酸堿指示劑在工業(yè)微生物高通量篩選中的應(yīng)用進展

楊 鑫,趙國淼,朱威宇,丁子元,鄭曉衛(wèi),楊 凱,孫玉婷

(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,北京 102209)

酸堿指示劑又稱pH指示劑、氫離子濃度指示劑,是于不同pH下顯示不同顏色的染料和色素,多為有機弱酸或有機弱堿,達到一定pH時染料和色素會與溶液中的H+或者OH-離子結(jié)合,轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)的酸式或堿式,進而顏色發(fā)生改變。染料和色素的pH變色靈敏度決定了酸堿指示劑的質(zhì)量。酸堿指示劑按傳統(tǒng)分類可分為含硝基的指示劑、酞類指示劑、磺酞類指示劑、甲氧基代三苯基甲醇衍生物、三芳基甲烷衍生物和氮萘系色素等;按結(jié)構(gòu)分類可分為偶氮染料、蒽醌染料、三芳甲烷染料、吖嗪、偶氮苯并噻唑、呫噸類、靛類、酚類、硝基類和噁嗪類;按《染料索引》分類可分為酸性染料、直接染料、媒介染料、堿性染料、溶劑染料、食品染料和天然染料;按顯色分類可分為單顯色、雙顯色和雙變色[1]。應(yīng)用酸堿指示劑的微生物篩選方法具有篩選速度快、篩選體系較小的特點,只需在反應(yīng)過程中產(chǎn)生質(zhì)子變化。雖然該篩選方法可以提高篩選效率,但是也存在幾點不足:靈敏度較差、溶液需澄清、反應(yīng)中需產(chǎn)生或消耗質(zhì)子[2]。

高通量篩選技術(shù),即大規(guī)模集群式篩選,是一種在新化合物開發(fā)及目標(biāo)菌種選育等方面廣泛應(yīng)用的技術(shù),具有高自動化、高靈敏度和高通量等特點。將直接的顏色反應(yīng)作為最簡便的追蹤反應(yīng)或代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法被廣泛應(yīng)用于高通量篩選方法的開發(fā),但不是所有的酶、產(chǎn)物都可以直接引起顏色變化,為了檢測一個沒有生色基團的底物反應(yīng),需要將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€有色化合物,酸堿指示劑通過將檢測目標(biāo)轉(zhuǎn)變成檢測質(zhì)子變化,可在復(fù)雜的后續(xù)試驗中迅速排除不匹配的酶或底物。早在1940年,酸堿指示劑即應(yīng)用于酶催化反應(yīng)中釋放或消耗質(zhì)子的檢測[3],1970年以來,酸堿指示劑法用來進行酶反應(yīng)的動力學(xué)分析[4]。如今,酸堿指示劑已廣泛應(yīng)用于pH檢測[5]、酶活檢測、產(chǎn)酸、菌株鑒別、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量跟蹤和食品質(zhì)量監(jiān)測等領(lǐng)域,天然、新型的酸堿指示劑也在逐漸被發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。因此,在工業(yè)微生物篩選過程中,酸堿指示劑雖然可以有效區(qū)分微生物突變株之間或者酶突變體之間的巨大差異,但不能準(zhǔn)確定量檢測,且由于其低靈敏度和容易受到微量副產(chǎn)物的干擾,故常用于功能微生物和酶的初級篩選,在犧牲部分準(zhǔn)確度的情況下提高篩選通量,以達到高通量篩選的目標(biāo)。

1 酸堿指示劑的選擇

1.1 酸堿指示劑的選擇

酸堿指示劑的選擇需注意:1) 酸堿指示劑的變色范圍與化學(xué)計量點吻合或接近;2) 酸堿指示劑的變色范圍越窄越好,一般變色范圍是1.6～1.8個pH單位;3) 顏色變化明顯,便于判斷和觀察。酸堿指示劑應(yīng)用中最關(guān)鍵的3個參數(shù)是變色范圍、λmax(最大吸收波長)和pKa參數(shù)(解離常數(shù))值。水溶液中常用酸堿指示劑pKa,λmax和變色范圍[6]如表1所示。

表1 水溶液pH指示劑參數(shù)表

選擇酸堿指示劑時最重要的考慮因素是緩沖體系和酸堿指示劑的電離特性。緩沖液和酸堿指示劑對質(zhì)子的親和力必須相同,即pKa值相差<0.1,pH變化時緩沖液質(zhì)子化和酸堿指示劑質(zhì)子化的相對數(shù)量一致。同時,酸堿指示劑的pKa需與反應(yīng)體系的pH接近,以使pH的變化帶來較大的、線性的顏色變化[7]。Morís-varas等[4]建立了快速篩選水解酶庫的方法,該方法適用于大多數(shù)脂肪酶、酯酶,磷酸緩沖液pH 7.2與溴麝香草酚藍、苯酚紅的pKa值接近,且顏色轉(zhuǎn)換具有強烈的反差。

