褪黑素處理對(duì)香菇采后品質(zhì)及活性氧代謝的影響

賈 樂，韓延超，房祥軍，陳杭君，郜海燕

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021）

香菇（Lentinula edodes）是世界第二大食用菌，因其含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等，具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感，同時(shí)還具有降低血糖、血脂水平[1]、抗腫瘤[2]等功能?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是植物體在進(jìn)行正常生理代謝時(shí)產(chǎn)生的一系列性質(zhì)活潑的含氧物質(zhì)的總稱，在整個(gè)貯藏期間，香菇會(huì)不斷產(chǎn)生ROS，但在貯藏前期，由于一系列ROS清除酶活性較強(qiáng)，過多的ROS會(huì)被清除，ROS代謝平衡得以維持；貯藏后期隨著香菇的衰老及外界不良環(huán)境的脅迫，這一代謝平衡被破壞，ROS代謝失衡會(huì)加速細(xì)胞膜脂過氧化進(jìn)程，導(dǎo)致有毒代謝產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）積累，細(xì)胞膜透性升高，進(jìn)而加速采后衰老進(jìn)程，縮短香菇壽命，這給生產(chǎn)和貯運(yùn)造成很大的損失。因此，迫切需要找到安全有效的方法，最大限度地降低香菇貯藏期間ROS的積累、減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，從而有效延長(zhǎng)香菇的貯藏期。褪黑素（melatonin，MT）是一種普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類小分子激素，具有多種細(xì)胞活性和生理活性，它在人類、動(dòng)物和植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要功能。近年研究表明，MT具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、延緩葉片衰老、影響果實(shí)成熟和貯藏等作用[3-4]。MT作為一種安全的吲哚胺分子，不僅可以作為內(nèi)源誘導(dǎo)分子和信號(hào)分子來緩解生物和非生物脅迫，還具有直接的抗氧化活性[5]，MT通過激活機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，直接清除ROS，提高抗氧化物質(zhì)的活性[6]，延長(zhǎng)果蔬采后壽命[7]。研究表明，外源MT處理可以延緩香蕉采后成熟[8]；延緩黃瓜采后貯藏過程中抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和可溶性蛋白含量的下降[9]；通過增強(qiáng)抗氧化酶活性和抑制細(xì)胞膜脂過氧化程度，有效維持桃果實(shí)感官和營養(yǎng)品質(zhì)，提高桃果實(shí)的耐冷性，延長(zhǎng)桃的保質(zhì)期[10-12]；MT處理還可促進(jìn)草莓果實(shí)中苯酚和花色苷的積累，維持草莓采后果實(shí)品質(zhì)，降低草莓采后腐爛率[13]；蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，MT處理可以調(diào)控番茄采后的成熟和衰老，衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)經(jīng)MT處理后發(fā)生下調(diào)表達(dá)，細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)蛋白經(jīng)MT處理后發(fā)生上調(diào)表達(dá)[14]；在木薯上的研究也證明了MT處理通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，降低H2O2積累，從而延遲木薯根采后生理變質(zhì)[15]。這些研究表明，MT作為一種新型、天然、安全的保鮮劑，能夠有效提高果蔬的抗氧化能力，維持果蔬的采后品質(zhì)，具有較好的應(yīng)用前景。然而，將MT應(yīng)用于香菇的保鮮研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究外源MT噴淋處理對(duì)香菇貯藏過程中品質(zhì)變化及活性氧代謝的影響，旨在明確MT對(duì)香菇采后保鮮的作用及相關(guān)生理機(jī)制，為鮮香菇采后貯藏產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮香菇（品種‘901’）購于浙江武義創(chuàng)新食用菌有限公司，挑選大小均一、無開傘、沒有病害和機(jī)械損傷的完整菌菇。

MT 上海源葉生物有限公司；三氯乙酸、福林-酚、甲醛，硫代巴比妥酸（分析純）、鄰菲羅琳、AsA、鹽酸羥胺、三氯化鐵、H2O2、氫氧化鈉 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；羥自由基測(cè)定試劑盒、羰基化蛋白試劑盒 南京建成生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT plus型物性測(cè)定質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司；Hitachi H7650型透射電子顯微鏡 日本日立公司；UV-9000紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Spectra-MAX-M2多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；Fresco17型高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾公司；DDS-307A型電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CR-400手持色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇樣品處理

