超聲處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響

李 可，李三影，杜曼婷，王艷秋，張俊霞，白艷紅

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

在過去的幾十年，全球禽肉的生產(chǎn)和消費(fèi)迅速增長[1]。值得注意的是，消費(fèi)者的消費(fèi)習(xí)慣已經(jīng)發(fā)生了變化，對(duì)原料肉的品質(zhì)與加工特性的要求越來越高。然而，類蒼白松軟滲水（pale, soft and exudative，PSE）雞肉是一類顏色蒼白、質(zhì)地柔軟、汁液滲出的劣質(zhì)肉，其發(fā)生率較高，具有較低的pH值，加工過程中鹽溶性蛋白難以提取[2]，導(dǎo)致產(chǎn)品的出品率降低和質(zhì)構(gòu)劣變，給禽肉深加工業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。雞肉中含20%～23%的蛋白質(zhì)，從雞胸肉中提取的肌肉蛋白是營養(yǎng)最豐富的蛋白種類之一。肌肉蛋白具有高消化性和低過敏性，富含人體所需的所有必需和非必需氨基酸，其功能特性對(duì)于肉制品的品質(zhì)至關(guān)重要[3]。近幾年國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注不同加工方式改善類PSE雞肉蛋白質(zhì)功能特性，包括打漿[4]、脈沖電場[5]、糖基化[6]、酸堿處理[7]等。與其他加工處理不同，酸堿處理原理是將畜禽/水產(chǎn)品肌肉蛋白溶于極性酸堿環(huán)境中，調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)以沉淀蛋白，從而獲得分離蛋白，其中通過優(yōu)化酸堿溶解與等電點(diǎn)沉淀時(shí)pH值提高蛋白回收率。Zhao Xue等[7-8]發(fā)現(xiàn)利用堿溶酸沉法回收在pH 5.5時(shí)得到的類PSE雞肉分離蛋白（以下簡稱類PSE分離蛋白）回收率較高，然而其凝膠乳化功能特性卻弱于其他回收pH組。因此，有必要進(jìn)一步改善回收pH 5.5時(shí)類PSE分離蛋白功能特性。

超聲處理是一種綠色的食品物理加工技術(shù)。高強(qiáng)度超聲波（16～100 kHz、10～1 000 W/cm2）通過物理效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等產(chǎn)生的物理和化學(xué)作用，改變食品組分的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)[9]。最近有研究證明，超聲波技術(shù)有潛力改性各種酸堿分離蛋白并改善其功能特性，如鱈魚分離蛋白[10]、紫貽貝分離蛋白[11]、豌豆分離蛋白[12]等。在肉品加工中，超聲處理主要應(yīng)用于原料肉的速凍解凍、嫩化、腌制滾揉、畜禽副產(chǎn)物分離提取等[13-14]，有效改善了肉品組分功能性質(zhì)和品質(zhì)，提高加工效率[15]。目前，超聲處理應(yīng)用于輔助提取畜禽副產(chǎn)物蛋白，提高了回收率，而關(guān)于超聲處理對(duì)類PSE分離蛋白功能特性及其結(jié)構(gòu)變化的影響研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以類PSE分離蛋白為研究對(duì)象，采用超聲對(duì)類PSE分離蛋白進(jìn)行改性，探討不同超聲功率對(duì)類PSE分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，并進(jìn)一步分析超聲處理后類PSE分離蛋白結(jié)構(gòu)與功能的相互聯(lián)系，以期為類PSE分離蛋白的加工應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去骨的雞胸肉采集于鄭州某加工廠去骨線。

金龍魚大豆油 益海嘉里金龍魚糧油食品有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上海源葉生物有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PH-STAR CPU胴體肌肉pH值測定儀 北京布拉德科技發(fā)展有限公司；CiX62便攜式色度儀 美國愛色麗公司；SZ-22A絞肉機(jī) 廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；T25高速均漿機(jī) 德國IKA公司；VC750超聲波破碎儀 美國Sonic公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；AvantiJ-26S XPI 大容量高速冷凍離心機(jī)美國Beckman Coulter公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京通用儀器有限公司；Nano-ZS90納米激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司；凝膠成像儀 美國伯樂公司；圓二色譜儀 英國應(yīng)用光學(xué)物理公司；F-7000熒光分光光度計(jì)、Regulus 8100冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類PSE分離蛋白的提取和分離蛋白溶液質(zhì)量濃度的測定

