黃花倒水蓮總皂苷抗凝血和抗血栓作用及機(jī)制：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

劉育鋮，毛思宇，李 昱，胡倩梅，鄒 輝，馮 星,*

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013；2.湖南師范大學(xué) 小分子靶向藥物研究與創(chuàng)制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410013）

黃花倒水蓮（Polygala fallaxHemsl，PFH）為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬黃花倒水蓮的干燥根，在湖南省內(nèi)資源豐富，具有補(bǔ)益氣血、健脾利濕、活血調(diào)經(jīng)等功能，可用于急性慢性肝炎、跌打損傷、腰膝酸軟、病后體弱等疾病的治療，還具有一定的抗衰老作用，為少數(shù)民族瑤族的常用藥物，是南方傳統(tǒng)的藥食同源植物，民間常用其根部來燉煮肉類進(jìn)行食療[1-2]。PFH主要成分可大致分為皂苷類、山口酮類、有機(jī)酸類和脂類等[3-5]，目前關(guān)于PFH的研究表明其藥理作用主要有以下4個(gè)方面：1）調(diào)血脂：黃花倒水蓮總皂苷（total saponin ofPolygala fallaxHemsl，PTS）降低高脂血癥病人機(jī)體內(nèi)甘油三酯、總膽固醇以及低密度脂蛋白的含量，提高高密度脂蛋白含量[6-7]；2）抗凝：PFH水提取液可增加家兔的血漿復(fù)鈣時(shí)間、部分凝血活酶時(shí)間，同時(shí)可以抑制小鼠的足跖腫脹；3）抗氧化：口山酮類成分可以明顯降低小鼠肝臟中過氧化脂質(zhì)含量，對小鼠血液細(xì)胞中超氧化物歧化酶的活性提升有一定作用；4）抗癌：PFH乙酸乙酯提取物可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并促進(jìn)其凋亡[8-10]。目前，關(guān)于PFH的臨床應(yīng)用主要為：PFH熬制成的口服液治療原發(fā)性的高脂血癥，黃花參肝舒袋、白蓮湯治療慢性乙型肝炎[11-12]；而關(guān)于其抗凝血活性的相關(guān)應(yīng)用鮮見報(bào)道。PFH為少數(shù)民族特色藥材，其價(jià)值沒有獲得充分的開發(fā)與利用，且已有初步研究表明PFH水煎液具有抗凝血效果，但未作深入探討，通過對PFH的化學(xué)成分、抗凝血作用及其機(jī)制的研究，為后續(xù)研究開發(fā)新型的抗凝血、抗血栓藥物奠定基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)結(jié)合多種學(xué)科的綜合概念，英國科學(xué)家Hopkins于2007年第一次解釋了其概念[13-15]，這是一種對系統(tǒng)機(jī)制研究、藥物療效評估和藥物開發(fā)設(shè)計(jì)的科學(xué)研究方法[16]。王林海等[17]運(yùn)用了網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的相關(guān)概念，對蛋白質(zhì)、基因與藥物之間互相影響關(guān)系進(jìn)行了集中分析，他們發(fā)現(xiàn)許多與疾病相關(guān)聯(lián)的蛋白和藥物之間的影響關(guān)系不全是直接的，也有部分是通過間接作用來發(fā)揮其療效。中草藥多組分、多靶點(diǎn)及其各組分共同作用的特點(diǎn)使之成為了一個(gè)復(fù)雜的體系[18-20]，其信息量巨大，具有復(fù)雜的成分、豐富的靶點(diǎn)和龐大的系統(tǒng)，想從混合物的系統(tǒng)上展開其對人體影響的研究有著諸多難點(diǎn)。而將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和中草藥相結(jié)合的研究方法則順應(yīng)了兩者之間的核心思想，探究事物的角度都是從事物之間的互相聯(lián)系這一要點(diǎn)出發(fā)[21-22]。充分利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的層層關(guān)系建立成分-靶點(diǎn)-通路-疾病模型，可對傳統(tǒng)中草藥的配伍、組方、君臣佐使規(guī)律、作用靶點(diǎn)的識別和藥效學(xué)物質(zhì)理論基礎(chǔ)進(jìn)行科學(xué)合理的解釋，為復(fù)雜中草藥系統(tǒng)的研究、臨床前治療方案的研究提供了新的思路和方法[23]。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

