慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞中TLR2/4- NFκB 及IRAK1/4 信號通路變化研究

李航，黃昊

（開封市中心醫(yī)院 檢驗科，河南 開封 475000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的主要特征為持續(xù)性氣流受限且多呈進行性發(fā)展，并伴有肺功能進行性減低，還可伴隨心血管疾病、代謝綜合征等并發(fā)癥[1]。 研究表明，相關(guān)炎癥信號通路激活、炎癥因子異常表達在氣道壁和肺實質(zhì)損傷中具有關(guān)鍵性作用[2]。 Toll 樣受體（TLRs）是機體重要的模式識別受體之一，而核因子κB（NF-κB）位于TLRs 下游信號通路的關(guān)鍵位置，TLRs-NF-κB 信號通路過度激活情況下可導致炎癥反應失控，參與呼吸道及肺組織損傷、破壞[3]。 白細胞介素-1 受體相關(guān)激酶（IRAK）可介導包括TLRs 在內(nèi)的多細胞受體信號，在多種炎癥細胞信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)中具有重要調(diào)節(jié)作用[4]。 本研究通過檢測COPD 患者外周血單個核細胞（PBMCs）中TLR2/4-NF-κB 及IRAK1/4 信號通路表達，旨在探討其在COPD 發(fā)病中的作用，為COPD 的防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所有受試者均自愿參與且簽署知情同意書，研究設(shè)計經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準通過。 選取2018年1月至2019年6月期間，在本院就診并符合入選標準的COPD 患者90例：納入標準：⑴符合COPD 的臨床診斷標準[5]；⑵年齡≥40歲； ⑶近期未使用激素類藥物。 排除標準：⑴合并哮喘、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病者；⑵肺部及其他臟器系統(tǒng)惡性腫瘤病史或先病者；⑶合并嚴重心、腦、肝、腎及血液系統(tǒng)疾病者；⑷合并高血壓、糖尿病等其他慢性疾病者；⑸結(jié)締組織病、寄生蟲感染者。參照相關(guān)診療指南[5,6]，根據(jù)是否處于急性發(fā)作期分為穩(wěn)定期組（n=48）與急性加重期組（AECOPD 組，n=42）2 個亞組。

另選同期在本院接受健康體檢的性別、年齡匹配的志愿者90 例作為正常對照組，納入標準：⑴肺功能正常，無呼吸系統(tǒng)病史；⑵既往身體健康狀況良好，無慢性疾病史、惡性腫瘤史。 排除標準：⑴重要臟器器質(zhì)性病變； ⑵近2 個月內(nèi)發(fā)燒或其他感染性疾?。?⑶經(jīng)體格檢查及胸X 線片檢查顯示異常者。

1.2 檢測方法

1.2.1 PBMCs 提取 所有受試者均隔夜空腹8h 以上，晨取空腹外周靜脈血5 ml，以肝素鈉抗凝，采用Ficoll Hypaque 密度梯度離心法（轉(zhuǎn)速2000r/min 離心30min）離心，留取白膜層細胞，采用PBS洗滌2 次，1500r/min 離心10min，獲取PBMCs。

