云南野生牛肝菌中重金屬的生物有效性及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

李夢(mèng)瑩，王 坤，保欣晨，馬嬌陽，田 穩(wěn)，于 淼，郭 磊，向 萍,*

（1.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

云南作為中國和世界的野生食用菌主產(chǎn)區(qū)，有“野生食用菌王國”的美譽(yù)，全省16個(gè)地州均有野生菌分布，全國約70%的野生食用菌產(chǎn)自云南[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，云南野生菌年均量50萬 t左右，產(chǎn)值達(dá)100多億 元，其中多種野生菌遠(yuǎn)銷美國、日本等40多個(gè)國家和地區(qū)，年出口創(chuàng)匯達(dá)1.2億 美元[2]。在云南出口的野生食用菌中，牛肝菌占絕對(duì)比重，其出口量占全國牛肝菌出口總量的71%，創(chuàng)匯金額占全國總額的65%，是全國最大的野生牛肝菌產(chǎn)地[3]。野生食用菌出口已成為云南省食用菌產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，對(duì)云南地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民脫貧增收具有十分重大的社會(huì)意義。

云南屬于土壤背景值較高的地區(qū)，加之近年來云南城市化和工業(yè)化進(jìn)程的加快，野生食用菌受到各種重金屬污染物的威脅，因此云南野生食用菌的質(zhì)量是一個(gè)值得關(guān)注的重要問題，也引起了人們對(duì)其健康風(fēng)險(xiǎn)的廣泛關(guān)注和擔(dān)憂[4]。因有害物質(zhì)超標(biāo)問題，國家和地區(qū)陸續(xù)出臺(tái)了一系列“綠色壁壘”措施，影響了云南野生食用菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和出口創(chuàng)匯。有研究表明牛肝菌富含人體所需的多種微量元素，但也會(huì)富集一些對(duì)人體有害的重金屬元素如鎘（Cd）、鉛（Pb）和鉻（Cr）等，其生物富集金屬離子的能力和積累重金屬的能力也受到環(huán)境因素的影響[5-6]。因此準(zhǔn)確評(píng)估云南牛肝菌中重金屬超標(biāo)的人體健康風(fēng)險(xiǎn)和危害，對(duì)有效控制重金屬暴露、保障民生健康和推動(dòng)云南野生食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

現(xiàn)有的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型大多基于污染物總量，而非人體實(shí)際吸收劑量，因此很難精準(zhǔn)評(píng)估其人體健康風(fēng)險(xiǎn)和危害[7]。雖然現(xiàn)有評(píng)價(jià)模型能快速預(yù)測(cè)出污染物的潛在風(fēng)險(xiǎn)，但其預(yù)設(shè)認(rèn)為污染物進(jìn)入人體胃腸道后100%被吸收，然而并不是所有攝入的污染物都是生物可利用的，這樣很可能會(huì)高估人體攝入量[8]。因此，研究人員開發(fā)出體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，可以很好地模擬人體胃腸道，如生理原理提取法（physiologically based extraction test，PBET）、生物可給性研究（solubility bioavailability research consortium，SBRC）、歐洲生物可給性標(biāo)準(zhǔn)法（unified barge method，UBM）、體外胃腸道法（in vitrogastrointestinal，IVG）等[9-10]。盡管體外胃腸模擬法得到了廣泛的應(yīng)用，但是由于其缺乏人體腸道細(xì)胞成分，因而很難準(zhǔn)確模擬胃腸道的生理功能。近年來，為了克服體外胃腸模擬法的不足，研究者們紛紛建立了體外胃腸模擬法結(jié)合Caco-2細(xì)胞模型的復(fù)合體系用于模擬人體對(duì)重金屬生物有效性研究，并證實(shí)與體外胃腸模擬法相比，復(fù)合體系更科學(xué)合理[11]。但是應(yīng)用體外胃腸模擬法結(jié)合Caco-2細(xì)胞模型對(duì)云南牛肝菌中重金屬的生物有效性開展的研究仍然鮮見報(bào)道，大多數(shù)研究是對(duì)新鮮牛肝菌進(jìn)行的，而關(guān)于干牛肝菌中重金屬含量的研究是缺少的。牛肝菌的出口比重高達(dá)85%以上，鑒于新鮮的牛肝菌含水量高、組織脆嫩、不易久放，在運(yùn)輸過程中新鮮牛肝菌的損傷也較大，對(duì)其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展不利，所以將牛肝菌制成干品已成為現(xiàn)在出口及日常食用的常見形式，且干牛肝菌的商業(yè)化和消費(fèi)量也是逐年增加[12-14]。根據(jù)研究顯示，新鮮菌類在干燥的過程中不會(huì)造成其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的顯著損失，但由于水分的流失，這一過程明顯提高了酚類化合物、碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量，所以這一脫水過程對(duì)金屬元素或許也有同樣的效果[15]。

