定植在小鼠腸道中，但可在一段時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)腸道菌群，從而改善小鼠腸道健康。在Treven等[75]的實(shí)驗(yàn)中則是從14 對(duì)加氏乳桿菌K7分泌的加氏細(xì)菌素K7 A和K7 B決定基因簇的特異性引物中篩選出一對(duì)針對(duì)K7 A和K7 B總基因簇具有特異性的引物，并以人為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，收集糞便，采用qPCR對(duì)人糞便標(biāo)本中的加氏乳桿菌K7進(jìn)行定量分析。

另外，在乳酸菌鑒定和對(duì)多態(tài)性分析中隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）的應(yīng)用較廣泛，能在菌株水平對(duì)乳酸菌進(jìn)行鑒別。Fujimoto等[76]以人體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用RAPD分析得到干酪乳桿菌特異性引物，并采用qPCR和4’,6-二氨基-2-苯基吲哚染色對(duì)人體糞便中干酪乳桿菌進(jìn)行鑒定和量化，由此對(duì)干酪乳桿菌被攝入后在人體腸道中的增殖能力進(jìn)行探究。重復(fù)序列PCR（repetitive sequence-based PCR，rep-PCR）能將乳酸菌鑒定到種和菌株的水平。黃麗麗等[77]初步采用16S rRNA基因序列確定冷水魚腸道中乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并通過rep-PCR指紋圖譜技術(shù)進(jìn)一步區(qū)分高度同源性菌株。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和基因組數(shù)據(jù)量的增加，對(duì)于生物信息學(xué)工具的開發(fā)需求日益增長(zhǎng)，目前有很多工具可以進(jìn)行泛基因組分析[78]，如PGAP（pan-genome analysis pipeline）、Pan-seq（pan-genome sequence analysis program）以及PGAT（prokaryotic genome analysis tool）等工具能實(shí)現(xiàn)對(duì)同一種或?qū)俚母鞣N生物信息進(jìn)行比較，能高效且準(zhǔn)確地篩選出目的菌株特有的DNA片段，可以用于乳酸菌在腸道或糞便中進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。

2.4 新型納米材料

近年來，納米材料發(fā)光技術(shù)越來越多地應(yīng)用到益生菌在活體體內(nèi)的示蹤上，主要包括長(zhǎng)余輝納米材料和上轉(zhuǎn)換納米材料等，其具有較強(qiáng)的組織穿透性，在生物組織中的吸收也較少且傷害較小，在體內(nèi)成像應(yīng)用中備受青睞[79-80]。Liu Yaoyao等[81]將Cr3+摻雜的鋅鎵鍺長(zhǎng)余輝納米材料用革蘭氏陽性菌LTA抗體進(jìn)行功能化，然后對(duì)羅伊氏乳桿菌進(jìn)行標(biāo)記，以監(jiān)測(cè)其在口服后進(jìn)入胃腸道的“行蹤”，體內(nèi)動(dòng)物成像證明，經(jīng)過納米材料標(biāo)記的羅伊氏乳桿菌經(jīng)口服給藥后能夠?qū)崟r(shí)、無損地檢測(cè)羅伊氏乳桿菌在小鼠體內(nèi)的分布。Martín等[82]報(bào)道了一種用氧化鐵納米粒子標(biāo)記乳酸桿菌的方法，并且磁性在細(xì)菌分裂后還存在。與磁性細(xì)菌不同的是，這種人工磁化的細(xì)菌可以通過調(diào)整細(xì)菌培養(yǎng)條件和磁性納米粒子的數(shù)量來調(diào)節(jié)細(xì)菌的磁性，磁性可進(jìn)行量化，操作便捷?；谛滦图{米材料對(duì)益生菌體內(nèi)分布進(jìn)行示蹤的生物光學(xué)成像技術(shù)具有高度選擇性、敏感性和非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[83]。

3 結(jié) 語

目前，對(duì)乳酸菌在腸道定植的探究已經(jīng)做了很多研究工作，其定植的機(jī)制仍還未完全探明。盡管已有的體外黏附模型有助于乳酸菌在腸道定植機(jī)制的研究，但現(xiàn)有的體外模型還無法可靠地反映乳酸菌在腸道環(huán)境中真實(shí)的定植效果，因此，選擇建立一個(gè)合適的體外定植能力的評(píng)估模型尤為重要。另外，復(fù)雜腸道環(huán)境中各種因素的干擾給乳酸菌在示蹤和定量上帶來很大的挑戰(zhàn)。未來研究的重點(diǎn)可以針對(duì)這些環(huán)境干擾因素開發(fā)各類示蹤技術(shù)和定量方法以及通過與其他組學(xué)結(jié)合進(jìn)行研究，旨在追蹤乳酸菌在復(fù)雜的腸道環(huán)境中定植位點(diǎn)以及精確評(píng)估定植時(shí)間和數(shù)量。另外，還需要與其他學(xué)科結(jié)合，如利用新型納米材料、軟件分析技術(shù)等對(duì)乳酸菌腸道定植機(jī)理進(jìn)行更精確、更大規(guī)模、更加深入的研究。