1.2.2 TLRs、NF-κB 及IRAK mRNA 檢 測 采 用Trizol 法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應后采用實時PCR技術(shù)檢測TLRs、NF-κB 及IRAK mRNA 表達，PCR儀為美國Bio-Rad 公司提供。 反應體系包括4 種dNTPs 混合液各2.5μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.2μl，Taq DNA 聚合酶1 U，加入滅菌水至總體積20μl。 反應 條件：95℃30s→95℃5s→60℃25s，循環(huán)40 次。 試劑盒由Promega 生物技術(shù)公司生產(chǎn)，溶解曲線反應條件：95℃15s→60℃1min→95℃15s。 內(nèi)參對照為GAPDH，引物由賽默飛世爾科技公司提供。 檢測TLR-2、TLR-4、NF-κB、IRAK-1 和IRAK-4 mRNA 表達，引物設(shè)計：（1）GAPDH 上游序列5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游序列5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3’，片段大小121bp；（2）TLR-2 上游序列5’-CGGAAGATAATGAACACCAAGAC-3’, 下游序列5’-AGATCCCAACTAGACAAAGACTG-3’，片段大小139 bp；（3）TLR-4 上游序列5’-CCTGTCCCTGAACCCTATGA-3’, 下 游序列5’-CTTCTAAAC CAGCCAGACCTT-3’ ，片段大小137 bp；（4）NFκB 上游 序 列5’-AGGATTTCGTTTCCGTTATGT -3’，下游序列5’-CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC-3’，片段大小92 bp；（5）IRAK-1 上游序列5’-TGAGGAACACGGTGTATGCTG-3’，下游序列5’-GTTTGGGTGACGAAACCTGGA-3’，片段大小119 bp； （6）IRAK -4 上 游 序 列5’ -CCTGACTCCTCAAGTCCAGAA-3’，下游序列5’-ACAGAAATGG GTCGTTCATCAAA-3’，片段大小119 bp。

1.2.3 結(jié)果判定 獲得電泳帶以Fluor Chem V2.0電容膠成像分析軟件進行分析，即5μL 3%瓊脂糖凝膠（0.1%溴乙錠）經(jīng)電泳分析PCR 終產(chǎn)物，采用2-△△CT法計算目標基因相對表達量，△CT=目標基因△CT-參照△CT，相對量（RQ）=2-△△CT。

1.2.4 血清炎癥因子檢測 受試者均晨取外周靜脈血4ml，3000r/min 離心10min 分離血清，保存于-80℃冰箱中統(tǒng)一待測。 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）測定血清白介素（IL）-1β、-6、-8 及腫瘤壞死因子α（TNF-α），BK-EL10C 全自動酶聯(lián)免疫分析儀及其配套試劑由山東博科醫(yī)療器械有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。 計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較經(jīng)單因素方差分析，進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，比較經(jīng)χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD 組與對照組的臨床特征比較AECOPD組中,男33 例,女9 例；年齡45～75歲，平均62.31±8.14歲；病程3～15年，平均11.31±5.17年；第一秒用力呼氣量占所有呼氣量的比例（FEV1/FVC）為43%～60%，平均49.42±5.16%。 COPD 穩(wěn)定期組中，男40 例，女8 例；年齡45～75歲，平均60.49±7.96歲；病程2～16年，平均11.52±5.01年；FEV1/FVC為48%～66%，平均58.82±6.74%；對照組中，男68例，女22 例；年齡45～75歲，平均58.98±7.43歲；FEV1/FVC 為82%～89%，平均83.66±8.02%。 三組的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 COPD組與對照組的TLRs、NF -κB、IRAKs mRNA 表達水平比較COPD 組的PBMCs 中TLR-2、TLR-4、NF-κB、IRAK-1 及IRAK-4 mRNA 表達水平均高于對照組，且AECOPD 組高于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 COPD 組與對照組的TLRs、NF- κB、IRAKs mRNA 表達水平比較（±s）

表1 COPD 組與對照組的TLRs、NF- κB、IRAKs mRNA 表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與穩(wěn)定期比較，#P＜0.05。

COPD 穩(wěn)定期(n=48)1.81±1.02*1.14±0.85*1.02±0.31*1.01±0.33*1.00±0.32*項目 對照組(n=90) F P 值TLR-2 TLR-4 NF-κB IRAK-1 IRAK-4 AECOPD(n=42)2.83±2.26*#1.62±1.14*#1.54±0.85*#1.43±0.32*#1.39±0.31*#0.91±0.42 0.83±0.36 0.35±0.11 0.65±0.17 0.41±0.15 659.01 301.14 588.17 418.05 512.03＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 COPD 組與對照組的血清炎癥因子譜比較COPD 組的血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平均高于對照組，且AECOPD 組高于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 COPD 組與對照組的血清炎癥因子譜比較（±s）