清除香菇基部栽培基質(zhì)，隨機(jī)分成4 組，每組處理量1.0 kg，3個(gè)重復(fù)，分別使用清水（對(duì)照組）、0.25、0.50、0.75 mmol/L的MT溶液均勻噴灑于香菇表面，每1 kg香菇固定噴灑50 mL MT溶液，置于通風(fēng)處使香菇表面水分完全蒸發(fā)，用聚乙烯包裝袋進(jìn)行分裝。將分裝好的香菇放置于（4±1）℃恒溫箱中貯藏，取樣間隔為7 d，每次將取得的樣品用液氮速凍后放入－50 ℃冰箱，取樣完成后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果取其平均值。

1.3.2 香菇相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 開傘度和色澤的測(cè)定

用游標(biāo)卡尺對(duì)香菇的開傘度進(jìn)行測(cè)定。將香菇卷邊內(nèi)緣的距離（L0）與外緣距離（L1）的比例作為開傘度值，最大開傘度記為1，每組處理隨機(jī)測(cè)定10個(gè)香菇，結(jié)果取其平均值[16]。色澤測(cè)定參考Ganjloo等[17]的方法并加以修改，用手持色差計(jì)測(cè)定。每組隨機(jī)選取10個(gè)香菇對(duì)香菇菌蓋進(jìn)行測(cè)定，記錄色差儀上的L*、a*、b*值，最終結(jié)果取其平均值。按式（1）計(jì)算褐變指數(shù)。

1.3.2.2 硬度與呼吸強(qiáng)度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法并略作修改，選取P/6型不銹鋼探頭，直徑為56 mm，下壓距離5.0 mm，測(cè)前速率2.0 mm/s，測(cè)定速率1.0 mm/s，測(cè)后速率2.0 mm/s，以最大破裂的力作為硬度，每次隨機(jī)選取10個(gè)香菇進(jìn)行測(cè)定，最終結(jié)果取其平均值，單位為kg/cm2。呼吸強(qiáng)度采用堿液吸收法[19]進(jìn)行測(cè)定，單位為mg/（kg·h）。

1.3.2.3 AsA、總酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力的測(cè)定

AsA含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]并稍作修改。稱取1.0 g香菇研磨樣品，加入體積分?jǐn)?shù)5%的三氯乙酸溶液5.0 mL，振蕩混勻，10 000 r/min離心20 min取上清液。吸取0.5 mL上清液于試管中，依次加入1.5 mL三氯乙酸、1.0 mL無水乙醇、0.5 mL 0.5%磷酸-乙醇溶液、1.0 mL 0.5%鄰菲羅啉-乙醇溶液、0.5 mL 0.03%三氯化鐵-乙醇溶液，30℃水浴60 min，以加入蒸餾水代替鄰菲羅啉-乙醇溶液的試管為參照，534 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算AsA含量，結(jié)果以mg/100 g表示。

總酚含量的測(cè)定采用福林-酚法[21]。稱取0.25 g香菇研磨樣品于離心管中，加入1.25 mL乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%），浸提2 h后于10 000r/min離心20 min，取0.2 mL上清液進(jìn)行測(cè)定，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的總酚含量，單位為mg/g。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測(cè)定：稱取0.25 g香菇研磨樣品于離心管中，加入1.25 mL無水乙醇，1 200 r/min離心30 min，取0.1 mL上清液（樣品組），加入2.9 mL的DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），以等量蒸餾水作為空白組，混勻后避光反應(yīng)30 min，以加入2.9 mL無水乙醇為對(duì)照組，分別測(cè)定各組在517 nm處的吸光度，按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除能力。

式中：A0表示空白組在517 nm處的吸光度；A1表示樣品組在517 nm處的吸光度；A2表示對(duì)照組在517 nm處的吸光度。

1.3.2.4 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率與H2O2含量的測(cè)定

超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的測(cè)定參考Li Xiaoan等[22]的方法，以KNO2為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中超氧陰離子產(chǎn)生速率，單位為μmol/（min·g）。H2O2含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]的方法，單位為μmol/g。