無特定病原體級遠(yuǎn)交群（sprague dawley，SD）大鼠，日齡56～59 d，生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。

PFH藥材采摘自湖南省郴州市桂東縣，經(jīng)由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系盛習(xí)鋒副教授鑒定為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬PFH的干燥根。

正常凝血質(zhì)控血漿、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）試劑盒、CaCl2、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）試劑盒、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）試劑盒 德國TECO GmbH公司；NaOH 天津市大茂化學(xué)試劑廠；Tris-HCl 美國Amresco公司；低分子肝素 法國Sanofi-Aventis公司；磺達(dá)肝癸鈉 英國Glaxo Smithkline公司；肝素Anti-FIIa試劑盒、肝素Anti-FXa試劑盒 法國Hyphen Bio Med公司；復(fù)方血栓通膠囊 廣東眾生藥業(yè)股份有限公司；FeCl3溶液上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、水合氯醛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫公司；MC-4000血液凝固分析儀 德國Teco GmbH公司；Vortex Genie漩渦振蕩器 美國Scientific Industries公司；ELx 808酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；XS 105DU電子天平美國Mettler Toledo公司；100～1 000 μL移液槍 德國Eppendorf公司；500T標(biāo)準(zhǔn)型血凝杯 德國Teco GmbH公司；JB-P5包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機(jī) 日本徠卡（上海）公司；Eclipse ci正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng) 日本尼康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PTS的提取

通過熱回流法提取PTS，將PFH根部粉末按照1∶30的料液比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，于回流提取裝置（65 ℃、250 W、50 kHz）提取1 h，提取2 次，合并提取液，旋蒸后溶于去離子水中，并依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。將正丁醇餾分溶于去離子水中，通過D101大孔樹脂柱，用去離子水-不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液梯度洗脫，得到20%、70%、95%乙醇組分以及水組分的PTS提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸儀回收乙醇后置于冷凍干燥機(jī)中揮干水分，即得PTS干燥粉末，之后進(jìn)行含量測定。

1.3.2 PTS中皂苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

樣品處理：精密稱取PTS 5 mg，用無水甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶內(nèi)，定容至刻度，搖勻，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的樣品儲備液。

對照品處理：精密稱取PTS中皂苷A對照品1 mg，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，搖勻，用甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對照品儲備液。再從儲備液中分別吸取20、50、100、150、200 μL于10 mL容量瓶中，搖勻并定容至刻度，獲得PFH中皂苷A對照品溶液。

色譜條件：流動相：乙腈與0.05%磷酸（40∶60，V/V），檢測波長：210 nm，進(jìn)樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫40 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別吸取對照品溶液各10 μL進(jìn)樣測定。以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。再吸取樣品溶液10 μL進(jìn)樣測定并計(jì)算出PTS中的皂苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測PTS有效成分的作用靶點(diǎn)

以PFH、Polygala fallaxHemsl、黃花遠(yuǎn)志等關(guān)鍵詞在TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、ChEMBL（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）、Chemistry Database（http://www.organchem.csdb.cn）、中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）等數(shù)據(jù)庫以及現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中查詢PFH的相關(guān)成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)，將上述成分結(jié)構(gòu)式的Mol2文件上傳至靶點(diǎn)預(yù)測工具Swiss（http://www.swisstargetprediction.ch）和DrugBank（https://www.drugbank.ca）得到每個(gè)成分所對應(yīng)的一系列可能靶點(diǎn)以及每個(gè)靶點(diǎn)的Uniport編碼（Uniport ID）、自由度（Degree）、相關(guān)疾病和相關(guān)通路，并保存為Excel文件。然后將上述有效成分的靶點(diǎn)代入String工具中，得到PTS的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進(jìn)行京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體（gene ontology，GO）分類生物學(xué)過程分析。以FII和PTAFR為關(guān)鍵詞，在KEGG（https://www.kegg.jp/）搜索，將檢索得到的通路圖重新組合，得到凝血因子II（coagulation factor II，F(xiàn)II）和血小板活化因子受體（platelet activating factor receptor，PTAFR）的凝血機(jī)制通路圖。