樣品的選取參考Li Ke等[16]的方法。宰后24 h，測定所有樣品的L*值和pH值（pH24h），選取類PSE雞胸肉（L*＞53，pH24h＜5.7）。選取后，將所有肉眼可見的結(jié)締組織，脂肪去除。然后將肉切成約1 cm3正方體小塊，用真空包裝袋包裝，每袋約100 g，冷凍（－20 ℃），并在2 周內(nèi)使用。

參考Zhao Xue等[17]的方法，取100 g樣品于4 ℃下解凍12 h，肉塊在預(yù)冷的絞肉機(jī)中以4 000 r/min 絞碎20 s（2 次）。然后將糊狀物與預(yù)冷的去離子水以1∶6（m/V）混合，10 000 r/min均質(zhì)1 min。使用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)肉漿至pH 11，將漿液均質(zhì)后在4 ℃下冷卻10 min，以穩(wěn)定系統(tǒng)。然后，肉漿在4 ℃下10 000×g離心15 min，漿狀上清液使用2 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至5.5（等電點(diǎn)附近），在4 ℃下放置10 min待蛋白質(zhì)完全沉淀后將混合物10 000×g離心15 min，收集沉淀物，即為類PSE分離蛋白。將沉淀溶于去離子水中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整溶液至中性得到類PSE分離蛋白溶液。參考文獻(xiàn)[8]，采用雙縮脲法測定分離蛋白溶液的質(zhì)量濃度，所有過程保持在4 ℃。

1.3.2 類PSE分離蛋白的超聲處理

將1.3.1節(jié)得到的分離蛋白溶液稀釋至20 mg/mL（用去離子水稀釋，后同），取50 mL于100 mL的小燒杯中進(jìn)行超聲處理。13 mm的超聲波探頭放入液面下15 mm處，超聲頻率：20 kHz；超聲功率：150、300、450 W；超聲模式：超聲2 s，停止4 s；此條件下處理5 min。整個(gè)樣品處理過程中溫度低于12 ℃，得到的對(duì)照組（未進(jìn)行超聲處理）、150 W組、300 W組、450 W組分離蛋白溶液在4 ℃下保存，48 h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.3 類PSE分離蛋白溶液粒徑和電位的測定

將1.3.2節(jié)得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至1 mg/mL。使用納米激光粒度儀測定分離蛋白溶液的粒徑和電位。

1.3.4 類PSE分離蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

根據(jù)Laemmli等[18]的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析。將1.3.2節(jié)得到的分離蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，分別與等體積的還原緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）Gly、10% SDS、3.33% DTT和2%溴酚藍(lán)）、非還原緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、20% Gly、10% SDS、2%溴酚藍(lán)）混合，然后在100 ℃的沸水中加熱5 min。電泳凝膠由5%濃縮凝膠和10%分離凝膠組成，加樣量為10 μL。在垂直電泳儀中以60 V電泳20 min，然后以110 V電泳約1.2 h。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min。然后，將其脫色直到背景清晰為止。使用凝膠成像儀成像，通過Quantity One軟件對(duì)還原條件下肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶定量分析。

1.3.5 類PSE分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測定

將1.3.2節(jié)得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至0.1 mg/mL。根據(jù)Dong Ming等[5]的方法，使用圓二色譜儀分析類PSE分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。帶寬設(shè)定為1 nm，在190～260 nm的波長范圍內(nèi)記錄樣品的平均殘留橢圓度。去離子水作為空白組，每個(gè)樣品重復(fù)3 次測定。然后用CDNN Pro軟件計(jì)算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對(duì)含量。

1.3.6 類PSE分離蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的測定

1.3.6.1 自由巰基含量的測定

參考Zhang Ziye等[19]的方法并稍作修改。將1.3.2節(jié)得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至5.0 mg/mL。然后，將1 mL蛋白溶液與4 mL含5 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、pH 8.0）和100 μL 10 mmol/L DTNB溶液混合。將混合物在黑暗中保持30 min，用紫外-可見分光光度計(jì)測定412 nm波長處的吸光度，通過13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)計(jì)算自由巰基含量，單位為μmol/g。