1.2 植物基天然色素的選擇

植物基天然色素因來源廣泛、廉價易得、天然環(huán)保,成為替代合成染料的最優(yōu)選擇。天然色素有花青素、姜黃素、紫草素、茜素紅和甜菜色素等。天然可食用酸堿指示劑通常是弱有機酸,顏色隨周圍環(huán)境酸堿度的改變而改變。其顏色變化是基于生色團分子水平上的能級躍遷,當(dāng)聚合物中含有非鍵電子對的基團時,生色團的吸收峰向長波方向移動并增強吸光度,同時取代基的引入或溶劑改變使聚合物的最大吸收波長和吸收強度發(fā)生變化。天然色素通常于酸性條件下顏色較為穩(wěn)定,于堿性條件下容易發(fā)生降解。選擇天然酸堿指示劑時,染料需要與分析物發(fā)生強烈的反應(yīng)、與生色團有強烈的顏色反應(yīng),且反應(yīng)前后色差明顯,檢測結(jié)果可靠、可重復(fù)[8]。部分天然pH指示劑的變色范圍[6]如表2所示。

表2 部分天然酸堿指示劑變色范圍

1.3 新型合成酸堿指示劑

相較于傳統(tǒng)酸堿指示劑,新型合成酸堿指示劑改進了合成工藝路線,減少了污染,靈敏度和穩(wěn)定性相應(yīng)提高。1-8萘二酰亞胺為pH熒光指示劑,可利用分子內(nèi)部的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移體系,轉(zhuǎn)移體系由包含電子給體的受體部分,通過間隔基S和熒光F相連而構(gòu)成。熒光團與受體單元之間存在光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移,對熒光有非常強的淬滅作用,通常是電子從供體轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團。在結(jié)合客體前,探針分子不發(fā)射熒光或熒光很弱;一旦受體與客體結(jié)合,光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用受到抑制,甚至被完全阻斷,熒光團就會發(fā)射熒光。當(dāng)環(huán)境中不存在H+時1-8萘二酰亞胺無熒光,存在H+時其熒光釋放。1-8萘二酰亞胺的最大激發(fā)、發(fā)射波長分別為405,530 nm,最適濃度為10-5mol/L,且培養(yǎng)基成分對其熒光信號無影響,具有良好的生物相容性[9]。羅丹明B具有水溶性好、量子產(chǎn)率高、消光系數(shù)大、低毒和易制備的優(yōu)勢,多用于pH檢測,在中性、堿性環(huán)境下不產(chǎn)生熒光,在酸性環(huán)境下激發(fā)熒光。羅丹明酰肼的激發(fā)、發(fā)射波長分別為563,580 nm,最適濃度為25 μmol/L,李虹慶[10]合成該熒光探針應(yīng)用于高產(chǎn)聚蘋果酸菌株的篩選,于1 000余株突變體庫中篩選得到一株產(chǎn)量提升15.3%的突變株。

2 酸堿指示劑在功能菌株篩選中的應(yīng)用

2.1 酸堿指示劑在平板快速分離篩選中的應(yīng)用

根據(jù)篩選目標(biāo)選擇酸堿指示劑加入固體培養(yǎng)基中,實現(xiàn)目標(biāo)微生物的快速鑒別,即變色圈法。將待篩選菌懸液涂布于篩選固體培養(yǎng)基上,生長出的單菌落種類、性能不同,肉眼可明顯區(qū)分開,實現(xiàn)快速分離篩選。培養(yǎng)基中常用的指示劑及變色范圍[1]如表3所示。

表3 培養(yǎng)基常用的指示劑及其變色范圍

以伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基(EMB)為鑒別培養(yǎng)基,可通過肉眼辨別顏色來區(qū)分近似菌落。大腸桿菌于EMB培養(yǎng)基上分解乳糖產(chǎn)酸,菌落被染成紅色,再與美藍結(jié)合形成紫黑色菌落,并帶有綠色金屬光澤;產(chǎn)氣桿菌則形成呈棕色的大菌落;沙門氏菌等在堿性環(huán)境中不分解乳糖,伊紅和美藍不能結(jié)合,故其菌落呈無色或琥珀色半透明。結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)常用于腸道菌計數(shù),添加的酸堿指示劑為中性紅,其中大腸桿菌、陰溝腸桿菌菌落為紫紅色,周圍有紅色沉淀環(huán);沙門氏菌菌落為無色透明。溴甲酚綠常用于產(chǎn)酸微生物的篩選,其添加質(zhì)量濃度為0.06 g/L,隨著產(chǎn)酸菌株的生長菌落周圍形成黃色的變色圈。采用酸堿指示劑平板快速篩選法可實現(xiàn)鑒別微生物、篩選高產(chǎn)菌株的目的,實現(xiàn)定性、半定量篩選。

