10-羥基癸烯酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、周期阻滯及遷移抑制的機(jī)制

臧延青，鞠雪瑩，翟雨晴，姚 笛，朱 磊，王長(zhǎng)遠(yuǎn),2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

肝癌又稱為肝細(xì)胞癌，具有惡性程度強(qiáng)、致死率高、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、預(yù)后差的特點(diǎn)[1-2]。在全球范圍內(nèi)，肝癌在癌癥發(fā)病率和致死率中分別位于第5位和第2位[3]，其中，我國(guó)肝癌致死率占全球50%以上[4]。肝癌常見(jiàn)的化學(xué)治療藥物主要有順鉑、洛鉑和5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）等，治療效果較好，但存在價(jià)格昂貴、毒副作用強(qiáng)及耐藥性高等諸多問(wèn)題，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，開發(fā)高效、安全、低毒的潛在天然抗肝癌輔助藥物或功能因子已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。有研究表明，大豆異黃酮能夠預(yù)防肝細(xì)胞癌變、抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5]；苦參堿具有促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用[6]。

凋亡是細(xì)胞自主調(diào)節(jié)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生理過(guò)程，由線粒體功能障礙和半胱天冬酶（Caspases）的特異性激活介導(dǎo)[7]，具有細(xì)胞核改變、細(xì)胞皺縮、DNA斷裂等特征，由Caspase-3的裂解啟動(dòng)和多種信號(hào)通路觸發(fā)[8]。凋亡途徑通過(guò)不同的信號(hào)通路被激活，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3和核因子（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路[9]，其中，MAPK信號(hào)通路（由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）、C-Jun氨基末端激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）和P38組成）在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡和細(xì)胞周期阻滯中起重要作用[10]；STAT3信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的重要轉(zhuǎn)錄因子，也被認(rèn)為是許多癌細(xì)胞的致病因子和治療靶點(diǎn)[11-12]；NF-κB信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲，激活NF-κB可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[13]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）平衡對(duì)細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能有著重要作用，并參與各種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，與癌細(xì)胞的存活、增殖和遷移密切相關(guān)[14]。多項(xiàng)研究表明，ROS通過(guò)調(diào)控MAPK、NF-κB和STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15-16]。

10-羥基癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）又稱為王漿酸，是蜂王漿中特有的有機(jī)酸類化合物[17]，具有抗菌消炎[18]、增強(qiáng)免疫力[19]、抗腫瘤[20]、抗輻射[21]、抗抑郁[22]等多種生物活性。Miyata等[23]闡明蜂王漿及其主要成分可通過(guò)調(diào)控多種腫瘤相關(guān)因子抑制腫瘤生長(zhǎng)和癌細(xì)胞侵襲。陳立軍等[24]通過(guò)噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂王漿能促進(jìn)瘤組織壞死和細(xì)胞凋亡，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。Yang Yuanchang等[25]通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10-HDA在體外對(duì)人結(jié)腸癌WiDr細(xì)胞具有抗炎活性，同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平有抑制作用。鄭錦芬等[26]通過(guò)細(xì)胞增殖活性測(cè)定、ROS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-HDA具有毒性作用，可導(dǎo)致細(xì)胞衰老和ROS水平升高，證實(shí)了10-HDA調(diào)控ROS水平是其發(fā)揮抗癌作用的重要方式。而癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，可調(diào)控MAPK、STAT3和非受體型酪氨酸蛋白激酶（janus kinase，JAK）2信號(hào)通路，引發(fā)Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯作用[27]。