1.3.6.2 表面疏水性的測定

參考Ma Wuchao等[10]方法，使用ANS法測定類PSE分離蛋白的表面疏水性。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將1.3.2節(jié)得到的4 組分離蛋白溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。將50 μL 8 mmol/L ANS溶液（溶劑為pH 7.0、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液）與4 mL蛋白稀釋樣品混合，室溫避光反應(yīng)20 min。熒光強(qiáng)度（FI）通過熒光分光光度計(jì)在340 nm（激發(fā)）和470 nm（發(fā)射）的波長下測定。FI對(duì)蛋白質(zhì)量濃度的初始斜率作為表面疏水性（H0）。

1.3.6.3 熒光強(qiáng)度的測定

參考Zhao Xue等[20]方法，測定類PSE分離蛋白的內(nèi)源性熒光光譜，稍作修改。用去離子水將1.3.2節(jié)得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至0.1 mg/mL，在25 ℃下使用熒光分光光度計(jì)對(duì)溶液進(jìn)行分析。使用光程為1 cm的石英比色皿，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射光譜范圍為290～460 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm，掃描速率為12 000 nm/min。

1.3.7 類PSE分離蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察

將1.3.2節(jié)得到的4 組分離蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得冷凍干燥后的蛋白樣品。掃描電子顯微鏡加速電壓為1.0 kV，在500 倍的放大倍數(shù)下觀察噴金處理后不同樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.8 類PSE分離蛋白溶解度的測定

樣品溶解度的測定參考Zou Ye等[21]方法，稍加修改。將1.3.2節(jié)得到的分離蛋白溶液稀釋至10 mg/mL，取5 mL分離蛋白溶液于10 mL離心管中，在4 ℃、10 000×g下離心30 min，根據(jù)雙縮脲法[8]測量上清液中的蛋白質(zhì)量濃度（即去離子水中的溶解度）；相似地，將1.3.2節(jié)得到的分離蛋白溶液稀釋至10 mg/mL，然后按照2%的添加量加入NaCl，充分混合后取5 mL混合溶液于10 mL離心管進(jìn)行上述離心操作，取上清液測定蛋白質(zhì)量濃度（即2% NaCl中的溶解度）。蛋白溶解度按公式（1）計(jì)算。

1.3.9 類PSE分離蛋白乳化特性的測定

乳液制備參考Zhao Xue等[8]的方法。向1.3.2節(jié)得到的20 mL 20 mg/mL分離蛋白溶液中添加大豆油（200 g/L）和NaCl（2 g/100 g），為確保乳液體系完全混合，使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min 均質(zhì)1 min后間歇1 min，再次均質(zhì)1 min，保持溫度低于10 ℃。在均質(zhì)過程中，將乳液保存在冰中以防止熱變性。均質(zhì)后，立即在0、10 min吸取50 μL乳液，然后加入5 mL 1 mg/mL的SDS溶液充分混合。以SDS溶液為空白，測定500 nm波長處吸光度。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）按公式（2）、（3）計(jì)算。

式中：A0和A10分別表示0 min和10 min時(shí)500 nm波長處的吸光度；D是稀釋倍數(shù)100；φ是油相體積分?jǐn)?shù)（20%）；ρ是蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05時(shí)表示不同處理組間存在顯著差異；采用SPSS 21.0軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行Pearson’s相關(guān)性分析。使用Origin 2018軟件進(jìn)行主成分分析、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對(duì)類PSE分離蛋白粒徑和電位的影響

粒徑通常用來評(píng)估蛋白聚集體的大小，在蛋白質(zhì)的功能特性中起著重要作用[22]。圖1顯示不同超聲處理后類PSE分離蛋白的粒徑分布。隨著超聲功率的增加，蛋白粒徑分布逐漸向左移動(dòng)，并逐漸從雙峰分布轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏宸植?，表明蛋白質(zhì)在水溶液中均勻分布。如表1所示，對(duì)照組（未經(jīng)超聲處理）平均粒徑為（3 828.33±22.68）nm。超聲功率為150、300、450 W時(shí)，蛋白平均粒徑分別為（994.20±17.80）、（713.80±28.52）、（586.13±16.42）nm，表明超聲處理可以顯著減小類PSE分離蛋白的粒徑（P＜0.05），這與粒徑分布是一致的。Yu Cuiping[11]、Zhang Ziye[19]、Malik[23]等也報(bào)道不同功率和時(shí)間超聲處理后，雞肌原纖維蛋白、貽貝分離蛋白和向日葵分離蛋白的粒徑也顯著降低。粒徑降低的原因可能是超聲空化作用產(chǎn)生的剪切力和湍流，經(jīng)超聲處理后，蛋白質(zhì)聚集體中的非共價(jià)鍵被破壞，導(dǎo)致顆粒變小[24]。