針對(duì)以上研究動(dòng)態(tài)和存在的問題，本研究以云南主產(chǎn)區(qū)（楚雄、曲靖、大理和普洱）不同野生干牛肝菌（按顏色分為白牛肝菌、黑牛肝菌、紅牛肝菌和黃牛肝菌）為研究對(duì)象，分析其Cd、Pb和Cr的總含量；采用SBRC法測(cè)定干牛肝菌中Cd、Pb和Cr的生物可給性含量；結(jié)合Caco-2細(xì)胞探究食用后被吸收重金屬的情況；運(yùn)用估計(jì)每日攝入量（estimated daily intake，EDI）公式對(duì)不同模擬方法得出的牛肝菌中重金屬含量進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)程度的比較；最后更深入分析食用重金屬含量高的牛肝菌對(duì)人體腸道細(xì)胞的影響。研究結(jié)果可為準(zhǔn)確評(píng)估干牛肝中重金屬超標(biāo)的人體健康風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)，也為其提供新的思路，對(duì)推動(dòng)云南干牛肝菌的產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同野生干牛肝菌（白牛肝菌、黑牛肝菌、紅牛肝菌、黃牛肝菌）采集于云南4個(gè)主產(chǎn)區(qū)（楚雄、曲靖、大理和普洱），于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購買。

人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞 美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection）；濃硝酸（優(yōu)級(jí)純）美國默克公司；30%過氧化氫（分析純） 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；豬膽鹽 上海麥克林生化科技有限公司；胰酶 上海源葉生物科技有限公司；最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、胎牛血清、pH值為7.2～7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液 武漢普諾賽生命科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液 美國HyClone公司；3516型6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國康寧公司；十二烷基硫酸鈉 北京索萊寶生物科技有限公司；甘氨酸、BCA蛋白定量試劑盒、總RNA快速提取液、cDNA第一鏈快速合成試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑 南京翼飛雪生物科技有限公司；GBW10048（GSB-26）芹菜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中國地球物理地球化學(xué)勘查研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ICAPQR電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀、Forma? Steri-Cycle?二氧化碳培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司；TS-100倒置顯微鏡 日本尼康公司；SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司；Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國Quawell公司；LightCycler 480 II熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀瑞士羅氏集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 牛肝菌預(yù)處理、元素含量的測(cè)定與質(zhì)量控制

牛肝菌預(yù)處理：將4個(gè)主產(chǎn)區(qū)的不同干牛肝菌置于冷凍干燥機(jī)中干燥至恒質(zhì)量，用瓷研缽磨粉碎后過100 目標(biāo)準(zhǔn)篩，常溫保存于聚乙烯自封袋備用。

根據(jù)美國環(huán)境保護(hù)局方法3050B，用濃硝酸和30%過氧化氫消化樣品（0.10 g，干質(zhì)量），參考文獻(xiàn)[9]使用ICP-MS法測(cè)定牛肝菌中重金屬（Cr、Cd和Pb）的含量（均以干質(zhì)量為計(jì)，后同），每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)，為保證儀器測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇GBW10048（GSB-26）芹菜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行控樣，其結(jié)果在合理區(qū)間內(nèi)。