1.3.4 APTT、TT、PT的測定

APTT、TT、PT測定均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，該方法中以低分子肝素和黃達(dá)肝葵鈉作為PTS的對照品，以Tris-HCl緩沖溶液作為空白對照。

1.3.5 FIIa、FXa活力測定

抗凝血酶存在下FIIα、輔因子X（cofactor X，F(xiàn)X）α活力的測定：分別按照肝素Anti-FIIa試劑盒和肝素Anti-FXa試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.6 大鼠頸總動脈血栓模型的建立及血栓形成抑制率測定

分組：36 只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為：A組：不進(jìn)行誘導(dǎo)處理的空白組（等劑量羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液）；B組：通過FeCl3誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生動脈血栓且不進(jìn)行藥物處理的模型組（等劑量CMC-Na溶液）；C組：血栓通膠囊組（60 mg/kg）；D組：低劑量PTS（low concentration of PTS，PTS-LD）組（30 mg/kg）；E組：中劑量PTS（medium concentration of PTS，PTS-MD）（60 mg/kg）組；F組：高劑量PTS（high concentration of PTS，PTSHD）（120 mg/kg），每組6 只。各組藥物分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% CMC-Na溶解至所需質(zhì)量濃度。

給藥方式：灌胃給藥，1 mL/100 gmb，每日1 次，連續(xù)15 d。

FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓模型：參照文獻(xiàn)[24-28]并加以改進(jìn)，最后一次給藥1 h后對大鼠實(shí)施腹腔麻醉，進(jìn)行頸總動脈血栓造模，沿頸正中線切開1～2 cm，鈍性分離左側(cè)頸總動脈2.5 cm，放置無菌手術(shù)巾（3 cm×2 cm）于血管下方防止FeCl3損傷血管及其周圍組織，將吸有2.2 mol/L FeCl3溶液的濾紙條（1.5 cm×1.0 cm）環(huán)繞包裹并緊貼住暴露的頸動脈段，空白組放置生理鹽水濾紙條，等待15 min后取下濾紙條（從濾紙條環(huán)裹后立即開始記錄時(shí)間），精確剪下形成血栓位置處的血管。取下形成血栓的血管，用濾紙輕輕擦拭，擦干后于電子天平逐個(gè)稱出其質(zhì)量，按下式計(jì)算其血栓形成抑制率（inhibition ratio，IR）。

稱質(zhì)量后立即將血管放于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛試劑中24 h進(jìn)行固定，取出后用流水沖洗4 h，制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，通過顯微鏡觀察血栓結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 11.5和GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用One-Way ANOVA方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

縮小網(wǎng)店服務(wù)范圍的面積，增加一定網(wǎng)店的數(shù)量，來進(jìn)行網(wǎng)點(diǎn)的擴(kuò)張。通過網(wǎng)點(diǎn)拆分方法，原來一個(gè)網(wǎng)點(diǎn)所負(fù)責(zé)的服務(wù)范圍現(xiàn)在由多個(gè)新網(wǎng)點(diǎn)來服務(wù)，原來的網(wǎng)點(diǎn)小了，但是服務(wù)范圍擴(kuò)張了，配送的效率也提升了，可以有效解決網(wǎng)點(diǎn)覆蓋區(qū)域不夠廣泛的問題，減少了人員和資源的浪費(fèi)，節(jié)約了資本，提高了服務(wù)水平。并撤銷布局失誤和市場資源匱乏以及在市場競爭中被淘汰的網(wǎng)點(diǎn)，合并那些布局不合理，但還擁有一部分市場資源的網(wǎng)點(diǎn)，優(yōu)化企業(yè)管理，提高企業(yè)運(yùn)行效率和企業(yè)競爭力。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTS中皂苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖1A、B可知，峰1和峰2均為皂苷A。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖1C）計(jì)算得出，樣品中皂苷A質(zhì)量濃度為8.365 7 μg/mL，即該批次PTS中皂苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.673%。