由表1可知，蛋白質(zhì)樣品的ζ電位值都是負(fù)的，這表明蛋白表面帶負(fù)電的基團(tuán)多于帶正電的基團(tuán)。超聲處理后蛋白質(zhì)的表面凈電荷是降低的，表明蛋白表面基團(tuán)的電離度減弱[25]。與對(duì)照組相比，超聲處理后樣品的電位絕對(duì)值顯著下降（P＜0.05），這可能是由于超聲處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的帶正電荷的基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷被中和[26]。ζ電位的變化與Wang Yuntao等[27]的研究結(jié)果一致。

表1 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白粒徑和ζ電位的影響Table 1 Effects of different ultrasonic power levels on the particle size and ζ-potential of PSE-like chicken protein isolate

2.2 超聲后類PSE分離蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

圖2A顯示在還原和非還原條件下對(duì)照組和超聲處理組類PSE分離蛋白樣品的SDS-PAGE圖譜。與對(duì)照組相比，各超聲處理組蛋白組成成分沒有發(fā)生明顯變化，同時(shí)可以觀察到3個(gè)主要的條帶，分子質(zhì)量分別約為205、45 kDa和35 kDa，對(duì)應(yīng)的蛋白依次是肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白。在還原條件下，與對(duì)照組相比（泳道1），超聲處理的蛋白質(zhì)樣品的主要條帶組成沒有發(fā)生明顯變化，這表明超聲處理組未發(fā)生肽鍵斷裂。由圖2B可知，300、450 W超聲處理組樣品的肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶強(qiáng)度高于對(duì)照組，這可能是由于一定功率的超聲處理可以增加類PSE分離蛋白的水溶性。Zhu Zhenbo等[28]研究超聲處理核桃分離蛋白，結(jié)果表明不同超聲功率和時(shí)間處理后蛋白質(zhì)樣品的主要條帶并沒有發(fā)生明顯改變，而出現(xiàn)主要條帶強(qiáng)度增強(qiáng)的原因是超聲處理增加核桃蛋白的水溶性，這與本研究結(jié)果相似。在非還原條件下，對(duì)照組和超聲處理的類PSE分離蛋白樣品的電泳圖譜也沒有顯著差異，表明超聲處理沒有破壞任何二硫鍵，進(jìn)一步證實(shí)了超聲處理沒有導(dǎo)致任何蛋白質(zhì)分子的斷裂[28]。

圖2 類PSE雞肉分離蛋白的SDS-PAGE圖譜（A）和還原條件下肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶的平均光密度值（B）Fig. 2 SDS-PAGE profiles (A) and average optical density of myosin heavy chain and actin bands from PSE-like chicken protein isolate under reducing conditions (B)

2.3 超聲對(duì)類PSE分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜能夠反映蛋白質(zhì)主鏈肽鍵的構(gòu)象，是反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化的重要指標(biāo)[29]。如圖3所示，類PSE分離蛋白在208、222 nm處出現(xiàn)的兩個(gè)負(fù)吸收峰，是α-螺旋的吸收峰，且α-螺旋含量與峰的強(qiáng)度成正比[30]。隨著超聲功率的增加，峰的強(qiáng)度逐漸增大，說明α-螺旋含量增加，其含量的增加表明超聲會(huì)引起類PSE分離蛋白構(gòu)象部分恢復(fù)，從而使蛋白質(zhì)的功能穩(wěn)定性增加[31]。

圖3 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effects of different ultrasonic power levels on the secondary structure of PSE-like chicken protein isolate