2.2 酸堿指示劑在高產(chǎn)酶的工業(yè)微生物篩選中的應(yīng)用

菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的關(guān)鍵,菌種選育的目標(biāo)是改良已知菌種或生產(chǎn)菌株,使其符合工業(yè)生產(chǎn)要求的產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好的要求。高通量篩選技術(shù)可以有效提高高產(chǎn)酶菌株的篩選效率,其中準(zhǔn)確、快速的篩選方法是關(guān)鍵。酸堿指示劑常用于酶催化反應(yīng)中釋放或消耗質(zhì)子的檢測。許多水解反應(yīng)均伴隨pH的變化,如氨基酸脫羧酶、碳酸酐酶、膽堿酯酶、己糖激酶、蛋白酶、腈水解酶和酯水解酶等[5],可以根據(jù)反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)平衡常數(shù)選擇合適的酸堿指示劑以準(zhǔn)確地檢測水解反應(yīng)速率。

酯酶(酯水解酶,EC3.1.1.3)是一類既可催化酯鍵水解,又可催化酯鍵合成的酶的總稱。催化酯鍵水解時,酯鍵斷裂生成醇和酸。Camacho-Ruiz等[7]應(yīng)用溴甲酚綠作為酸堿指示劑方便快速地檢測短鏈、中鏈酯酶活性,pH指示范圍為5.0～9.2,檢測極限達1 μg游離脂肪酸、1 ng酶。酸堿指示劑為不同生物樣品中脂肪酶[11]和脂肪酶抑制劑的高通量篩選提供了有效的篩選工具,亦可用于脂肪酶或酯酶純化過程中酶活的快速檢測。

腈水解酶[12]是一類將腈類化合物直接催化合成相應(yīng)的羧酸和NH3的可用于生物催化反應(yīng)的酶類,反應(yīng)溫和高效,不產(chǎn)生酰胺。產(chǎn)腈水解酶的微生物將腈類化合物分解成羧酸,環(huán)境的pH發(fā)生改變,采用溴百里香酚藍(pKa=7.3,pH指示范圍6.0～7.6,顏色由綠色變化到黃色)作為酸堿指示劑,其配制為m(溴百里香酚藍)∶V(反應(yīng)體系)=0.1 g∶100 mL。溴百里香酚藍的顏色變化肉眼可見,于616 nm波長處具有最大吸收,其吸光度與質(zhì)子釋放呈線性相關(guān)性[13]。Banerjee等[14]將該方法用于扁桃腈酶活性篩選,從菌種庫中篩選得到7株候選菌株。Kaul等[15]通過該方法,獲得3種對苯乙腈具有較高對映選擇性的產(chǎn)腈水解酶菌株。因此,酸堿指示劑可簡單、快速、直接地指示腈水解酶活性,其操作簡單、成本低、耗時短,契合高通量篩選技術(shù)的需求。

微生物鹵代烷烴脫鹵酶是降解鹵代脂肪族化合物的關(guān)鍵酶類,催化鹵代脂肪族化合物的碳-鹵鍵的斷裂,生成對應(yīng)的醇、鹵素離子和一個質(zhì)子,催化過程中不需要氧氣、能量或輔酶/輔基,是一條生物減毒和生物降解的簡單路線,具有重要的環(huán)境價值和生物技術(shù)意義。采用溴麝香草酚藍作為pH指示劑,濃度為1 mmol/L,于620 nm進行吸光度檢測。溴麝香草酚藍于pH 6.0～7.6時靈敏度較高,其顏色隨著酶反應(yīng)過程中質(zhì)子的增加由藍色向黃色轉(zhuǎn)變。酸堿指示劑法用于篩選鹵代烷烴脫鹵酶提高了突變庫的篩選通量,通過檢測質(zhì)子釋放速率,確定酶活性高的突變株。Zhao[16]應(yīng)用易錯PCR進行迭代突變,獲得一株于53 ℃下熱鈍化半衰期延長140倍的突變株,比酶活較原始酶提高10倍。