圖1 PTS中皂苷A的HPLC圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 HPLC chromatograms of saponin A in PTS and calibration curve for determination of saponin A

2.2 PTS的有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過一系列數(shù)據(jù)庫分析獲得PFH的52 種已知成分，以口服生物利用率≥30%或藥物相似性≥0.18、藥物對小腸上皮細(xì)胞通透性≥0.4為指標(biāo)篩選出20 種有效成分。通過Swiss等數(shù)據(jù)庫，尋找PTS的有效成分對應(yīng)靶點(diǎn)。其中FII和PTAFR的自由度較高，自由度越高說明中藥成分與其之間的聯(lián)系越緊密，預(yù)測成為有效靶點(diǎn)的可能性和準(zhǔn)確性也越高，并且兩者都是凝血相關(guān)通路上的主要目標(biāo)靶點(diǎn)，所以將PTS有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)Excel文件導(dǎo)入Cytoscape 3.4.2軟件并利用該軟件繪制出PTS的有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。靶點(diǎn)自由度與圖形的面積成正相關(guān)關(guān)系，即圖形面積越大，靶點(diǎn)自由度越高，靶點(diǎn)預(yù)測的準(zhǔn)確性越高。

圖2 PTS有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 C-T network diagram of PTS and targets

2.3 PTS的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將20 種有效成分的靶點(diǎn)代入Sting工具中，得到PTS的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），并進(jìn)行KEGG通路富集分析和GO分析富集生物學(xué)過程分析，其中FII和PTAFR參與的KEGG通路主要有補(bǔ)體及凝血級聯(lián)反應(yīng)通路、血管平滑肌收縮相關(guān)通路以及鈣離子信號通路等，研究目標(biāo)參與的生物學(xué)過程主要有細(xì)胞表面受體信號通路、細(xì)胞增殖的調(diào)控以及代謝過程等。

圖3 PTS蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Protein-protein interaction network diagram of PTS

2.4 PTS的抗凝血機(jī)制通路

以FII和PTAFR為關(guān)鍵詞，在KEGG數(shù)據(jù)庫中搜索，將得到的通路圖重新組合，得到FII和PTAFR對應(yīng)的凝血機(jī)制通路圖（圖4）?；罨腇II可連接并切割蛋白酶活化受體（protease activated receptors，PAR）1和PAR4，活化的FII還可以直接和凝血調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，將蛋白C從酶原形式激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨鞍證，在Ca2+存在下可大大加快其激活過程，說明FII可能為PTS發(fā)揮抗凝血作用聯(lián)系最緊密、可能性最大的靶點(diǎn)。

圖4 PTS抗凝血機(jī)制通路圖Fig. 4 Pathway diagram for the anticoagulation mechanism of PTS

2.5 PTS存在情況下對APTT的影響

由表1可知，空白對照組APTT為（33.47±0.38）s。在4～32 μg/mL低分子肝素和8～128 μg/mL磺達(dá)肝癸鈉對APTT有影響。由表2可知，在0～2 mg/mL范圍內(nèi)，PTS可劑量依賴性地延長質(zhì)控血漿APTT。對樣品（低分子肝素、黃達(dá)肝葵鈉、PTS）終質(zhì)量濃度與APTT進(jìn)行線性擬合，并由擬合方程計(jì)算延長一倍APTT所需樣品質(zhì)量濃度，其結(jié)果見表3，人質(zhì)控血漿APTT延長一倍所需的低分子肝素、黃達(dá)肝葵鈉、PTS質(zhì)量濃度分別為9.90、87.11 μg/mL和0.36 mg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度低分子肝素和磺達(dá)肝癸鈉存在下APTT檢測結(jié)果Table 1 APTTs of different concentrations of low-molecular-mass heparin and fondaparinux sodium