如表2所示，隨超聲功率的增加，α-螺旋和無規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量大體呈下降趨勢(shì)；此外，與對(duì)照組相比，150、300 W超聲處理時(shí)，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對(duì)含量沒有顯著變化（P＞0.05），超聲處理功率為450 W時(shí)，α-螺旋的相對(duì)含量顯著增加（P＜0.05），由15.25%增加到40.91%，而β-折疊的相對(duì)含量顯著下降（P＜0.05），可能是超聲處理使兩者之間發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，β-折疊相對(duì)含量還與蛋白質(zhì)疏水性有關(guān)，其相對(duì)含量降低表明分子內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)暴露，疏水性增強(qiáng)[32]。Hu Hao等[33]也發(fā)現(xiàn)超聲處理增加大豆分離蛋白的α-螺旋和無規(guī)卷曲含量，減少β-折疊含量。但是，與本課題組之前研究超聲處理類PSE雞肉糜的結(jié)果[16]相反，這可能是由于類PSE雞肉經(jīng)過酸堿處理和超聲處理溫度不同等所致。以上結(jié)果表明，超聲處理改變了類PSE分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)類PSE分離蛋白構(gòu)象部分恢復(fù)。

表2 超聲處理類PSE雞肉分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化Table 2 Changes in relative contents of secondary structures of PSE-like chicken protein isolate under ultrasonic treatments

2.4 超聲對(duì)類PSE分離蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 超聲對(duì)類PSE分離蛋白自由巰基含量的影響

自由巰基是蛋白質(zhì)中重要的功能成分之一。因此，其含量的變化可以反映蛋白質(zhì)的變性程度，并對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性（例如溶解性、乳化能力和起泡能力）起著重要作用[34]。如圖4所示，超聲處理后自由巰基含量顯著增加（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，當(dāng)超聲功率增加到450 W，自由巰基含量增加了約2 倍。自由巰基含量的增加可能是由于超聲空化效應(yīng)促進(jìn)蛋白分子結(jié)構(gòu)的展開，減小了蛋白粒徑（圖1），并使埋藏在分子內(nèi)的巰基基團(tuán)暴露出來[35]，從而使自由巰基含量增加。Hu Hao等[33]同樣研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白的自由巰基含量隨超聲功率（200～600 W）的增加和超聲時(shí)間（15～30 min）的延長而增加。然而Liu Ru等[36]報(bào)道，超聲處理的肌球蛋白的自由巰基含量隨超聲功率（100～250 W）的增加和超聲時(shí)間（3～12 min）的延長而降低，這可能是由于敏感的自由巰基基團(tuán)被超聲產(chǎn)生的過氧化氫（由超聲空化作用產(chǎn)生的一些瞬態(tài)自由基形成）所氧化。Chandrapala等[37]表明超聲處理后乳清濃縮蛋白的自由巰基含量沒有變化。以上實(shí)驗(yàn)中超聲處理后自由巰基含量的差異可能是由于蛋白質(zhì)變性程度、本身特性和超聲條件等不同。

圖4 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白自由巰基含量的影響Fig. 4 Effects of different ultrasonic power levels on the content of free sulfhydryl groups in PSE-like chicken protein isolate

2.4.2 超聲對(duì)類PSE分離蛋白表面疏水性的影響

H0代表蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的數(shù)量，通常用來反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，也與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)[37]。如圖5所示，與對(duì)照組（517）相比，隨著超聲功率的增加，類PSE分離蛋白的H0顯著增加（P＜0.05）。同樣，有研究表明鱈魚分離蛋白、鰱魚肌球蛋白、雞肉肌原纖維蛋白等[10,36,38]的H0也隨著超聲強(qiáng)度增加或超聲時(shí)間延長而增加。H0的增加可能是因?yàn)槌暱栈臀锢砑羟衅茐牡鞍踪|(zhì)分子的部分疏水相互作用使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)[37]，從而增加與ANS探針的結(jié)合位點(diǎn)。H0的變化趨勢(shì)與自由巰基含量的變化趨勢(shì)一致。

圖5 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白表面疏水性的影響Fig. 5 Effects of different ultrasonic power levels on the surface hydrophobicity of PSE-like chicken protein isolate

2.4.3 超聲對(duì)類PSE分離蛋白熒光強(qiáng)度的影響

熒光光譜法廣泛用于評(píng)估蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，因?yàn)樯彼?酪氨酸（Trp/Tyr）殘基的內(nèi)在熒光對(duì)微環(huán)境的極性極為敏感[39]。如圖6所示，隨著超聲功率的增加，熒光強(qiáng)度明顯增加，與對(duì)照組相比，450 W組類PSE分離蛋白的最大發(fā)射波長紅移約3 nm。與對(duì)照組相比，超聲處理后紅移和熒光強(qiáng)度增加可能是由于蛋白質(zhì)的解折疊，暴露出更多的Trp/Tyr殘基和疏水基團(tuán)，從而增加微環(huán)境中的非極性[21]，這與H0的結(jié)果一致（圖5）。這些結(jié)果表明超聲處理后類PSE分離蛋白的構(gòu)象被改變。Zou Ye等[29]也報(bào)道超聲處理可以增強(qiáng)雞肝中水溶性蛋白的熒光強(qiáng)度。