黑曲霉產(chǎn)酶過程中會帶來發(fā)酵液pH的變化,且呈現(xiàn)負相關(guān)性,因此,可將酸堿指示劑信號表征轉(zhuǎn)換成酶活信號,實現(xiàn)酶活的高通量、快速、準(zhǔn)確和實時的監(jiān)測。朱旭東[9]在黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)糖化酶過程中,發(fā)現(xiàn)酶活性與pH存在極好的負相關(guān)關(guān)系,且重復(fù)性好,作者使用甲基橙作為酸堿指示劑。甲基橙的最大吸收波長為507 nm,隨著pH的升高,顏色由紅色逐漸變黃,甲基橙的配制為m(甲基橙)∶V(水)=0.1 g∶100 mL,檢測體系中甲基橙添加體積分?jǐn)?shù)為10%,反應(yīng)時間為10 min。應(yīng)用該方法于1 200余株黑曲霉突變株中篩選得到酶活性提高70%的突變株。

酸堿指示劑雖然在產(chǎn)酶[17]工業(yè)微生物篩選中的應(yīng)用具有適用范圍廣、操作簡單、成本低和耗時短等優(yōu)勢,但在微生物全細胞快速篩選過程中,菌體的存在或者某種絡(luò)合物的存在會對吸收值產(chǎn)生干擾,且部分酸堿指示劑的溶解性較差,需要選擇合適的共溶劑或乳化劑處理才能進行檢測。

2.3 酸堿指示劑在工業(yè)微生物產(chǎn)酸性能篩選中的應(yīng)用

微生物代謝過程中合成有機酸[18-19]會導(dǎo)致發(fā)酵液pH的變化,隨著產(chǎn)酸量的提高,pH逐漸降低,酸堿指示劑顏色逐漸變化,肉眼可實時觀察,操作簡單、快速和高效。涂光偉等[20]應(yīng)用酸堿指示劑篩選高產(chǎn)聚蘋果酸菌株,利用聚蘋果酸分子結(jié)構(gòu)中的弱酸基團(—COOH),溴甲酚綠作為指示劑,通過發(fā)酵液的顏色變化來指示產(chǎn)酸能力。出芽短梗霉產(chǎn)生的有機酸主要是聚蘋果酸,其次是乳酸、乙酸和琥珀酸等雜酸,且總雜酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。涂光偉等[20]首先建立了發(fā)酵液pH與氫離子濃度的響應(yīng)模型,然后通過遺傳算法迭代處理,建立非線性擬合發(fā)酵液中聚蘋果酸質(zhì)量濃度與環(huán)境pH的響應(yīng)模型。筆者應(yīng)用該篩選模型篩選得到一株聚蘋果酸產(chǎn)量提高24.5%的突變株。馬武[21]于1985年將酸堿指示劑用于谷氨酸生產(chǎn)菌的復(fù)壯分純,培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為5%的酚紅溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%),通過指示劑顏色的變化來控制流加尿素量。該方法大大簡化了pH檢測流程,提高了試驗平行性,酸堿指示劑對發(fā)酵產(chǎn)酸無影響。Lü等[22]將溴甲酚綠用于高產(chǎn)乳酸凝結(jié)芽孢桿菌的初級篩選,高效液相色譜、氣相色譜和生物傳感器等方法都嚴(yán)重限制了篩選通量。添加的溴甲酚綠的質(zhì)量濃度為0.06 g/L,最大吸收波長為616 nm,乳酸濃度從0 mol/L增加到1.2 mol/L,溶液的顏色由藍色變?yōu)辄S色。

3 結(jié) 論

以應(yīng)用酸堿指示劑為代表的高通量篩選方法,是當(dāng)前工業(yè)微生物篩選酶、代謝產(chǎn)物的主要研究和發(fā)展方向。酸堿指示劑種類多,可覆蓋整個pH范圍,具有特征吸收波長,在指示范圍內(nèi),吸光度與pH具有良好的線性關(guān)系,可廣泛應(yīng)用于有質(zhì)子吸收或釋放的反應(yīng)體系。釀酒過程中有強大、復(fù)雜的微生物體系,不同的功能微生物具備不同的酶活性,它們相互協(xié)作并代謝產(chǎn)生多種功能成分,酸堿指示劑高通量篩選方法可有效應(yīng)用于釀造過程中功能微生物的篩選,提高篩選效率,簡化篩選難度。篩選過程中可結(jié)合平板初篩、液體培養(yǎng)酸堿指示劑顯色定量復(fù)篩和搖瓶驗證的篩選路線,實現(xiàn)微生物高通量乃至超高通量篩選。中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司高通量篩選平臺已建立覆蓋pH為3～11的酸堿指示劑篩選方法,應(yīng)用于多種酶活性、有機酸功能菌株的篩選。為了使酸堿指示劑法在高通量篩選技術(shù)中應(yīng)用更廣泛,還需進一步研究酸堿指示劑在不同酶活性檢測、代謝產(chǎn)物檢測等方面的適配性與專一性,降低干擾物質(zhì)對其準(zhǔn)確性的影響,提高篩選準(zhǔn)確度。