10-HDA對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的抑制作用已得到了證實(shí)，但其誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和抑制遷移的功效研究鮮見(jiàn)報(bào)道，其作用機(jī)制尚不清楚。本研究從分子水平上，研究10-HDA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞周期阻滯、ROS水平調(diào)控的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和抑制細(xì)胞遷移作用，探討MAPK、NF-κB、STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用機(jī)制，揭示10-HDA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的作用靶點(diǎn)，為肝癌發(fā)病機(jī)理的研究及功能性食品開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、Huh7） 中科院上海細(xì)胞庫(kù)；3 種正常細(xì)胞株（L-02、IMR-90、GES-1）上海賽齊生物工程有限公司；10-HDA（純度≥98%）成都瑞芬思生物科技有限公司； 5-FU、JNK抑制劑、P38抑制劑、ERK抑制劑 美國(guó)MedChem Express公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素（penicillin/streptomycin，P/S）及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國(guó)Sigma公司；一抗、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔、抗鼠免疫球蛋白G北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光試劑ECL美國(guó)Thermo公司；2’,7’-二氯二氫熒光素二酯（2’,7’-dic hlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧熒光探針、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒、DNA含量檢測(cè)試劑盒（細(xì)胞周期）、Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、核蛋白提取試劑盒北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；390302型倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司；SynergyHTX型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；EVOS FL型全自動(dòng)智能成像系統(tǒng) 美國(guó)Life Technology公司；FACS Calibvr型流式細(xì)胞儀 美國(guó)貝克曼公司；PowerPac型電泳儀、170-3940型半干轉(zhuǎn)印儀、Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌HepG2、Hep3B、Huh7細(xì)胞、正常肺IMR-90細(xì)胞及正常胃GES-1細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM（10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）FBS、1% P/S），正常肝L-02細(xì)胞的培養(yǎng)基為RPMI 1640（10% FBS、1% P/S），在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行分瓶。

1.3.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用含1% FBS的培養(yǎng)液饑餓處理2 h，加入用DMSO溶解的5-FU或10-HDA，使其終濃度分別為0、1、3、10、30、100 μmol/L，每組有8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量490 nm處各孔吸光度，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：OD實(shí)驗(yàn)組為細(xì)胞中加了5-FU或10-HDA和CCK-8溶液時(shí)的吸光度；OD空白組為無(wú)細(xì)胞且只加CCK-8溶液時(shí)的吸光度；OD對(duì)照組為細(xì)胞中只加CCK-8溶液時(shí)的吸光度。

通過(guò)SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)得出半數(shù)致死濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為39.65 μmol/L，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理濃度，并用該濃度（39.65 μmol/L）的5-FU或10-HDA加入96 孔板中處理不同的時(shí)間（0、3、6、12、24、36 h）。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為39.65 μmol/L的10-HDA或5-FU處理不同的時(shí)間（0、3、6、12、24 h），根據(jù)細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒，使用EVOS FL型全自動(dòng)智能成像系統(tǒng)，記錄細(xì)胞凋亡及壞死的形態(tài)特征；使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，利用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒中JC-1熒光探針?lè)z測(cè)線粒體膜電位的變化情況，再經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析細(xì)胞凋亡情況，每個(gè)樣本1×104個(gè)細(xì)胞，采用Cyexpert 1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。并通過(guò)Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，方法參考1.3.8節(jié)。

1.3.4 細(xì)胞周期分布檢測(cè)

HepG2細(xì)胞經(jīng)39.65 μmol/L 10-HDA處理不同的時(shí)間（0、3、6、12、24 h），1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇重懸細(xì)胞，在4 ℃下固定12 h。根據(jù)DNA含量檢測(cè)試劑盒（細(xì)胞周期）說(shuō)明書，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，每個(gè)樣本1×104個(gè)細(xì)胞，采用Cyexpert 1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到不同周期細(xì)胞的凋亡比例。并通過(guò)Western blot法檢測(cè)周期相關(guān)蛋白表達(dá)，方法參考1.3.8節(jié)。

1.3.5 線粒體凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)

根據(jù)核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書，提取HepG2細(xì)胞核蛋白，用于Western blot實(shí)驗(yàn)分析，進(jìn)行信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)，方法參考1.3.8節(jié)。

MAPK通路（JNK、P38和ERK）抑制劑處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后添加抑制劑和10-HDA，分為4 組：對(duì)照組；JNK/P38/ERK抑制劑組；10-HDA組（終濃度39.65 μmol/L）；JNK/P38/ERK抑制劑+10-HDA組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，用于線粒體凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白檢測(cè)，方法參考1.3.8節(jié)。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用39.65 μmol/L的10-HDA處理不同的時(shí)間（0、3、6、12、24 h），1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞，加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA室溫孵育30 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，從而分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平，每個(gè)樣本1×104個(gè)細(xì)胞，采用Cyexpert 1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

將細(xì)胞分為4個(gè)小組進(jìn)行處理（方法同1.3.5節(jié)）：對(duì)照組；N-乙酰-L-半胱氨酸組（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）；10-HDA組（終濃度39.65 μmol/L）；NAC+10-HDA組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡數(shù)量。同時(shí)，采用上述方法收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，用于相關(guān)信號(hào)通路蛋白檢測(cè)，方法參考1.3.8節(jié)。