1.3.2.5 細(xì)胞膜透性及丙二醛含量的測(cè)定

細(xì)胞膜透性測(cè)定參考Luo Yaguang等[23]的方法并稍作修改，分別從香菇的中心和四周隨機(jī)切取約1 g的香菇片（厚度1 mm），放入50 mL離心管中，加水定容至50 mL。室溫下靜置10 min后用電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率，記為R1/（μS/cm），隨后沸水浴5 min，自然冷卻至冷卻至室溫后再次測(cè)其電導(dǎo)率，記為R2/（μS/cm），根據(jù)公式（3）計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率（relative electric conductivity，REC），用REC表示細(xì)胞膜透性。

MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，具體方法參考文獻(xiàn)[24]并略作修改，取0.25 g香菇研磨樣加入1.5 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，混勻后在4 ℃下10 000 r/mim離心20 min后得上清液，取0.75 mL上清液加入等體積0.67%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫代巴比妥酸溶液，混勻后沸水浴20 min，取出冷卻后離心，分別用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450、532、600 nm處的吸光度，根據(jù)式（4）計(jì)算待測(cè)液中MDA濃度（c），根據(jù)式（5）計(jì)算香菇中MDA含量。

1.3.2.6 羥自由基生成能力及羰基化蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

取0.2 g香菇研磨樣于離心管中，加入1.8 mL生理鹽水，4 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液采用羥自由基測(cè)試盒測(cè)定羥自由基生成能力，單位為U/mL。羰基化蛋白質(zhì)量濃度取上清液后采用羰基化蛋白試劑盒測(cè)定，單位為ng/mL。

1.3.2.7 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

參照趙天鵬[25]的方法略作修改，用戊二醛固定液固定香菇（新鮮香菇、貯藏28 d MT處理組、貯藏28 d對(duì)照組）組織，然后進(jìn)行漂洗，完成后進(jìn)行梯度脫水和滲透，之后用包埋劑處理，并在烘箱中保溫聚合48 h，用超薄切片機(jī)對(duì)香菇組織進(jìn)行切片（70 nm厚），然后用撈樣環(huán)將切片圈起來，用濾紙蘸取氯仿在撈樣環(huán)上方劃過，進(jìn)行熏蒸，熏蒸后置于銅網(wǎng)上，用2%的醋酸雙氧鈾染色10～15 min，漂洗后再用含有氫氧化鈉的檸檬酸鉛染色10～15 min，選擇30 000×放大倍數(shù)，觀察香菇細(xì)胞及線粒體的完整性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS軟件，采用Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT處理對(duì)香菇采后褐變度與亮度的影響

香菇的褐變程度可用褐變指數(shù)表示，L*值代表香菇的亮度。如圖1A所示，在整個(gè)貯藏期間，香菇褐變指數(shù)不斷上升，對(duì)照組褐變指數(shù)始終高于MT處理組。香菇L*值呈下降趨勢(shì)，即香菇亮度不斷下降，如圖1B所示，與其他處理組相比，0.50 mmol/L MT處理組L*值下降最為緩慢，在貯藏至第42天時(shí)，0.25、0.50、0.75 mmol/L MT處理組的L*值分別是對(duì)照組1.61、1.87、1.60 倍，說明MT處理可以抑制香菇褐變，其中0.50 mmol/L MT處理可維持香菇較高的亮度。

圖1 MT處理對(duì)香菇褐變度（A）與L*（B）的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on the browning degree (A) and L* value (B) of shiitake mushrooms

2.2 MT處理對(duì)香菇采后硬度與開傘度的影響

硬度是反映香菇品質(zhì)較為直觀的指標(biāo)之一，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組香菇硬度均呈下降趨勢(shì)，由圖2A可知，在貯藏前期，不同濃度MT處理后的香菇硬度與對(duì)照組無顯著性差異，在貯藏中后期各不同濃度MT處理后的香菇硬度的維持情況比對(duì)照組要好。在貯藏至21 d時(shí)，對(duì)照組的硬度（3.04 kg/cm2）顯著低于0.50 mmol/L MT處理組（6.44 kg/cm2）。香菇的開傘度可以反映香菇的衰老程度，由圖2B可知，香菇開傘度在貯藏期間不斷增加，在貯藏前期，對(duì)照組與各不同濃度MT處理后的香菇無顯著性差異，貯藏21 d后，處理組與對(duì)照組之間的差異逐漸顯現(xiàn)，其中以0.50 mmol/L MT處理組開傘度最低。因此，通過一定濃度的MT處理可以有效保持香菇的硬度并抑制其開傘。

圖2 MT處理對(duì)香菇硬度（A）及開傘度（B）的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on the hardness (A) and cap opening (B) of shiitake mushrooms

