一種新的空腸彎曲菌外膜囊泡提取方法的建立

聶翔，王涓，吳清平，張菊梅，馬國祥，汪智,3，唐勝君，潘琪琪，張偉培，肖鎧姍

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東廣州 510070）（3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs），是一種直徑在20～250 nm 之間的球形結(jié)構(gòu)[1-2]，主要由革蘭氏陰性菌在生長過程中于細菌表面形成并分泌到胞外[3]，內(nèi)含脂多糖、外膜蛋白、磷脂及DNA/RNA 等成分[4-6]。1963 年首次通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)緊挨著細菌細胞壁處存在囊泡狀的物質(zhì)，并認(rèn)為它可能和細菌的功能有關(guān)[7]。直到1999 年，Beveridge 等[8]再次通過電鏡觀察到OMVs，研究發(fā)現(xiàn)其存在多種與致病相關(guān)的物質(zhì)，逐漸引起研究人員的重視。目前研究的焦點主要是OMVs 的生物學(xué)功能，如促進生物膜形成，作為毒力基因、活性物質(zhì)和信號分子等的傳輸載體，促進細胞間相互交流，與宿主細胞相互作用誘導(dǎo)免疫應(yīng)答等[9-16]。

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是一種人畜共患的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于雞鴨等家禽中，從20 世紀(jì)80 年代起就受到國內(nèi)外廣泛重視。人感染空腸彎曲菌會導(dǎo)致急性細菌性腸炎，嚴(yán)重者還會導(dǎo)致格林-巴利綜合征（GBS）[17]?？漳c彎曲菌具有多種潛在的毒力因子，包括細胞毒素[18-19]和各種酶類[20-22]，但缺乏類似其他腸道病原體能直接將效應(yīng)物傳遞給靶細胞的經(jīng)典毒性相關(guān)分泌系統(tǒng)[23]。在一些菌株中也發(fā)現(xiàn)了VI 型分泌系統(tǒng)（T6SS）的存在，但是對于空腸彎曲菌中T6SS 的功能仍然不是很了解[24-25]。而OMVs是目前發(fā)現(xiàn)的另外一種毒力傳遞機制，它是革蘭氏陰性菌中一種獨有的分泌系統(tǒng)?，F(xiàn)有研究證明空腸彎曲菌OMVs 中確實存在一系列的毒力因子，如能促進空腸彎曲菌入侵腸上皮細胞的細胞質(zhì)擴張毒素和致病性相關(guān)的蛋白酶[21-22]。病原體的一個重要特征是能夠感知環(huán)境，并適當(dāng)?shù)馗淖兒驼{(diào)節(jié)毒力因子[26]。當(dāng)空腸彎曲菌的生長溫度從37 ℃從改變?yōu)?2 ℃時，OMVs 的蛋白質(zhì)豐度也發(fā)生了變化，37 ℃時OMVs 中蛋白質(zhì)PEB4 和PEB1 的豐度增加[27]。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)PEB4 蛋白在空腸彎曲菌生物膜形成、運動及宿主細胞入侵中起重要作用[28-30]。PEB1 蛋白在與上皮細胞相互作用和在小鼠腸道定植中發(fā)揮作用[31]。另外，在空腸彎曲菌培養(yǎng)物中添加牛黃膽酸鈉（ST），能增加OMVs 的蛋白水解活性、細胞毒性和腸上皮細胞的免疫原性[22]。因此，OMVs 中含有的各種生物分子對空腸彎曲菌的生存和致病性起到關(guān)鍵性作用。

OMVs的提取是研究OMVs與空腸彎曲菌生物膜形成、耐藥性、毒力及與宿主間相互作用的基礎(chǔ)。因此，開發(fā)一種快速、高效的空腸彎曲菌OMVs 的提取方法具有重要意義?，F(xiàn)有研究中超速離心法是OMVs提取的經(jīng)典方法[26-32]，但其OMVs 回收率低，不適用于OMVs 需求量大的實驗。超濾法能收集并提取大量樣本中的OMVs，可滿足研究要求。因此本研究首先通過比較菌株在不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間及不同氧氣環(huán)境下的生長情況，確定空腸彎曲菌在液體環(huán)境中的最適生長條件，然后利用超濾濃縮法從培養(yǎng)的菌液中提取OMVs 并對其特性進行鑒定。本研究建立了適用于空腸彎曲菌OMVs 的提取體系，為建立高回收率的OMVs 制備方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實驗所用的空腸彎曲菌為本實驗室分離與保存。所有目標(biāo)空腸彎曲菌鑒定按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 空腸彎曲菌檢驗》GB 4789.9-2014方法進行。