表2 不同質(zhì)量濃度PTS存在下APTT檢測結(jié)果Table 2 APTTs in the presence of different concentrations of PTS

表3 不同化合物抗凝血活性APTT檢測結(jié)果Table 3 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to APTTs

2.6 PTS存在情況下對TT的影響

由表4可知，空白對照組TT為（9.53±0.58）s。2～24 μg/mL的低分子肝素和8～128 μg/mL的磺達(dá)肝癸鈉對TT有影響。由表5可知，在0～2 mg/mL范圍內(nèi)，PTS可劑量依賴性地延長質(zhì)控血漿TT。對樣品終質(zhì)量濃度與TT均值進(jìn)行線性擬合，并由擬合方程計(jì)算延長一倍TT所需樣品質(zhì)量濃度，結(jié)果見表6，人質(zhì)控血漿TT延長一倍所需的低分子肝素、PTS質(zhì)量濃度分別為5.01 μg/mL、0.14 mg/mL。

表4 不同質(zhì)量濃度低分子肝素和磺達(dá)肝癸鈉存在下TT檢測結(jié)果Table 4 TTs in the presence of different concentrations of lowmolecular-mass heparin and fondaparinux sodium

表5 不同質(zhì)量濃度PTS存在下TT檢測結(jié)果Table 5 TTs in the presence of different concentrations of PTS

表6 不同化合物抗凝血活性TT檢測結(jié)果Table 6 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to TTs

2.7 PTS存在情況下對PT的影響

表7 不同質(zhì)量濃度低分子肝素、磺達(dá)肝癸鈉和PTS存在下PT檢測結(jié)果Table 7 PTs in the presence of different concentrations of lowmolecular-mass heparin, fondaparinux sodium and PTS

表8 不同化合物抗凝血活性PT檢測結(jié)果Table 8 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to PTs

2.8 PTS對FIIa和FXa活力的影響

低分子肝素對抗凝血酶依賴的FXa活力半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）為（51.63±2.02）μg/mL，PTS對FXa的活力無影響（表格未列出）。由表9和圖5可知，低分子肝素對抗凝血酶依賴的FIIa活力IC50為（0.06±0.00）μg/mL，隨著低分子肝素、PTS質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)IIa活力逐漸減小，PTS可劑量依賴性地抑制FIIa的活力，其IC50為（85.88±12.50）μg/mL，說明PTS是通過抑制FIIa活力即凝血酶活性來發(fā)揮其抗凝血作用。

表9 PTS對FIIa活力的影響Table 9 Effect of PTS on FIIa activity

圖5 FIIa相對活力與樣品質(zhì)量濃度的線性擬合曲線Fig. 5 Linear fitting curve between relative FIIa activity and sample concentration

2.9 PTS對FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓模型的影響

由圖6及表10可知，空白組頸部總動脈血管腔內(nèi)無血栓結(jié)構(gòu)形成，血栓面積率為0.05%，如綠色箭頭所指，血管各層膜結(jié)構(gòu)明顯。模型組血管腔內(nèi)明顯可見有閉塞性血栓結(jié)構(gòu)形成，血管組織結(jié)構(gòu)異常，管腔內(nèi)可見大量混合血栓，導(dǎo)致管腔狹窄，紅色箭頭所示為大量纖維蛋白，黑色箭頭所示為紅細(xì)胞及少量血小板，動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，中膜顯著變薄，結(jié)構(gòu)不明顯，血栓面積率為86.85%。與模型組相比，PTS-LD和PTS-MD組血管腔內(nèi)血栓結(jié)構(gòu)有略微程度的減少，血栓面積率分別為78.84%和72.79%，而血栓通膠囊組和PTS-HD組血管腔內(nèi)中可看出血栓結(jié)構(gòu)較模型組明顯減少，血栓面積率分別為50.69%和43.51%。PTS-LD和PTS-MD組對血栓形成的抑制率較低，分別為13.6%和16.2%，血栓通膠囊組和PTS-HD組對血栓形成有顯著的抑制效果，其抑制率為39.7%和47.4%。