1.3.2 生物可給性測(cè)定

模擬胃液和模擬模擬胃液和模擬腸液的均參考文獻(xiàn)[16]配制，其pH值以12 mol/L鹽酸溶液、NaOH飽和溶液調(diào)節(jié)。本研究采用SBRC法將20 mL模擬胃液（30.03 g/L甘氨酸，pH 1.5）加入裝有1 g牛肝菌粉末的50 mL離心管中，混勻后37 ℃下以150 r/min速度搖動(dòng)1 h模擬胃消化，然后立即將混合物以4 000 r/min的速度離心10 min收集上清液，向離心后的殘?jiān)屑尤?0 mL模擬腸液（1.75 g/L膽鹽、0.5 g/L胰酶，pH 7.0），然后在37 ℃下以150 r/min的速度搖動(dòng)4 h模擬腸消化，然后在4 000 r/min下離心10 min，收集上清液。兩次離心后的上清液經(jīng)0.45 μm過濾器過濾后通過ICP-MS測(cè)定模擬胃液和模擬腸液中的重金屬含量[9]。模擬胃液、腸液的空白品均納入質(zhì)量保證范圍，每個(gè)樣品中重金屬的胃和腸道生物可給性定義為模擬胃液和模擬腸液中的重金屬含量（生物可給性含量）占消化前總含量的百分比。

1.3.3 生物有效性含量測(cè)定

將Caco-2細(xì)胞以106個(gè)/mL的密度接種于6 孔板中培養(yǎng)，待14 d后形成單層，將1.3.2節(jié)離心后的模擬腸液與MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基等體積混合暴露Caco-2細(xì)胞4 h，然后用4 ℃的PBS沖洗細(xì)胞兩次，去除細(xì)胞外結(jié)合的重金屬，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%十二烷基硫酸鈉溶液裂解，收獲細(xì)胞裂解液。取出20 μL細(xì)胞裂解液采用BCA蛋白定量試劑盒和酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，將剩余裂解液放入消解管中，加入5 mL 75%（體積分?jǐn)?shù)）硝酸和1 mL 30%（體積分?jǐn)?shù)）過氧化氫消解。冷卻后，使用蒸餾水（屈臣氏）將所得溶液稀釋至10 mL，通過ICP-MS測(cè)定最終溶液中重金屬的含量[9]。最終將細(xì)胞內(nèi)的重金屬（Cr、Cd和Pb）含量記為生物有效性含量，單位為μg/mg，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)1.3.1節(jié)、1.3.2節(jié)計(jì)算出來的干牛肝菌中重金屬總含量C1/（mg/kg）、生物可給性含量C2/（mg/kg）、生物有效性含量C3/（μg/mg）及其牛肝菌平均消費(fèi)量W/（g/d）按下式計(jì)算重金屬EDI。如果EDI大于1，則可能對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響[17]。

式中：Cx表示C1、C2、C3；W是18～65 歲成人（100 g/d）或7～14 歲兒童（55 g/d）的牛肝菌平均消費(fèi)量；BM是成人（55.9 kg）或兒童（32.7 kg）的平均體質(zhì)量。W和BM參考中國營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)編著的《中國居民膳食指南2016》。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析腸道細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)

將模擬腸液與MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基等體積混合暴露Caco-2細(xì)胞4 h（37 ℃）后，用總RNA提取試劑提取Caco-2細(xì)胞中的總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)量RNA的濃度和質(zhì)量，純化后的RNA通過試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，用2×SYBR Green qPCR Master Mix和引物對(duì)白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并采用2－ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)循環(huán)設(shè)置為：先95 ℃、10 min，再以兩步法（95 ℃、15 s，60 ℃、1 min）進(jìn)行40個(gè)循環(huán)[18]。循環(huán)結(jié)束后，設(shè)置從65 ℃以0.5 ℃/s勻速升溫97 ℃并連續(xù)采集熒光值，獲取熔解曲線，以檢查引物擴(kuò)增的特異性。引物來自哈佛大學(xué)PrimerBank（表1），內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time polymerase chain reaction used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)均使用Excel軟件進(jìn)行處理。采用Origin 2018繪圖，通過GraphPad Prism Version 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南主產(chǎn)區(qū)牛肝菌中重金屬污染特征