1.1.2 材料與試劑

血平板、MH 肉湯粉末、布氏肉湯粉末、BHI 肉湯粉末、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、96 孔板，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸和N-（2-羥乙基）哌嗪-N'-2-乙烷磺酸粉末（HEPES）、氯化鈉（NaCl）、乙酸、乙醇、硫代硫酸鈉、醋酸鈉，均購自廣州諾德生化科技有限公司；碳酸鈉，購自廣州化學(xué)試劑廠；硝酸銀、甲醛，購自美國Sigma 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，購自廣州捷威斯生物公司；100 ku 超濾離心管，購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；超速離心管，購自美國Beckman Coulter 公司。Anti-Major outer 膜蛋白抗體（cj-01）（一抗），購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；6×protein、Anti-Mouse IgG HRP（二抗）和顯影液EasySee? Western Blot Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱CB220，購自德國BINDER公司；大型高速冷凍離心機J-26 XP，購自德國Beckman avanti 公司；超速離心機（Optima XPN-100）和配套SW32Ti 水平轉(zhuǎn)子，均購自美國Beckman Coulter 公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)

將-80 ℃凍存的空腸彎曲菌接種于血平板，42 ℃培養(yǎng)48 h,挑取單菌落于血平板增菌，42 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細菌在液體環(huán)境中最適生長條件的優(yōu)化

（1）1液體培養(yǎng)基

配制MH、布氏及BHI 液體培養(yǎng)基，將增菌后的菌株用棉簽從血平板上轉(zhuǎn)移至上述三種不同的培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液的初始OD600為0.20，42 ℃培養(yǎng)并測定其在液體培養(yǎng)基中的生長曲線，確定空腸彎曲菌液體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

（2）2培養(yǎng)時間

菌株增菌后用棉簽從血平板上轉(zhuǎn)移至MH 液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液的初始OD600為0.001、0.005、0.01、0.05，42 ℃培養(yǎng)并測定其在液體培養(yǎng)基中的生長曲線，確定空腸彎曲菌液體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)時間。

（3）3氧氣環(huán)境

增菌后的菌株用棉簽從血平板上轉(zhuǎn)移至MH 液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液的初始OD600為0.01，將其分別置于大氣環(huán)境和微需氧環(huán)境下培養(yǎng)菌株的生長情況，確定空腸彎曲菌液體培養(yǎng)的最適氧氣條件。

1.2.3 超濾濃縮法提取OMVs

將培養(yǎng)后的菌液以4800 r/min，4 ℃離心30 min，收集上清，用0.22 μm 的微孔濾頭過濾，將過濾后的上清用截留相對分子質(zhì)量100 ku 的超濾離心管以5200 r/min，4 ℃離心20 min，重復(fù)多次，直至最后的液體體積為原體積的1/6。將濃縮后的上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管，29600 r/min，4 ℃超速離心3 h，棄去上清，將沉淀重懸于2 mL 0.01 mmol/L 的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，用0.22 μm 的微孔濾頭過濾鞭毛等雜質(zhì)，4 ℃保存。

1.2.4 SDS-PAGE 檢測OMVs 內(nèi)的蛋白

配制SDS-PAGE 凝膠，下層為12%的分離膠，上層為6%的濃縮膠。將提取的OMVs 樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)垂直電泳分離后，取下蛋白膠用超純水清洗，固定液（20 mL 乙醇、5 mL 冰醋酸、25 mL 超純水）固定30 min，用增敏液（15 mL 乙醇、35 mL 超純水、0.1 g 硫代硫酸鈉、3.4 g 醋酸鈉）增敏30 min，超純水洗三次，每次5 min，隨后配制銀染液（0.0625 g 硝酸銀粉末、25 mL 超純水、10 μL 甲醛）銀染20 min，超純水洗二次，每次1 min，最后用顯色液（1.25 g 碳酸鈉、50 mL 超純水、10 μL 甲醛）顯色2～5 min，EDTA（0.73 g EDTA-Na2-2H2O、50 mL 超純水）反應(yīng)10 min 終止顯色，超純水洗三次，每次5 min，觀察蛋白質(zhì)條帶。

1.2.5 透射電鏡觀察OMVs 形態(tài)

將提取的OMVs 樣品滴加到碳包覆銅網(wǎng)上，滴加2%醋酸雙氧鈾，PBS 洗三次，室溫干燥，在電鏡下進行檢測。

1.2.6 OMVs 總蛋白濃度檢測

用BCA 蛋白濃度試劑盒測定提取的OMVs 蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)試劑盒說明進行樣品處理，用酶標(biāo)儀進行檢測其OD562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出OMVs 中蛋白濃度。