表2 COPD 組與對照組的血清炎癥因子譜比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與穩(wěn)定期比較，#P＜0.05。

項目 AECOPD(n=42)IL-1β(μg/L)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)5.23±1.49*#98.21±10.21*#323.01±101.56*#176.42±35.72*#COPD 穩(wěn)定期(n=48)3.81±1.07*60.05±8.19*108.32±10.14*94.62±8.12*對照組(n=90)1.82±0.44 30.13±6.32 71.12±6.78 58.05±6.44 F 191.43 391.04 458.09 259.14 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 COPD 患者血清炎癥因子譜與TLRs、NF-κB、IRAKs mRNA 表達的相關(guān)性COPD 患者血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 均 與TLR-2、TLR-4、NFκB、IRAK-1、IRAK-4 呈正相關(guān)性，且與FEV1/FVC呈負相關(guān)性（P＜0.05）；且TLR-2、TLR-4、NF-κB、IRAK-1、IRAK-4 與FEV1/FVC 呈負相關(guān)性（P＜0.05），TLR-2/4、NF-κB、IRAK-1/4 之間互呈正相關(guān)性（P＜0.05）。 見表3。

表3 COPD 患者血清炎癥因子譜與TLRs、NF- κB、IRAKs mRNA 表達的相關(guān)性（r）

3 討論

COPD 的發(fā)病機制目前尚不完全明確，多認為與慢性支氣管炎、 長期肺泡上皮細胞及平滑肌上皮細胞重塑、肺氣腫等密切相關(guān)，尤其是有吸煙史者具有更高的COPD 發(fā)病率[7]。 在感染等刺激因素下，COPD 發(fā)展為AECOPD 可在短期內(nèi)出現(xiàn)肺功能惡化，導致嚴重并發(fā)癥（肺動脈高壓、肺心病等）發(fā)生風險升高,增加病死率或遠期不良預后風險[8]。因此，研究COPD 尤其是AECOPD 發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)生物學機制，對于COPD 的治療及急性發(fā)作的防治具有積極參考價值。

臨床研究表明, 免疫-炎癥反應紊亂是COPD的重要發(fā)病因素和急性加重因素之一[9]。TLRs 參與天然免疫、獲得性免疫應答的調(diào)節(jié),且在多種炎癥反應過程中細胞信號傳導、細胞吞噬作用、細胞凋亡等具有重要調(diào)節(jié)作用[10]。TLR-2 和TLR-4 是TL Rs 的主要亞型, 已有研究證實其在COPD 患者中具有明顯高表達,推測其與COPD 患者的肺血管重塑及持續(xù)氣道炎癥反應密切相關(guān)[11]。 核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-κB 在TLRs 信號傳導中起著關(guān)鍵作用，大量細胞因子的生成與釋放有賴于TLRs 所誘導的NF-κB 信號通路激活[12]。本研究結(jié)果顯示,COPD 患者PBMCs 中TLR-2、TLR-4、NF-κB 均處于高表達水平,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 提示TLR2/4-NF-κB 信號通路過度激活與COPD 的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。 與此同時，AECOPD 患者的TLR-2、TLR-4、NF-κB mRNA 表達水平均高于穩(wěn)定期組（P＜0.05）, 表明AECOPD 患者的TLR2/4-NF-κB 信號通路激活可能較穩(wěn)定期COPD 更為明顯。 考慮為AECOPD 多在感染、有害氣體或顆粒刺激等情況下發(fā)生，而上述因素均可激活TLR/NFκB 信號通路而擴大炎癥反應，引起不可控性炎癥反應或炎癥反應持續(xù)，可誘發(fā)肺部病理性改變或肺損傷。 IRAKs 家族是TLRs/IL-1 信號級聯(lián)家族的重要成員，在TLRs/IL-1 信號通路中發(fā)揮著連接、樞紐作用，其中，以IRAK1 和IRAK4 的作用尤為關(guān)鍵[13]。 本研究中，COPD 組PBMCs 中IRAK-1 及IRAK-4 mRNA 表達水平均較對照組明顯升高，且在AECOPD 組中表達較穩(wěn)定期COPD 組進一步升高（P＜0.05），證實IRAK-1/4 信號通路在COPD 尤其是AECOPD 中呈高度活化狀態(tài)，并大量參與氣道炎癥過程。 考慮為COPD 患者長期處于氣道炎癥等刺激作用下，呼吸道固有免疫功能受抑，導致患者對細菌的易感性增加，更容易發(fā)生呼吸道反復感染，而害氣體或物質(zhì)、感染等刺激可進一步激活TLR2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路，故在AECOPD患者中具有更明顯的TLR2/4-NF-κB、IRAK-1/4 過表達，這對COPD 的長期控制及AECOPD 的預防提供了一定的理論依據(jù)[14]。 相關(guān)性分析顯示，COPD 患者的TLR-2/TLR-4 與NF-κB、IRAK-1/4 之間均呈正相關(guān)性（P＜0.05），提示TLR2/4-NF-κB 與IRAK-1/4 信號通路可能通過某種相互作用而參與COPD 的發(fā)生及發(fā)展過程。