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在香菇的采后貯藏過程中，MT處理能夠有效維持香菇表觀品質(zhì)劣變，其中以0.50 mmol/L MT處理效果最為顯著，因此，以下對(duì)實(shí)驗(yàn)均以0.5 mmol/L MT處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較。

2.3 MT處理對(duì)香菇采后呼吸強(qiáng)度的影響

香菇采后呼吸強(qiáng)度是反映其生命活動(dòng)強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，與生物體內(nèi)其他生命活動(dòng)也密切相關(guān)。由圖3可知，在整個(gè)貯藏期間，香菇呼吸強(qiáng)度在貯藏過程中各組之間整體變化趨勢(shì)一致，前期呈先下降后上升的趨勢(shì)，出現(xiàn)呼吸高峰后再下降，在貯藏結(jié)束時(shí)，呼吸強(qiáng)度又上升，前期呼吸強(qiáng)度下降可能由于香菇貯藏溫度的改變（從常溫到低溫）導(dǎo)致，貯藏末期呼吸速強(qiáng)度高可能是由于子實(shí)體受外界微生物侵染，腐爛后釋放出CO2，使測(cè)定的呼吸速率上升。其中0.50 mmol/L MT處理組始終保持在最低水平。貯藏42 d時(shí)，處理組香菇的呼吸強(qiáng)度與對(duì)照組相比降低了44%。

2.4 MT處理對(duì)香菇H2O2含量、超氧陰離子生成速率與羥自由基生成能力的影響

H2O2與超氧陰離子都是細(xì)胞內(nèi)ROS的存在形式，過度積累會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，羥自由基是細(xì)胞內(nèi)ROS的重要組成部分，羥自由基生成能力在一定程度上反映了細(xì)胞內(nèi)ROS代謝強(qiáng)弱，在貯藏期間，香菇細(xì)胞內(nèi)的H2O2含量與超氧陰離子產(chǎn)生速率及羥自由基生成能力均呈上升趨勢(shì)。如圖4A所示，整個(gè)貯藏期間對(duì)照組的H2O2含量始終高于MT處理組，貯藏后期，對(duì)照組H2O2含量上升速率明顯高于0.50 mmol/L MT處理組，貯藏結(jié)束時(shí)，對(duì)照組H2O2含量為0.26 μmol/g，是MT處理組的1.44 倍。由圖4B可知，對(duì)照組超氧陰離子生成速率持續(xù)上升，直至貯藏結(jié)束達(dá)到最高值2.37 mol/（min·g），而MT處理組的超氧陰離子生成速率只在貯藏前期有較明顯的升高，之后便一直保持在較低的水平，在貯藏前期（0～14 d），MT處理組與對(duì)照組之間差異不顯著（P＞0.05），貯藏14 d之后，MT處理組與對(duì)照組之間差異明顯，在貯藏結(jié)束時(shí)，處理組香菇的超氧陰離子的生成速率與對(duì)照組相比分別降低了39.1%。由圖4C可知，在整個(gè)貯藏期間，羥自由基生成能力持續(xù)上升，貯藏末期，對(duì)照組羥自由基生成能力達(dá)到7.16 U/mL，比MT處理組高了32%，且兩者差異極顯著（P＜0.01）。以上說明說明MT處理組可有效緩解香菇體內(nèi)H2O2含量的積累，抑制香菇細(xì)胞的超氧陰離子生成速率和羥自由基生成能力，從而減緩ROS對(duì)細(xì)胞的傷害。

圖4 MT處理對(duì)香菇H2O2（A）、超氧陰離子生成速率（B）及羥自由基生成能力（C）的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on H2O2 content (A),superoxide anion generation rate (B) and hydroxyl radical generation capacity (C) in mushrooms