1.3.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度80%左右，在培養(yǎng)孔中劃出3 道豎線，分別在培養(yǎng)孔中加入39.65 μmol/L的10-HDA或5-FU，并處理不同的時(shí)間（0、3、6、12、24 h），使用EVOS FL型全自動(dòng)智能成像系統(tǒng)，記錄細(xì)胞遷移情況。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集處理后的HepG2細(xì)胞，加入裂解液，在4 ℃下，12 000 r/min離心30 min，得到蛋白上清液，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，取蛋白樣品30 μg，加入5×buffer上樣至8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，室溫下5%脫脂乳封閉2 h后，分別加入相應(yīng)的一抗（Bax、Bcl-2、Cyt c、C-Caspase-3、靶向聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adenosine diphosphate-ribose polymerase，PARP）、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38、P-STAT3、STAT3、NF-κB P65、NF-κB PP65、IκB-α、Cyclin B1、CDK1/2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、磷酸化糖原合酶激酶3β、糖原合酶激酶3β、鋅指轉(zhuǎn)錄因子、Twist轉(zhuǎn)錄因子、鈣黏蛋白E、鈣黏蛋白N、抗波形絲蛋白、β-actin、AKT、P-AKT、P21、Cyclin A、P-IκB和Lamin B1），4 ℃過(guò)夜孵育。再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)成像，目的條帶使用Image J軟件分析相對(duì)灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 10-HDA和5-FU處理對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

如圖1A所示，與5-FU處理相比，10-HDA對(duì)3 種肝癌細(xì)胞具有抑制增殖作用，其抑制作用呈劑量依賴性。經(jīng)計(jì)算可知，HepG2細(xì)胞的IC50為39.65 μmol/L，且對(duì)10-HDA的敏感度高于其他肝癌細(xì)胞，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為主要的研究對(duì)象。此外，10-HDA處理對(duì)3 種正常細(xì)胞的毒性均低于5-FU（圖1B）。經(jīng)39.65 μmol/L 10-HDA和5-FU處理后，肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的存活均受到了明顯的抑制，且抑制作用呈時(shí)間依賴性（圖1C）。對(duì)于人正常細(xì)胞L-02、IMR-90、GES-1的存活率，在處理24 h時(shí)，5-FU處理后細(xì)胞存活率分別為42.11%、40.77%、48.07%，10-HDA處理后細(xì)胞存活率分別為58.45%、60.42%、60.07%，由此看出，與5-FU組相比，10-HDA對(duì)正常細(xì)胞系的毒副作用更小。當(dāng)處理36 h時(shí)，10-HDA處理后細(xì)胞人正常細(xì)胞L-02、IMR-90、GES-1的存活率分別為44.77%、40.33%、46.06%，此時(shí)細(xì)胞存活率過(guò)低，藥物對(duì)人正常細(xì)胞有明顯的殺傷作用，因此，后續(xù)研究藥物處理時(shí)間均為24 h（圖1D）。

圖1 10-HDA對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of 10-HDA on cell viability

2.2 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

HepG2細(xì)胞經(jīng)10-HDA處理后，進(jìn)行了Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染，隨著藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞發(fā)生皺縮，具有凋亡形態(tài)學(xué)特征。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，熒光強(qiáng)度隨10-HDA處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，與5-FU處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度有明顯差異（圖2A）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，10-HDA處理24 h后HepG2細(xì)胞凋亡率高達(dá)49.24%（圖2B）；JC-1是一種檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物（紅色）；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能夠聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)為單體（綠色）；用聚合體與單體熒光強(qiáng)度比值來(lái)表示線粒體的去極化作用。JC-1熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果顯示（圖2C），10-HDA處理后線粒體膜電位下降導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示，隨著藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，促凋亡蛋白Bax、Cyt c、C-Caspase-3和PARP的蛋白表達(dá)水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖2D）。

圖2 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡及其相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 The effect of 10-HDA on the apoptosis of HepG2 cells and the expression of apoptotic proteins

2.3 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，G2/M期細(xì)胞凋亡率明顯升高，G0/G1期細(xì)胞凋亡率下降，且呈時(shí)間依賴性（圖3A）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，G2/M期相關(guān)蛋白P-AKT、Cyclin B1、CDK1/2和Cyclin A的表達(dá)水平降低，P21的蛋白表達(dá)水平升高（圖3B）。綜上所述，10-HDA通過(guò)調(diào)控HepG2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞在G2/M期發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。