細胞因子異常表達已被證實與COPD 氣道炎癥的發(fā)生及持續(xù)具有密切關(guān)系，尤其是在肺部感染或COPD 急性發(fā)作情況下，多種細胞因子可呈現(xiàn)指數(shù)性上升，且其變化幅度與病情嚴重程度密切相關(guān)[15]。IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 均是經(jīng)典促炎細胞因子，具有多生物活性，已有研究證實上述因子可介導或擴大 “瀑布效應”，參與氣道炎癥反應的持續(xù)及氣道重塑[16]。 本研究中，COPD 患者的血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平均高于對照組，且AECOPD 高于COPD 穩(wěn)定期（P＜0.05）,與王志英等[17]報道基本相符,說明系統(tǒng)性炎癥反應在COPD的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用，且炎癥反應加劇可能與COPD 急性加重發(fā)作有關(guān)。 進一步相關(guān)性分析顯示，COPD 患者的血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平均與PBMCs 中TLR-2、TLR-4、NFκB、IRAK-1 及IRAK-4 mRNA 表達水平呈正相關(guān)性（P＜0.05）。 提示在COPD 患者可能長期受到定植菌刺激或存在DAMPs，TLR-2/TLR-4 可能識別并活化NF-κB，或IRAK-1/4 激活NF-κB 而介導下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等的釋放，炎性介質(zhì)或細胞因子又可進一步活化淋巴細胞、激活中性粒細胞等,使氣道炎癥持續(xù)或加重。 同時，研究還顯示，血清炎癥因子及TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 表達水平均與FEV1/FVC 呈負相關(guān)性（P＜0.05），郭太平等[18]也獲得了相似結(jié)論，證實炎癥反應程度與肺功能關(guān)系密切。 由此可見，炎癥TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路過度激活及其介導的下游炎性因子高表達與COPD 的發(fā)生及病情程度存在一定關(guān)聯(lián)，監(jiān)測TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路活化情況及其下游炎癥因子表達對COPD 的病情評估具有指導意義。

綜上所述，COPD 患者存在明顯TLR-2/4-NFκB、IRAK-1/4 信號通路激活，在PBMCs 中呈明顯高表達，與氣道炎癥反應持續(xù)或加重密切相關(guān)，且與COPD 的急性加重、肺功能減低有一定關(guān)系。 監(jiān)測TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路及相關(guān)因子表達變化，對COPD 的發(fā)病機制研究、臨床管理及急性加重的防治具有一定參考價值。