2.5 褪黑素處理對(duì)香菇細(xì)胞膜透性、MDA含量及羰基化蛋白質(zhì)量濃度的影響

細(xì)胞膜的完整性可以反映細(xì)胞膜的受損程度，而細(xì)胞膜完整性可以通過測(cè)定組織的水浸提液的電導(dǎo)率來反映[26]。由圖5A可知，在貯藏前期，香菇細(xì)胞的REC變化趨勢(shì)較為平緩，0.50 mmol/L MT處理組與對(duì)照組之間沒有顯著差異，貯藏28 d后，對(duì)照組香菇REC急劇上升，在貯藏35 d達(dá)到峰值70.3%，而貯藏35 d的0.50 mmol/L MT處理組REC僅為33.7%，上升緩慢，在貯藏末期時(shí)，MT處理組REC極顯著低于對(duì)照組。說明經(jīng)MT處理的香菇在貯藏期間細(xì)胞膜透性變化較小，可以較好地保持細(xì)胞膜完整性。MDA是細(xì)胞膜脂氧化產(chǎn)物，由圖5B可知，在整個(gè)貯藏期間，各組MDA含量變化趨勢(shì)較為一致，0.50 mmol/L MT處理組MDA含量始終顯著或極顯著低于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）。以上結(jié)果說明，0.50 mmol/L MT處理可有效保持香菇細(xì)胞膜的完整性，減少細(xì)胞電解質(zhì)外泄，抑制膜脂過氧化，從而延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。羰基化蛋白是ROS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物，其含量可用來反映細(xì)胞的氧化損傷程度。由圖5C可知，羰基化蛋白質(zhì)量濃度在貯藏前期急劇上升，貯藏中后期變化趨勢(shì)較為平緩，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照組的羰基化蛋白質(zhì)量濃度始終高于MT處理組，說明MT處理可有效降低香菇細(xì)胞內(nèi)蛋白氧化損傷程度。

圖5 MT處理對(duì)香菇REC（A）、MDA含量（B）及羰基化蛋白質(zhì)量濃度（C）的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on the relative conductivity (A),MDA (B) content and carbonylated protein content (C) of shiitake mushrooms

2.6 褪黑素處理對(duì)香菇AsA與總酚含量及DPPH自由基清除能力的影響

AsA與總酚與香菇的抗氧化性密切相關(guān)[27]。由圖6A可知，香菇AsA含量在貯藏期間呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，貯藏前期AsA含量下降可能與子實(shí)體品質(zhì)劣變相關(guān)，后期AsA含量上升可能與菇體失水有關(guān)[28]。在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照組AsA含量始終低于MT處理組。如圖6B所示，在貯藏前期，由于香菇采后的生長(zhǎng)發(fā)育，各組香菇中總酚含量呈上升趨勢(shì)，隨后各組的總酚含量又開始下降，貯藏第42天時(shí)，0.50 mmol/L MT處理組總酚含量較對(duì)照組提高了1.37 倍。DPPH自由基清除能力可以較為直觀地展現(xiàn)香菇的抗氧化能力，自由基清除率越高，表明果實(shí)的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖6C可知，整個(gè)貯藏期間，處理組與對(duì)照組的DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，MT處理組下降趨勢(shì)較為緩慢，在貯藏第35天時(shí)，MT處理組DPPH自由基清除能力是對(duì)照組的1.17 倍，且直到貯藏結(jié)束，MT處理組DPPH自由基清除能力始終高于對(duì)照組。

圖6 MT處理對(duì)香菇AsA含量（A）和總酚含量（B）及DPPH自由基清除力能力（C）的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the contents of ascorbic acid (A)and total phenols (B) and DPPH radical scavenging capacity (C) in shiitake mushrooms

2.7 細(xì)胞壁及線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

線粒體呼吸鏈上的電子泄漏是機(jī)體內(nèi)ROS的主要來源[29]，因此線粒體形態(tài)與香菇ROS代謝之間關(guān)系密切。由圖7A可知，新鮮香菇線粒體形態(tài)飽滿，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)豐富，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，無破損現(xiàn)象，細(xì)胞壁邊界清晰。貯藏28 d后，對(duì)照組線粒體降解，線粒體膜損傷，內(nèi)部基質(zhì)降解成絮狀物質(zhì)，細(xì)胞壁完全降解（圖7B）；而MT處理組細(xì)胞壁雖發(fā)生降解，但其結(jié)構(gòu)仍能觀察到，線粒體結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)容物無滲出現(xiàn)象（圖7C)，說明MT處理可有效維持香菇線粒體結(jié)構(gòu)的完整，延緩細(xì)胞壁的降解。

圖7 MT處理對(duì)貯藏香菇細(xì)胞壁及線粒體形態(tài)的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on cell wall and mitochondrial morphology of shiitake mushrooms