圖6 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白熒光強(qiáng)度的影響Fig. 6 Effects of different ultrasonic power levels on the fluorescence intensity of PSE-like chicken protein isolate

2.5 超聲對(duì)類PSE分離蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

從圖7A可以看出，對(duì)照組類PSE分離蛋白呈現(xiàn)大而不規(guī)則的形狀。與對(duì)照組相比，超聲處理后類PSE分離蛋白（圖7B～D）呈現(xiàn)出更小和更松散的片狀結(jié)構(gòu)，這可能是由于超聲空化作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開。有研究指出，超聲處理可以減小蛋白質(zhì)的粒徑并提高溶解度[33]。本研究中掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果與超聲處理類PSE分離蛋白粒徑（圖1）和結(jié)構(gòu)（圖4～6）的變化一致。Jiang Lianzhou等[40]的研究也表明，超聲處理的黑豆分離蛋白顯示出更多的無序結(jié)構(gòu)和不規(guī)則碎片。

圖7 不同超聲功率處理的類PSE雞肉分離蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 SEM of PSE-like chicken protein isolate under ultrasonic treatments at different powers

2.6 超聲對(duì)類PSE分離蛋白溶解度的影響

在食品體系中，溶解度不僅是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)的最佳指標(biāo)，也是確定某些功能性質(zhì)的基礎(chǔ)，如凝膠和乳化能力。如圖8所示，隨著超聲功率的增加，類PSE分離蛋白在去離子水中以及2%的鹽（NaCl）溶液中的溶解度都顯著增大（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，隨著超聲功率增加到450 W，去離子水和2%的鹽溶液中蛋白的溶解度分別提高了1.17 倍和6.46 倍。去離子水中超聲處理功率為450 W時(shí)蛋白的溶解度高于2%的鹽溶液中對(duì)照組蛋白溶解度，表明一定功率的超聲處理可以提高在降鹽水平下類PSE分離蛋白的溶解度。蛋白質(zhì)溶解度的升高可能是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械力破壞了蛋白質(zhì)天然聚集形式的相互作用，促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)的形成[19]。此外，蛋白顆粒平均粒徑降低（表1），表面積增加，會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)與水之間的相互作用，從而導(dǎo)致類PSE分離蛋白溶解度的增加[38]。蛋白質(zhì)溶解性的改善將有利于蛋白質(zhì)乳化性能的提高。

圖8 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白溶解度的影響Fig. 8 Effects of different ultrasonic power levels on the solubility of PSE-like chicken protein isolate

2.7 超聲對(duì)類PSE分離蛋白乳化特性的影響

EAI和ESI一般用來表征蛋白質(zhì)的乳化特性，它們可以反映蛋白質(zhì)幫助形成乳化體系及其穩(wěn)定乳化體系的能力大小。如圖9所示，超聲處理樣品的EAI顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這表明超聲處理促進(jìn)乳液的形成。隨著超聲功率的增加，蛋白質(zhì)的EAI顯著增加（P＜0.05），超聲后蛋白質(zhì)的EAI最大值為24.23 m2/g。與對(duì)照組相比，超聲功率為150、300、450 W時(shí)樣品的ESI分別提高至16.06、30.45、31.7 min，表明超聲處理可以提高乳液的穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，超聲能夠改善類PSE分離蛋白的乳化特性。乳化特性的改善可能是由于超聲處理使蛋白質(zhì)粒徑減小（圖1和表1），粒徑小的蛋白分子具有更大的分子遷移率來吸附在油-水界面周圍或是因?yàn)槌曁幚碚T導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的自由巰基和疏水基團(tuán)增加蛋白的表面疏水性（圖5），從而增強(qiáng)界面處蛋白之間的穩(wěn)定性[41]。Amiri等[42]也發(fā)現(xiàn)，在不同的超聲功率處理（100～300 W）30 min后，牛肉肌原纖維蛋白的EAI和ESI都顯著增加。