如圖1所示，云南各主要產(chǎn)區(qū)不同干牛肝菌中Cr、Cd和Pb范圍分別為0.7～2.2、31.5～51.1 mg/kg和1.1～4.9 mg/kg。3 種重金屬元素中干牛肝菌的Cd含量最高（平均41.5 mg/kg），其次是Pb（平均2.4 mg/kg）和Cr（平均1.2 mg/kg）。不同主產(chǎn)區(qū)中干牛肝菌重金屬含量之和最高的為普洱-紅牛肝菌34.4 mg/kg、楚雄-紅牛肝菌54.5 mg/kg、曲靖-黃牛肝菌50.2 mg/kg和大理-黃牛肝菌51.3 mg/kg。GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》對(duì)食用菌及其制品中Cr、Cd和Pb的含量做出了限定，分別不得超過0.5、0.2、1 mg/kg（其限量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)食用菌中Cr作規(guī)定，故使用新鮮蔬菜的標(biāo)準(zhǔn)）。由于本研究的干牛肝菌是由新鮮牛肝菌脫水加工制成的干制品，需根據(jù)Wang Xuemei等得出新鮮蘑菇干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為10%進(jìn)行換算[19]。假定新鮮牛肝菌中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，則標(biāo)準(zhǔn)限量中Cr、Cd和Pb含量的上限為5、2、10 mg/kg。由圖1可知，在測(cè)定主要產(chǎn)區(qū)的不同干牛肝菌中Cd含量全部超過限量值（平均含量約是限量值的20 倍），Cr和Pb含量在安全范圍內(nèi)。由此可見，相對(duì)于其他元素，干牛肝菌中Cd更容易被富集。有研究發(fā)現(xiàn)Cd含量在菌類中含量也很高（可高達(dá)50 mg/kg），在未受污染的地區(qū)生長(zhǎng)的牛肝菌中Cd含量最高可達(dá)5 mg/kg[20]。Jarzyńska等[21]研究也發(fā)現(xiàn)牛肝菌類中Cr、Pb和Cd富集系數(shù)平均值為0.10、0.02和5.90，表明Cd相對(duì)其他兩種元素更容易被累積。不同的研究也表明牛肝菌中Cd含量（8.9～129.1 mg/kg）和富集系數(shù)較高，具有一定的富集能力，尤其是黑牛桿菌[22-23]。而不同干牛肝菌中Cr含量普遍偏高，且差異較小，可能與新鮮牛肝菌制成干品的方法有關(guān)，常用的干燥方法有自然干燥、熱風(fēng)干燥、真空冷凍干燥等，其中高溫干燥可使有毒元素轉(zhuǎn)化，其過程中水分和其他可溶化合物的損失而使其濃度升高，會(huì)導(dǎo)致其含量變化[24-27]。除此之外，牛肝菌中重金屬的含量還與生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)系，如鮑長(zhǎng)俊[28]在研究曲靖和普洱地區(qū)的灰褐牛肝菌中發(fā)現(xiàn)，曲靖地區(qū)的牛肝菌含Cd含量較高，與該區(qū)工業(yè)污染較為嚴(yán)重密切相關(guān)。

圖1 不同牛肝菌中Cr、Cd和Pb的分布特征Fig. 1 Mean contents of Cr, Cd and Pb in wild edible dried bolete from four main production areas of Yunnan

新鮮可食用的牛肝菌種類很多，也很容易混淆，尤其是市場(chǎng)上出售的干牛肝菌會(huì)把易混淆的牛肝菌摻在一起出售，因此將本研究干牛肝菌的重金屬數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)進(jìn)行了比較（表2）。

表2 野生食用牛肝菌中重金屬含量與文獻(xiàn)資料的比較Table 2 Contents of heavy metals in wild edible bolete compared to literature data

續(xù)表2

云川地區(qū)牛肝菌中重金屬含量普遍超過限量值，而國外的牛肝菌相對(duì)較為安全，與不同地區(qū)土壤重金屬背景值有關(guān)[30,34,39-40]。其中云南、四川地區(qū)的Cr含量普遍較高，與本研究結(jié)果不一致，但與國外的牛肝菌中Cr含量相似，可能是周圍環(huán)境污染所致，工業(yè)排放的廢氣和廢水是環(huán)境中Cr的主要來源，如楊美智子[41]研究云南省曲靖花山地區(qū)牛肝菌發(fā)現(xiàn)其含量高達(dá)18.7 mg/kg，與該地區(qū)有工業(yè)園區(qū)有關(guān)，而牛肝菌中Pb含量都在1.0～4.0 mg/kg范圍內(nèi)，可能是因?yàn)椴杉剡h(yuǎn)離工業(yè)采礦區(qū)，受到公路汽車尾氣的的影響小，所以其含量較低。值得注意的是本研究中干牛肝菌Cd的平均含量約是GB 2762—2017標(biāo)準(zhǔn)限量值的20 倍，為了更為準(zhǔn)確地評(píng)估其人體健康風(fēng)險(xiǎn)，本研究借鑒了目前國際上廣泛使用的生物有效性進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。

