環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究

賈楓，葉海容，曾云龍，辛茶香，熊國亮，王彩紋

（江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌 330000）

結(jié)核病是由于感染了結(jié)核分枝桿菌而引起的一種慢性傳染病,也是目前由單一病原菌引起人類死亡人數(shù)最多的傳染病[1,2]。 我國因人口基數(shù)龐大,一直是全球結(jié)核病高負擔國家之一。 據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織（WHO）報告，全球估計1000 萬人感染結(jié)核病，而我國就有約84 萬，居世界第三位；耐藥結(jié)核以14%的占比居世界第二位[3]。 減少傳染源、有效控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵就在于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者并進行有效治療[4]。 目前，發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段仍然是細菌學檢查。 涂片抗酸染色法雖然操作簡單、快速，但是敏感性較差，其陽性率僅有20～30%；結(jié)核菌羅氏培養(yǎng)法陽性率雖相對高一些，但培養(yǎng)時間太久，一般需要6～8 周，難以滿足臨床快速診斷的需要。 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）是以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，在鏈置換DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒溫條件下進行擴增反應(yīng)[5]來對結(jié)核分枝桿菌復合群DNA 進行快速檢測, 其前處理簡便，且閉管無污染，1h 即可完成試驗。 目前，應(yīng)用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測肺結(jié)核患者痰液標本中的結(jié)核分枝桿菌雖在國內(nèi)外均有報道[6,7]，但在本省還較少涉及，本研究通過對涂片抗酸染色法、LAMP 法和改良羅氏培養(yǎng)法的陽性檢出率進行比較，來評估LAMP 法在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集140 例本院臨床診斷為肺結(jié)核或懷疑為肺結(jié)核患者的痰標本作為本研究對象。 囑所有的研究對象晨起涮口后留取深咳痰約3～5ml。

1.1.2 儀器及試劑 （1）奧林巴斯顯微鏡CH2，購自日本公司；（2）恒溫熒光核酸擴增儀（LF-10）及核酸提取或純化試劑盒，由日本榮研化學株式會社提供；（3）抗酸染色液自配，改良羅氏培養(yǎng)管購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；（4）BSC-ⅡB2 生物安全柜，購自濟南鑫貝西公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP 技術(shù)

1.2.1.1 DNA 提取 （1）用大口徑一次性吸管，從痰盒中吸取60μl 痰液加入榮研化學株式會社生產(chǎn)的核酸提取儀或純化試劑盒中的含有提取液的加熱管中；（2）顛倒混勻加熱管3～4 次后放入恒溫熒光核酸擴增儀（LF-10） 的加熱模塊中，90℃加熱5min，對分枝桿菌進行裂解和滅活；（3）從加熱器中取出加熱管，冷卻2min；（4）將加熱管放入吸附管中，用力搖動使粉末與液體完全混合；（5）將注射帽放在吸附管的接口處，旋緊固定；（6）滴加約30μl 液體到反應(yīng)管中。

1.2.1.2 LAMP 恒溫擴增 將榮研化學株式會社生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒中的反應(yīng)管放置到恒溫熒光核酸擴增儀（LF-10）的反應(yīng)模塊中，67℃反應(yīng)40min。

1.2.1.3 觀察結(jié)果 將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到熒光檢測器中，通過LED 燈觀察反應(yīng)管中有無熒光并記錄結(jié)果，有熒光反應(yīng)者為陽性，反之為陰性。

1.2.2 涂片抗酸染色 對同份痰標本同時進行涂片抗酸染色，鏡檢按照《痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》進行操作。

1.2.3 改良羅氏培養(yǎng) 將痰標本用乙酰半胱氨酸-NaOH 溶液液化15～20min，取液化好的痰標本200μl 接種于改良羅氏培養(yǎng)基管中，每份標本接種2 支培養(yǎng)管，于37℃進行培養(yǎng)。 若長出可見的典型菌落者判定為陽性，可疑菌落用涂片抗酸染色法進行鑒定，接種8 周仍未見菌落生長者則判定為陰性。

1.2.4 菌種鑒定 用對硝基苯甲酸（PNB）/ 噻吩-2-羧酸肼（TCH）培養(yǎng)基鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。

1.3 臨床診斷 以中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[8]作為臨床診斷依據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。 LAMP 法與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果的比較用配對χ2檢驗。 LAMP 法與改良羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果的一致性分析采用Kappa 指數(shù)法，Kappa 指數(shù)值越大，說明其吻合程度越高，Kappa 指數(shù)介于0.4～0.7 之間，提示吻合程度一般；Kappa 指數(shù)大于0.7，說明吻合性強。