圖9 不同超聲功率處理對(duì)類PSE雞肉分離蛋白EAI和ESI的影響Fig. 9 Effects of different ultrasonic power levels on the emulsifying activity index and emulsifying stability index of PSE-like chicken protein isolate

2.8 相關(guān)性分析和主成分分析

不同超聲處理后類PSE分離蛋白的結(jié)構(gòu)和乳化特性的Pearson’s相關(guān)性分析結(jié)果如圖10A所示。類PSE分離蛋白的平均粒徑與EAI（r=－0.959，P＜0.01）、ESI（r=－0.713，P＜0.01）呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明平均粒徑較低的類PSE分離蛋白具有更好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。EAI和ESI與α-螺旋相對(duì)含量、無規(guī)卷曲相對(duì)含量、自由巰基含量、熒光強(qiáng)度和表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與β-折疊相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有助于乳化特性的提高。這可能是由于超聲改變了類PSE分離蛋白的構(gòu)象，使蛋白構(gòu)象解折疊和柔韌性增加，可以更容易地?cái)U(kuò)張并快速吸附在油-水界面，從而提高蛋白的乳化特性[43]。溶解度與EAI（r=0.759，P＜0.01）和ESI（r=0.906，P＜0.01）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明溶解度的增加也有利于蛋白質(zhì)乳化特性的改善。由此可以看出，超聲處理后類PSE分離蛋白的結(jié)構(gòu)、粒徑和溶解度的改變，對(duì)其乳化特性有著顯著和極顯著的影響。

應(yīng)用主成分分析法進(jìn)一步分析了不同超聲功率對(duì)類PSE分離蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響。主成分分析表明，PC1占總方差的87.4%，前兩個(gè)主成分占總方差的97.8%，說明乳化特性（EAI和ESI）與結(jié)構(gòu)之間的高度相關(guān)性。在載荷圖（圖10B）中，PC1主要與EAI、ESI、熒光強(qiáng)度、自由巰基含量、表面疏水性、α-螺旋相對(duì)含量、無規(guī)卷曲相對(duì)含量和溶解度等因子呈正相關(guān)，與粒徑和β-折疊相對(duì)含量等因子呈負(fù)相關(guān)，這與圖10A中相關(guān)性分析結(jié)果一致。PC2主要與β-折疊相對(duì)含量和EAI等因子呈正相關(guān)。如圖10C所示，對(duì)照組和150 W組分布在PC1的負(fù)向端，而300、450 W組分布在PC1的正向端，450 W組在PC1的最右端且與對(duì)照組的距離最遠(yuǎn)，表明超聲功率為450 W時(shí)對(duì)類PSE分離蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性有顯著的影響。綜上，超聲處理后類PSE分離蛋白乳化特性的提高與其結(jié)構(gòu)的改變存在高度相關(guān)性。

圖10 不同超聲功率處理后類PSE雞肉分離蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性的Pearson’s相關(guān)性分析熱圖（A）、主成分分析載荷圖（B）和因子評(píng)分圖（C）Fig. 10 Heatmap of Pearson’s correlation analysis (A), PCA loading plots (B) and score plots (C) between the structure and emulsifying properties of PSE-like chicken protein isolate after ultrasonic treatments at different powers

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用不同功率超聲波處理類PSE分離蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著超聲功率的增加，類PSE分離蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的自由巰基、Trp/Tyr殘基和疏水基團(tuán)，從而增加蛋白質(zhì)的疏水性，進(jìn)而增加蛋白的EAI；同時(shí)蛋白粒徑降低，溶解度提高，更多蛋白分子更容易吸附到油-水界面，增強(qiáng)了界面處蛋白之間的穩(wěn)定性，使蛋白質(zhì)ESI升高。超聲處理能夠改變類PSE分離蛋白的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)，從而改善了類PSE分離蛋白的乳化特性，并且相關(guān)性分析和主成分分析表明蛋白質(zhì)乳化特性的增加與其結(jié)構(gòu)的改變顯著相關(guān)。因此，超聲處理提高類PSE分離蛋白功能特性，將有助于拓展應(yīng)用超聲波輔助酸堿洗處理提取利用類PSE雞肉蛋白，可為類PSE分離蛋白在肉制品中的加工利用提供一定理論參考。