圖3 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞周期阻滯的影響Fig. 3 Effect of 10-HDA on cycle arrest in HepG2 cells

2.4 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體凋亡的影響

HepG2細(xì)胞經(jīng)10-HDA處理后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，P-ERK、P-STAT3、NF-κB P65和NF-κB PP65的蛋白表達(dá)水平降低，P-JNK、P-P38、IκB-α的蛋白表達(dá)水平增加，且呈時(shí)間依賴性（圖4A）。細(xì)胞核內(nèi)STAT3、NF-κB和P-IκB的蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖4B）。此外，利用MAPK抑制劑驗(yàn)證MAPK和STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中的作用，結(jié)果顯示（圖5A～C），10-HDA處理組的P-STAT3、NF-κB的蛋白表達(dá)量降低，P-JNK、P-P38、IκB-α、Caspase-3蛋白水平升高，在加入JNK或P38抑制劑與10-HDA共同處理后，P-STAT3、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高，P-JNK、P-P38、IκB-α、Caspase-3蛋白水平明顯下降。但加入ERK抑制劑后的蛋白表達(dá)量的變化與加入其他兩組抑制劑的結(jié)果不一致，P-ERK、P-STAT3、NF-κB的蛋白表達(dá)量明顯更低，IκB-α、Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高，表明10-HDA通過(guò)調(diào)控MAPK、STAT3和NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體依賴性凋亡。

圖4 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體依賴性凋亡的影響Fig. 4 Effect of 10-HDA on mitochondria-dependent apoptosis of HepG2 cells

圖5 加入MAPK抑制劑的蛋白表達(dá)情況Fig. 5 Effect of MAPK inhibitors on the expression of proteins

2.5 10-HDA對(duì)ROS水平誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞經(jīng)10-HDA處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈時(shí)間依賴性增加（圖6A）。NAC和10-HDA共同處理組細(xì)胞凋亡率與10-HDA處理組相比顯著降低，表明加入NAC后抑制了10-HDA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的積累引起的HepG2細(xì)胞凋亡（圖6B）。Western blot結(jié)果顯示，與NAC處理組相比，10-HDA處理組細(xì)胞質(zhì)中P-JNK、P-P38、IκB-α和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，P-ERK、P-STAT3和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯下降。而與10-HDA處理組相比，NAC與10-HDA共同處理組的P-JNK、P-P38、IκB-α和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著下降，P-ERK、P-STAT3和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯回升（圖6C）。10-HDA明顯抑制了細(xì)胞核中STAT3、NF-κB和P-IκB的蛋白表達(dá)水平，加入NAC處理后，蛋白表達(dá)水平明顯回升（圖6D）。綜上所述，10-HDA通過(guò)上調(diào)ROS水平激活MAPK、STAT3和NF-κB信號(hào)通路，觸發(fā)細(xì)胞線粒體凋亡。

圖6 10-HDA對(duì)ROS水平誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig. 6 Effect of 10-HDA on ROS-induced apoptosis in HepG2 cells

2.6 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與對(duì)照組相比，10-HDA處理組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，且呈時(shí)間依賴性（圖7A）。Western blot結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、磷酸化糖原合酶激酶3β、鋅指轉(zhuǎn)錄因子、Twist轉(zhuǎn)錄因子、鈣黏蛋白N和抗波形絲蛋白的表達(dá)水平顯著下降，鈣黏蛋白E表達(dá)水平顯著上升，且呈時(shí)間依賴性（圖7B）?？芍?，10-HDA能夠抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖7 10-HDA對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig. 7 Effect of 10-HDA on the migration and invasion of HepG2 cells

2.7 10-HDA對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡、周期阻滯及遷移的影響

根據(jù)以上研究結(jié)果，可繪制出10-HDA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、周期阻滯及遷移抑制的信號(hào)通路圖，見(jiàn)圖8。通過(guò)信號(hào)通路圖可看出，10-HDA通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而調(diào)控MAPK/STAT3/NF-κB信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。從分子水平上，表明10-HDA能夠誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用機(jī)制。

圖8 10-HDA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、周期阻滯及遷移抑制機(jī)制的示意圖Fig. 8 Schematic diagram of 10-HDA-induced apoptosis, cycle arrest and migration inhibition in hepatocellular carcinoma cells