2 結(jié)果

2.1 三種方法的陽性檢出率 140 份痰標本中涂片抗酸染色法、LAMP 法和改良羅氏培養(yǎng)法的陽性檢出率分別是25. 71%（36/140）、43.57%（61/140）和41.43%（58/140）。 LAMP 法的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法，其差異有統(tǒng)計學意義（配對χ2檢驗結(jié)果=19.36，查χ20.05，1=3.84，故P＜0.05）。 三種方法檢測結(jié)果的比較,見表1。

表1 三種方法檢測結(jié)果的比較

2.2 菌種鑒定結(jié)果 經(jīng)菌種鑒定，改良羅氏培養(yǎng)陽性的58 份痰標本中有57 份為結(jié)核分枝桿菌，1 份為非結(jié)核分枝桿菌。

2.3 LAMP 法與改良羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較將LAMP 法與改良羅氏培養(yǎng)法的檢測結(jié)果進行比較，兩法檢測結(jié)果的一致性κ=0.752，說明LAMP法在檢測結(jié)核分枝桿菌方面與改良羅氏培養(yǎng)法有較好的吻合性。 兩法檢測結(jié)果的比較,見表2。

表2 LAMP 法和改良羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較

3 討論

現(xiàn)階段，涂片抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法仍然是大多數(shù)結(jié)核病檢測實驗室主要的病原學檢測方法，但因檢出率、檢測時限等局限，這些方法已經(jīng)不能夠滿足臨床診療的需求。 隨著近年來對結(jié)核分枝桿菌全基因組的解析，一些通過檢測結(jié)核分枝桿菌DNA 來達到對結(jié)核病進行快速診斷的技術(shù)也隨之應(yīng)運而生[9]，其中，LAMP 法作為一種快速的分子檢測方法具有重要的意義[10]。

涂片抗酸染色法雖然具有操作簡單、 快速得出結(jié)果的優(yōu)勢，但只有當痰標本中的細菌含量達到5000～10000 條/ml 時,才能被涂片抗酸染色法檢出[11]，故靈敏度較低。 在本研究結(jié)果中，LAMP 法的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法。 有研究[12,13]顯示，LAMP 法在診斷結(jié)核病方面的表現(xiàn)優(yōu)于涂片抗酸染色法，這與本研究一致。

將改良羅氏培養(yǎng)的結(jié)果作為判斷金標準，并結(jié)合臨床診斷及患者使用抗結(jié)核藥物的反應(yīng)性綜合判斷，LAMP 法的敏感性為87.93%（51 ／ 58），特異性為87.80%（72 ／ 82）。 LAMP 法的靶序列均為結(jié)核分枝桿菌的特異性序列，因此無法識別痰標本中的非結(jié)核分枝桿菌。 隨著我國NTM 的臨床分離率的逐漸上升，這些用LAMP 法無法檢測到的非結(jié)核分枝桿菌使得其敏感性稍有降低[14]。

本研究中有10 份標本LAMP 法檢測為陽性而改良羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果為陰性。 其原因可能為培養(yǎng)法只能對活菌進行培養(yǎng)，而LAMP 法對沒有活性的菌株也能進行擴增[15]，所以會造成LAMP法檢測陽性而培養(yǎng)法為陰性的現(xiàn)象。 因此對陽性標本的判斷還應(yīng)結(jié)合臨床診斷及患者使用抗結(jié)核藥物的反應(yīng)性。 140 份標本中有7 份LAMP 法檢測結(jié)果陰性，而改良羅氏培養(yǎng)法的結(jié)果為陽性，除去1 例為非結(jié)核分枝桿菌外，可能存在的主要原因是兩種方法所用的是同一個病人的不同份標本。 有些病人因痰量少，會留兩到三份痰（菌量不均質(zhì)），若使用同一份標本進行三種方法的比較，同一性應(yīng)該會好一些。

有研究表明，LAMP 法在血痰標本中的陽性檢出率會低于涂片抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法，原因可能為血液成分中含有血紅蛋白等物質(zhì)，能夠抑制PCR 反應(yīng)，故造成陽性檢出率的降低[16]。 本研究中共有6 份血痰標本，其中有1 份涂片抗酸染色法與羅氏培養(yǎng)法均為陽性結(jié)果，而LAMP 法檢測為陰性結(jié)果，但因血痰樣本數(shù)量太少，無法判別是否存在差異。

本次研究所收集的標本中有一部分是臨床高度懷疑為肺結(jié)核患者的痰液，但是三種檢測方法的結(jié)果均為陰性，因此用三種方法檢測均為陰性的病人也不能完全排除肺結(jié)核的可能，導致陰性結(jié)果的原因與痰標本的質(zhì)量、 取樣時間以及排菌量等因素有關(guān)。

綜上所述，LAMP 法檢測痰標本中的結(jié)核分枝桿菌具有靈敏性高、特異性強，不需要昂貴的儀器設(shè)備、操作簡單安全、耗時較少等諸多優(yōu)勢，在肺結(jié)核的快速診斷中有很大的應(yīng)用價值。