2.2 基于SBRC法測(cè)定干牛肝菌中重金屬的生物可給性的結(jié)果

基于SBRC體外模擬法中干牛肝菌的重金屬生物可給性如圖2所示。模擬胃液中Cr、Cd和Pb的平均生物可給性分別為18.2%、3.1%和17.0%（3 種重金屬的平均生物可給性為12.8%），在模擬腸液中分別下降到15.3%、0.6%、5.5%（3 種重金屬的平均生物可給性為7.1%），說明重金屬在胃腸消化中可能被人體吸收。本研究中生物可給性較低，可能是重金屬?zèng)]有完全溶出，因此不會(huì)在胃腸中積累，對(duì)人體造成健康風(fēng)險(xiǎn)。先宏等發(fā)現(xiàn)食用香菇中Cd的生物可給性在胃消化階段（12%）比腸消化階段（6%）高[42]。Chiocchetti等研究發(fā)現(xiàn)西班牙市場(chǎng)上干菌類Cd的平均生物可給性為18%，而Pb的生物可給性低于儀器檢出限，雖然與本研究結(jié)果不一致，但該研究也指出，干菌類中重金屬生物可給性低可能是由于樣品的消化率本來就低或者是與在消化過程中干菌類釋放的其他元素形成了低溶解度的化合物[35]。而與蔬菜類的研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)蔬菜類的生物可給性普遍都高，如Hu Junli等[43]研究香港蔬菜中Cd、Cr和Pb的生物可給性分別為14%～71%、7.1%～25%、5.7%～18%（胃階段）和8.3～20%、16%～42%、39%～64%（腸階段）。同樣，F(xiàn)u Jin等[44]報(bào)道，Pb（小白菜）在胃和腸消化階段的生物可給性分別為9%和19%，Cd分別約為65%和40%（PBET）。Mnisi等[45]使用PBET胃腸模擬法測(cè)量了斯威士蘭葉菜中Cd、Cr和Pb的生物可給性分別為63.4%、59.1%、61.1%（胃階段）和23.3%、31.6%、29.6%（腸階段）。蔬菜類的生物可給性比本研究普遍都高的原因可能在于樣品消化過程中，由于各種因素的影響，金屬在不同胃腸道系統(tǒng)以及不同種類中的生物可給性差異大，這些因素包括不同樣品中是否存在競(jìng)爭(zhēng)離子、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，以及使用的不同胃腸模擬方法的物理和化學(xué)條件等[46]。

圖2 不同地區(qū)干牛肝菌中Cr（A）、Cd（B）和Pb（C）的生物可給性Fig. 2 Bioaccessibility of Cr (A), Cd (B) and Pb (C) in wild edible dried bolete from four areas of Yunnan

總的來說，模擬胃液中Cr、Cd和Pb的生物可給性明顯高于模擬腸液。胃液的低pH值可能會(huì)導(dǎo)致金屬與碳水化合物和蛋白質(zhì)之間的化學(xué)鍵斷裂，從而導(dǎo)致金屬在胃中大量釋放，但在腸階段中不會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象[47]。與其他研究中Pb的生物可給性相比，本研究中Pb在人體胃腸道中的生物可給性較低可能是由于腸壁上其他物質(zhì)與鉛離子結(jié)合后抑制了其穿過細(xì)胞膜[44]。營(yíng)養(yǎng)元素也可能影響生物可給性，研究表明，營(yíng)養(yǎng)元素（如Ca）的缺乏也會(huì)導(dǎo)致Cd在人體腸壁的累積[46]。研究發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù)重金屬相比，Cr對(duì)胃蛋白酶的親和力更強(qiáng)，可能會(huì)導(dǎo)致其生物可給性高[48-49]。干牛肝菌中重金屬生物可給性受多種因素的影響，如纖維素酶和植酸鹽的超細(xì)纖維、植物螯合素、營(yíng)養(yǎng)特性、微生物生理過程、金屬種類及其形態(tài)等[50-52]。因此，重金屬的生物可給性不僅取決于基質(zhì)，還取決于元素的化學(xué)形態(tài)和所用的體外方法。