1.2.7 Western blotting 檢測外膜蛋白

（1）1全菌蛋白的提?。簩⒀桨迳吓囵B(yǎng)的菌轉(zhuǎn)移到裝有1 mL PBS 的離心管中，5880 r/min 離心5 min，去掉上清，沉淀用PBS 重懸，重懸液超聲破碎5 min（功率40%），得到全菌蛋白溶液。

（2）2可溶蛋白和膜蛋白的提?。和瑯訉⒀桨迳吓囵B(yǎng)的菌轉(zhuǎn)移到裝有1 mL PBS 的離心管中，5880 r/min 離心5 min，去掉上清，沉淀用PBS 重懸，重懸液超聲破碎5 min（功率40%），之后8652 r/min 離心5 min，收集上清液在24200 r/min 下超速離心1 h，吸取最上層500 μL 作為可溶蛋白；8652 r/min 離心的沉淀用PBS 洗3 次，之后加入500 μL 1% Triton X-100，8652 r/min 離心5 min，上清為膜蛋白。

（3）3Western blot 分析：取30 μL 空腸彎曲菌的可溶蛋白、膜蛋白、全菌蛋白及OMVs 進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)垂直電泳分離后，取出蛋白膠，按順序排好蛋白膠、PVDF 膜和濾紙的位置，排氣泡后放入模具內(nèi)；整個電泳裝置置于含冰水混合物的冰盒中，轉(zhuǎn)膜條件為55 V 恒壓工作1.5 h；將膜浸泡5%脫脂奶粉中室溫封閉液1 h，用PBS-T 溶液洗膜，10 min/次，洗3 次；加入按1:5000 配制的含有一抗的溶液，室溫下振蕩孵育1 h，用PBS-T 溶液洗3 次；再加入按1:10000 配制的二抗溶液孵育45 min，用PBS-T溶液清洗3 次；配制顯影液對PVDF 膜進行顯影，曝光時間15 s，用Image Lab 圖像分析系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 空腸彎曲菌在液體環(huán)境中的最適生長條件

細菌的OMVs 一般是在液體環(huán)境下釋放的，在對數(shù)后期分泌較為旺盛[26]，為保證OMVs 的高回收率，則需要對空腸彎曲菌的液體培養(yǎng)環(huán)境進行優(yōu)化，從培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)的氧氣環(huán)境三方面使其達到最佳的生長狀態(tài)。首先，探索了氣體環(huán)境對于空腸彎曲菌的影響，發(fā)現(xiàn)在微需氧的條件下，菌株的生長能力更強（圖1a），因此，后期的實驗均是在此條件下進行。接著，探索了接種量對于空腸彎曲菌的影響，發(fā)現(xiàn)接種量越高，菌株的生長能力越強，但其達到對數(shù)生長期的時間幾乎相似（圖1b），均為12 h，為保證OMVs 分泌量，選擇15 h 作為菌株在液體培養(yǎng)中的最佳時間。后期選擇了較高的接種量進行試驗，并探索不同培養(yǎng)基對菌體生長的影響，發(fā)現(xiàn)在MH 肉湯中，其OD600能達到0.60，最終菌體密度能達到其他兩種培養(yǎng)基的3 倍左右（圖1c）。因此，空腸彎曲菌在MH液體培養(yǎng)基中微需氧培養(yǎng)15 h是提取OMVs的最適生長條件，與文獻報道相符[27]。

圖1 空腸彎曲菌液體培養(yǎng)的最適條件Fig.1 Optimum conditions for liquid culture of Campylobacter jejuni

2.2 OMVs 電鏡形態(tài)

為更好的研究空腸彎曲菌OMVs的組成部分及生物學(xué)性質(zhì)，需要建立一種快速有效的OMVs提取體系。國內(nèi)關(guān)于空腸彎曲菌OMVs 研究尚未見報道，因此本研究建立了從空腸彎曲菌菌液中提取OMVs 的方法。將提取的樣品在電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)均為50～300 nm 間的球形囊泡狀結(jié)構(gòu)，符合OMVs 的形態(tài)特征（圖2）。