3 討 論

10-HDA是蜂王漿中主要活性成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞的分化、遷移和促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡或病例組織壞死的功效[28-29]。CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明10-HDA能明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有良好的殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布、ROS水平調(diào)控的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞遷移5個(gè)方面分別證實(shí)10-HDA對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。

上調(diào)ROS水平可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[30]，有研究表明，正常細(xì)胞能夠維持正常的ROS水平，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯高于正常細(xì)胞[31]，這使腫瘤細(xì)胞對(duì)ROS的水平上升更為敏感，因此，可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，10-HDA上調(diào)了HepG2細(xì)胞ROS水平，導(dǎo)致MAPK、NF-κB、STAT3信號(hào)通路被激活，相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡的關(guān)鍵，不同的細(xì)胞外刺激可以激活不同的MAPK信號(hào)通路，通過(guò)JNK、P38和ERK信號(hào)通路之間的相互調(diào)節(jié)來(lái)介導(dǎo)各種細(xì)胞生物反應(yīng)。JNK和P38參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化和凋亡[30]，ERK是傳遞有絲分裂原信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10-HDA通過(guò)上調(diào)ROS水平，激活了MAPK、NF-κB和STAT3信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，主要通過(guò)死亡受體途徑和線粒體途徑發(fā)生[8]。線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵組成部分Bcl-2蛋白家族（包括Bcl-2和Bax），位于線粒體上游[33]，MAPK和NF-κB信號(hào)通路的激活導(dǎo)致下游的Bcl-2蛋白家族發(fā)生變化，其中促凋亡蛋白Bax使線粒體外膜通透化時(shí)，凋亡蛋白酶活化因子Cyt c得到釋放，進(jìn)而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase-3[34]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的關(guān)鍵因子，參與包括PARP在內(nèi)的許多關(guān)鍵蛋白的蛋白裂解[35]。結(jié)果表明，促凋亡蛋白Bax、Cyt c表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，導(dǎo)致Caspase-3被激活，PARP表達(dá)水平升高。上述研究結(jié)果表明，10-HDA可通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2的表達(dá)水平，破壞線粒體外膜的通透性，從而誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期阻滯是控制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控機(jī)制之一[36]，下調(diào)STAT3活性可抑制AKT的磷酸化及激活[37]，AKT在細(xì)胞存活、代謝、遷移和侵襲等信號(hào)通路中起重要的調(diào)控作用[38]，抑制AKT信號(hào)通路的活性，可發(fā)生細(xì)胞周期阻滯[39]。結(jié)果表明，10-HDA通過(guò)上調(diào)ROS水平，激活STAT3信號(hào)通路，使STAT3磷酸化水平下降，從而抑制AKT的磷酸化水平，下游蛋白Cyclin B1、CDK1/2和Cyclin A表達(dá)水平下降，P21蛋白表達(dá)水平升高，最終誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞在G2/M周期發(fā)生阻滯。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），是參與細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，能夠提高侵襲和遷移能力[40]，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)來(lái)抑制肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移[41]。有研究表明，通過(guò)增加ROS水平，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的糖原合酶激酶3β磷酸化，而其下游鋅指轉(zhuǎn)錄因子和Twist轉(zhuǎn)錄因子是鈣黏蛋白E的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[42]，上調(diào)鈣黏蛋白E蛋白的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而鈣黏蛋白N與之相反[43]，此外，鈣黏蛋白E的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致抗波形絲蛋白表達(dá)降低，抑制了EMT的發(fā)生[44]。因此，抑制EMT的發(fā)生是抑制細(xì)胞遷移的重要過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，10-HDA通過(guò)增加HepG2細(xì)胞ROS水平，下調(diào)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、磷酸化糖原合酶激酶3β、鋅指轉(zhuǎn)錄因子、Twist轉(zhuǎn)錄因子、鈣黏蛋白N和抗波形絲蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)了鈣黏蛋白E蛋白的表達(dá)水平，從而抑制了EMT的發(fā)生。以上研究結(jié)果表明，10-HDA能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移作用。

綜上所述，10-HDA處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，激活MAPK、NF-κB和STAT3信號(hào)通路，觸發(fā)線粒體依賴性凋亡，并在G2/M周期發(fā)生細(xì)胞阻滯，同時(shí)抑制了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1信號(hào)通路，抑制了細(xì)胞遷移和侵襲。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為研究10-HDA的生理功能、肝癌發(fā)病機(jī)理及功能性食品開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。