3 討 論

香菇采后極易失水、腐爛、變質(zhì)，嚴(yán)重影響其商品價(jià)值和食用品質(zhì)。MT作為一種無毒無害的新型保鮮劑，現(xiàn)已成為果蔬采后保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?；钚匝踔饕诠夂献饔门c呼吸作用的電子傳遞鏈傳遞過程中產(chǎn)生，因香菇中沒有葉綠體，故香菇中ROS主要在線粒體中產(chǎn)生。目前已知線粒體呼吸鏈上的電子泄露是機(jī)體內(nèi)ROS的主要來源[30]。采后ROS在果蔬體內(nèi)的主要存在形式為羥自由基、超氧陰離子、H2O2等[31]。旺盛的呼吸作用會(huì)消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，釋放呼吸熱與水分，造成高溫高濕的環(huán)境，加速采后香菇品質(zhì)的劣變。本研究發(fā)現(xiàn)，MT處理可以有效降低貯藏期間香菇的呼吸強(qiáng)度，延緩香菇子實(shí)體硬度和色澤的下降，降低香菇的開傘度，維持香菇的表觀品質(zhì)，0.50 mmol/L MT處理組效果最為顯著；然而，辛丹丹等[32]研究表明，以0.10 mmol/L MT處理，能顯著延緩黃瓜品質(zhì)和抗氧化能力的下降，不同種類果蔬的MT有效處理濃度和方式存在不同，這可能是作用對(duì)象與作用方式（浸漬與噴淋）不同。MT處理還能減少細(xì)胞內(nèi)H2O2含量的積累，降低超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率及羥自由基生成能力，通過降低活性氧代謝產(chǎn)物的生成速率減輕活性氧對(duì)細(xì)胞造成的傷害。黃鴻暉等[33]研究發(fā)現(xiàn)，MT處理可有效抑制草莓的H2O2積累及降低超氧陰離子生成速率，與本研究結(jié)果一致。ROS的積累可促進(jìn)采后果實(shí)的衰老，加速膜脂過氧化進(jìn)程與蛋白質(zhì)氧化程度，導(dǎo)致脫氧核糖核酸鏈的斷裂，影響正常的堿基修飾及基因表達(dá)調(diào)控[34]。總酚與AsA在ROS非酶促清除系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[35]，在整個(gè)貯藏期間，MT處理組香菇體內(nèi)的總酚含量和AsA含量始終高于對(duì)照組，在對(duì)MT處理大棗[36]和芒果[37]中也得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這可能與MT是一種強(qiáng)抗氧化劑和自由基清除劑有關(guān)，可以直接對(duì)ROS進(jìn)行清除[38]。自由基清除能力能直觀反映果蔬的抗氧化能力[39]，MT處理組DPPH自由基清除能力始終顯著高于對(duì)照組，MT處理組通過增強(qiáng)自由基的清除能力，減少了細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，延緩了膜脂過氧化進(jìn)程，減少了細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)MDA的產(chǎn)生，維持完整的膜結(jié)構(gòu)，從而維持香菇采后品質(zhì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，MT處理可有效抑制香菇體內(nèi)羰基化蛋白質(zhì)量濃度的上升，延緩香菇線粒體的降解，維持正常線粒體形態(tài)。香菇體內(nèi)ROS的主要產(chǎn)生部位是線粒體[40]。ROS的積累對(duì)線粒體蛋白質(zhì)造成氧化損傷，導(dǎo)致線粒體各組成部分功能障礙，最終加速衰老[41]。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度范圍的MT處理對(duì)香菇表觀品質(zhì)的維持具有積極作用，與0.25、0.75 mmol/L MT處理相比，0.50 mmol/L MT處理能更好地維持香菇的硬度、色澤與開傘度等表觀品質(zhì)，抑制呼吸強(qiáng)度及開傘度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，0.50 mmol/L MT處理香菇可以有效降低羥自由基生成能力和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率，減少細(xì)胞內(nèi)H2O2、羰基化蛋白及MDA積累，維持細(xì)胞膜的完整性，同時(shí)能夠延緩其體內(nèi)總酚和AsA等抗氧化物質(zhì)含量的下降，提高DPPH自由基清除能力，提高機(jī)體的抗氧化能力，超微電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)MT處理能夠有效維持香菇細(xì)胞線粒體的完整性。綜上，0.50 mmol/L MT處理可有效維持香菇貯藏品質(zhì)，降低ROS代謝對(duì)細(xì)胞造成的損傷，延長(zhǎng)香菇貯藏保鮮時(shí)間。