2.3 基于腸道細(xì)胞的生物有效性含量結(jié)果

基于胃腸模擬方法得到的人體重金屬生物可給性差異大，而被人體腸道實(shí)際吸收重金屬的劑量（生物有效態(tài)）才是誘發(fā)人體健康效應(yīng)的關(guān)鍵因子。因此，使Caco-2細(xì)胞分別暴露于不同地區(qū)干牛肝菌中生物可給性含量最高的模擬腸液，生物有效性含量結(jié)果如表3所示。Cr、Pb和Cd在腸道細(xì)胞中只有Cd被腸道細(xì)胞吸收積累，生物有效性含量范圍在0.60～1.90 μg/mg之間，平均值為1.10 μg/mg。牛肝菌重金屬健康暴露風(fēng)險(xiǎn)與重金屬有效態(tài)含量緊密相連，雖然牛肝菌中重金屬總量很高，但Caco-2細(xì)胞吸收累積的重金屬含量卻很低，說明其健康風(fēng)險(xiǎn)較低。方勇等[11]建立體外模擬消化/Caco-2細(xì)胞模型來測(cè)定大米中Pb的生物有效性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃腸消化后秈米中Pb的生物可給性均高于粳米，生米經(jīng)胃、腸消化生物有效性程度均高于蒸煮后的大米。Beri等[53]研究不同品種的甜玉米生長(zhǎng)在受污染的Cd土壤中通過將模擬體外消化方法與Caco-2細(xì)胞模型相結(jié)合來評(píng)估，結(jié)果表明，甜玉米中Cd生物有效性低，因此不會(huì)對(duì)人類造成不良的健康影響。Lei Ji等[54]利用體外消化/Caco-2細(xì)胞模型評(píng)估中國10 種小麥粉中Fe的生物有效性，為植物育種方面能夠篩選出鐵生物強(qiáng)化小麥品種。這些研究從側(cè)面反映出建立了體外模擬消化/Caco-2細(xì)胞模型是測(cè)定本研究中重金屬生物有效性的一種有效的方法，可為研究重金屬的毒性提供一種新思路和手段。

表3 基于Caco-2細(xì)胞的Cr、Cd和Pb的生物有效性含量Table 3 Bioavailable concentrations of Cr, Cd and Pb based on Caco-2 cells

2.4 基于目標(biāo)重金屬總含量、生物可給性含量和生物有效性含量的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果對(duì)比分析

現(xiàn)有食品健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法多基于重金屬的總量，但是越來越多的研究表明基于人體生物有效性的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)可以更準(zhǔn)確地評(píng)估人體實(shí)際暴露劑量，預(yù)測(cè)健康危害程度。因此本研究根據(jù)干牛肝菌中目標(biāo)重金屬含量、生物可給性含量、生物有效性含量，借助EDI評(píng)價(jià)模型分別進(jìn)行了分析評(píng)估對(duì)比，結(jié)果如表4所示。成人（7.42）和兒童（6.98）的Cd EDI都大于1，表明對(duì)人類健康有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。以重金屬元素Cd的生物可給性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生物可給性EDI為0.02～0.04，遠(yuǎn)小于1，無健康風(fēng)險(xiǎn)；而根據(jù)生物有效性含量估算的EDI更低，為0～0.000 2，表明不存在健康風(fēng)險(xiǎn)?；谝陨夏Ｐ驮u(píng)估發(fā)現(xiàn)，如果以重金屬總含量作為健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估依據(jù)，會(huì)高估其人體健康風(fēng)險(xiǎn)，而結(jié)合體內(nèi)和細(xì)胞方法，基于生物可給性含量和生物有效性含量進(jìn)行評(píng)估，可以更好地研究牛肝菌中重金屬的人體健康風(fēng)險(xiǎn)，得出人體真實(shí)的有效參數(shù)，利用評(píng)價(jià)公式能更準(zhǔn)確、更快速的預(yù)測(cè)健康風(fēng)險(xiǎn)。