表10 各組藥物對FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓模型的影響Table 10 Inhibitory effect of tested drugs on FeCl3-induced common carotid artery thrombosis in rats

圖6 各組藥物對大鼠血栓影響的蘇木精-伊紅染色切片圖（100×）Fig. 6 Effect of tested drugs on rat thrombosis (100 ×)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)找到52 種已知的PFH成分，篩選出20 種有效成分。以這些成分為基礎(chǔ)，得到PTS的有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)PTS對FII和PTAFR兩個(gè)靶點(diǎn)有作用，通過蛋白-蛋白相互作用圖發(fā)現(xiàn)FII和PTAFR兩個(gè)靶點(diǎn)主要參與凝血級聯(lián)等反應(yīng)通路，得到的FII和PTAFR對應(yīng)的凝血機(jī)制通路圖，進(jìn)一步說明FII可能為PTS發(fā)揮抗凝血作用聯(lián)系最緊密、可能性最大的靶點(diǎn)。

體外凝血3 項(xiàng)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度2～32 μg/mL范圍內(nèi)，低分子肝素對APTT和TT的影響較大，對PT無顯著影響，其延長人質(zhì)控血漿APTT、TT一倍所需質(zhì)量濃度分別為9.90 μg/mL和5.01 μg/mL，與對照組相比，其對內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑影響較大，不影響外源性凝血途徑。在質(zhì)量濃度8～128 μg/mL范圍內(nèi)，磺達(dá)肝癸鈉僅對APTT有顯著影響，對TT和PT均無影響，其延長人質(zhì)控血漿APTT一倍所需質(zhì)量濃度為87.11 μg/mL，與對照組相比僅對內(nèi)源性凝血途徑有影響，對共同凝血途徑和外源性凝血途徑?jīng)]有影響。上述研究結(jié)果與現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果[29-31]一致，在質(zhì)量濃度0～2 mg/mL范圍內(nèi)，PTS對APTT、TT有顯著影響，可以劑量依賴性地延長人質(zhì)控血漿的APTT和TT，對PT無影響，其倍增人質(zhì)控血漿APTT、TT所需質(zhì)量濃度分別為0.36 mg/mL和0.14 mg/mL，與對照組相比，PTS是通過影響內(nèi)源性和共同凝血途徑來體現(xiàn)其抗凝效果的。體外FIIa和FXa活力檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTS對FXa活力無影響，可劑量依賴性地抑制FIIa活力，其IC50為（85.88±12.50）μg/mL。

體內(nèi)FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓模型影響的檢測結(jié)果表明PTS-HD組可顯著抑制大鼠頸總動脈血栓的形成，其血栓面積率為43.51%，抑制率為47.4%，抑制效果優(yōu)于已上市陽性對照藥血栓通膠囊組（血栓面積率為50.69%，抑制率為39.7%），說明PTS可以抑制FeCl3誘導(dǎo)的大鼠頸總動脈血栓形成。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測PTS的抗血栓作用是基于對凝血系統(tǒng)的抑制作用，即通過抑制凝血酶FIIa的活力從而抑制纖維蛋白凝塊和局部血凝塊形成來發(fā)揮抗凝血、抗血栓作用。

PTS的抗凝血活性已有前期的研究基礎(chǔ)，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTS的抗凝血、抗血栓作用，并首次發(fā)現(xiàn)其抗凝血作用的靶點(diǎn)為內(nèi)源性凝血途徑上的FIIa。在后續(xù)的研究計(jì)劃中，本課題組將嘗試提取分離出總皂苷含量更高的PTS并分離制備出一系列單一的皂苷類化合物，以期得到未見報(bào)道的新皂苷類化合物以及探究單一皂苷類化合物是否較PTS具有更強(qiáng)更有效的抗凝血活性。