圖2 OMVs 電鏡形態(tài)Fig.2 The morphology of OMVs observed by electron microscopy

目前，差速離心法（differential centrifugation）因其工藝簡單，底物可重復(fù)利用等優(yōu)點成為分離提取OMVs 最常見最基本的方法[33]。其原理即低速與高速離心交替進行，根據(jù)沉降系數(shù)的不同依次除去不同的雜質(zhì)，最終利用超高速離心力使囊泡沉淀在底部達到分離的目的。超濾濃縮法是在差速離心之前，用特定孔徑的濾膜進行樣品濃縮，提高OMVs 的回收率。根據(jù)文獻報道[34]，研究人員常采用100 ku 濾膜進行過濾濃縮，本實驗中同樣采用100 ku 濾膜進行濃縮，電鏡下可以看到OMVs 數(shù)量較多（圖2）。張佳星等[34]利用超濾濃縮提取的銅綠假單胞菌OMVs中存在細胞碎片、鞭毛等多種雜質(zhì)，而本研究在重懸沉淀之后，用0.22 μm 的微孔濾頭對OMVs 進行了過濾，去除了部分雜質(zhì)，圖中僅能看到少數(shù)截斷的鞭毛（圖2）。因此，建立的超濾濃縮法適合于空腸彎曲菌OMVs 的提取。

2.3 OMVs 中的蛋白質(zhì)含量

注：BSA：胎牛血清蛋白；M：250 ku 的蛋白預(yù)染Marker。此前研究表明OMVs 中含有大量蛋白質(zhì)[6]，因此利用SDS-PAGE 及BCA 蛋白測量試劑盒對提取的OMVs 中的蛋白質(zhì)進行了測定。SDS-PAGE 鑒定結(jié)果顯示，OMVs 中包含多種不同大小的蛋白質(zhì)，其條帶范圍在15～250 ku 之間（圖3）。根據(jù)BCA 蛋白濃度測定試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品檢測值與對應(yīng)濃度繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.0004x+0.1108，R2=0.99。通過待測樣本OD562值計算待測樣品濃度，結(jié)果顯示提取的OMVs 中蛋白質(zhì)濃度為40.50 mg/mL（圖4）。因此，本研究建立的超濾濃縮法提取體系可在短時間內(nèi)從較大的樣本量中分離得到大量富含蛋白質(zhì)成分的OMVs。除超濾濃縮法外，另外一些分離OMVs 的方法還有色譜分析法（chromatography）[35]。尺寸排阻色譜法[33]是色譜分析法的一種，其利用分子篩選效應(yīng)，對通過色譜柱的分子進行分離，可以獲得不同分子量的囊泡，但有些分子質(zhì)量相近的物質(zhì)無法完全分離。近年來又出現(xiàn)了一些新的分離純化方法，例如免疫親和層析分離（immunoamnity isolation）、試劑盒法、聲納過濾系統(tǒng)（acoustic nano-filter system）等[36-37]。免疫親和層析分離[36]可以利用抗原抗體的相互作用來分離囊泡，雖然分離得到的囊泡純度非常高，但需要OMVs 中具有特定的抗原，分離后對抗原抗體進行相應(yīng)檢測。因此它分離所需成本較高，且操作步驟較為繁瑣。而本研究中超濾濃縮法提取空腸彎曲菌OMVs 僅需4 h 左右便可完成，時間短，且操作簡單。

圖3 空腸彎曲菌OMVs SDS-PAGE 鑒定Fig.3 Identification of Campylobacter jejuni OMVs by SDS-PAGE

圖4 OMVs 的蛋白質(zhì)濃度Fig.4 Total protein concentration of OMVs

2.4 OMVs 驗證

圖5 空腸彎曲菌OMVs 的Western blot 分析Fig.5 Western blot analysis of outer membrane protein of Campylobacter jejuni

目前研究報道[38]OMVs 是由外膜突起形成的，且含有外膜蛋白的成分，因此實驗選用空腸彎曲菌Anti-Major outer 膜蛋白抗體（cj-01）靶向超濾濃縮法分離得到的產(chǎn)物，進而表征提取物中的主要成分是否為OMVs。Western Blotting 結(jié)果顯示，空腸彎曲菌的可溶蛋白沒有條帶，而膜蛋白、全菌蛋白及OMVs 均顯示出46 ku 的正確條帶，證明了OMVs 的存在。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究首先確定了空腸彎曲形成最佳條件，通過超濾濃縮法從菌液中提取OMVs，通過透射電鏡、蛋白質(zhì)含量測定、特定外膜蛋白抗體等實驗分別對其形態(tài)、純度、含量及成分進行分析，表明本文所建立的方法OMVs 提純效率高、質(zhì)量較好。因此，本研究成功建立了一種從液體培養(yǎng)基中提取空腸彎曲菌OMVs 的提純體系，為后續(xù)研究空腸彎曲菌中OMVs 生物學(xué)功能提供技術(shù)支持。