表4 基于重金屬總含量、生物可給性含量和生物有效性含量估算干牛肝菌重金屬EDITable 4 Estimated daily intake of heavy metals from wild edible dried bolete based on total heavy metals contents, bioaccessible concentrations and bioavailable concentrations mg/（g·d）

2.5 牛肝菌經(jīng)模擬腸液消化后對(duì)Caco-2細(xì)胞IL-8基因表達(dá)的影響

作為一類可食用真菌，絕大多數(shù)牛肝菌非但對(duì)身體無害，反而可明顯提升機(jī)體的免疫能力，改善機(jī)體的微循環(huán)等，但仍有少數(shù)的牛肝菌對(duì)身體有明顯的毒害作用，中毒早期出現(xiàn)消化道癥狀，進(jìn)而突出表現(xiàn)為精神和神經(jīng)的癥狀等，消化系統(tǒng)上最常見的反應(yīng)是腸胃炎等癥狀[55]。而炎癥是免疫系統(tǒng)的一種保護(hù)性非特異性反應(yīng)，可由多種因素觸發(fā)，在機(jī)體防御中起著重要作用，為了驗(yàn)證干牛肝菌中生物有效態(tài)重金屬是否對(duì)腸道構(gòu)成健康風(fēng)險(xiǎn)，選取了炎癥因子IL-8[56]。IL-8是一種重要的炎性細(xì)胞趨化因子和活化因子，有研究表明IL-8在腸道黏膜的表達(dá)量升高，說明腸炎癥狀朝著不利的方向發(fā)展，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，因此IL-8在腸炎發(fā)病中起著十分重要的作用[57-59]?；谏衔奶峒暗纳镉行栽u(píng)價(jià)并沒有健康風(fēng)險(xiǎn)，為了更深入探究食用重金屬含量高的干牛肝菌在腸道是否會(huì)有炎癥發(fā)生，因此測(cè)定IL-8在其中的基因表達(dá)量。由圖3可知，與模擬腸液-空白組相比，實(shí)驗(yàn)中不同牛肝菌經(jīng)模擬腸液消化后對(duì)Caco-2細(xì)胞IL-8的表達(dá)量均極顯著下調(diào)（P＜0.01），進(jìn)一步說明牛肝菌經(jīng)模擬腸液消化后不會(huì)刺激Caco-2細(xì)胞啟動(dòng)IL-8因子，表明食用重金屬含量高的干牛肝菌在腸道消化4 h后沒有引起明顯的危害效應(yīng)。

圖3 Caco-2細(xì)胞IL-8基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative gene expression levels of IL-8 in Caco-2 cells

3 結(jié) 論

干牛肝菌中Cr和Pb含量在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，但Cd的平均含量約是限量值的20 倍，干牛肝菌對(duì)Cd的吸收能力比較強(qiáng)。用SBRC法測(cè)定出干牛肝菌中3 種重金屬在模擬胃液和模擬腸液中的平均生物可給性分別為12.8%、7.1%，而腸道細(xì)胞吸收重金屬的能力也較低。本研究應(yīng)用EDI對(duì)干牛肝菌中重金屬的總含量進(jìn)行了人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，Cd的EDI大于1，兒童的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)（6.98）與成人（7.42）相當(dāng)，隨后利用干牛肝菌中重金屬的生物可給性含量和生物有效性含量來修正EDI公式，發(fā)現(xiàn)其EDI小于1，方法上的改進(jìn)說明使用人體腸道細(xì)胞評(píng)估其健康風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更加準(zhǔn)確。為進(jìn)一步驗(yàn)證重金屬含量高的牛肝菌粉末可能的健康風(fēng)險(xiǎn)，本研究選取炎癥因子IL-8測(cè)定其基因表達(dá)量是否會(huì)引起炎癥反應(yīng)，結(jié)果表明食用干牛肝菌可能不存在健康風(fēng)險(xiǎn)，更準(zhǔn)確的結(jié)果還需進(jìn)一步研究，但從側(cè)面也反映出SBRC體外胃腸模擬結(jié)合人體Caco-2細(xì)胞模擬能比較準(zhǔn)確評(píng)估牛肝菌中重金屬對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)，可為研究其準(zhǔn)確性提供一種新思路和手段。