低溫等離子體對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的殺菌效果及動力學特性

劉雅夫，符騰飛，劉宸成，陳姑，王佳媚

（海南大學食品科學與工程學院，海南海口 570000）

在過去幾十年中，人們對健康生活方式的需求日益增加，這刺激了對生鮮類或低加工食品的市場需求[1]。然而，生鮮類食品受微生物污染存在安全隱患，傳統(tǒng)熱殺菌方法處理會降低其感官品質，因此，開發(fā)非熱殺菌是解決生鮮食品殺菌技術的關鍵。近年來，低溫等離子體作為一種新型的冷殺菌技術正受到越來越多的關注。低溫等離子體設備運行成本低，能夠產(chǎn)生多種高活性殺菌成分，殺菌效率高且反應后無殘留，同時，處理過程中保持接近室溫的溫度，不會對產(chǎn)品造成熱力損傷，可以很好的應用于生鮮食品[2-3]。

等離子體激發(fā)過程中的化學反應非常復雜，涉及上千個反應，它們的壽命從數(shù)納秒到數(shù)小時不等[4]。通常認為在等離子體殺菌過程中起主要作用的成分，包括活性氧物質（如H2O2、O3、O2-·、HO2·、RO·、ROO·、1O2、·OH 和CO3-·）和活性氮（如·NO、·NO2、ONOO-、OONOH、ROONO）[5]、帶電粒子、紫外線輻射和電場等[6]。這些活性物質形成的反應過程，包括電子碰撞過程（振動、激發(fā)、解離、附著和電離）、離子-離子中和、離子分子反應、潘寧電離、猝滅、三體中性復合和中性化學，光電發(fā)射、光吸收和光電離等[7]。形成的活性氧、活性氮以及各種反應會對微生物的DNA、細胞內成分（蛋白質、脂類、碳水化合物）以及細胞膜和細胞壁（孔隙形成、滲透和破壞）造成損傷，導致細胞內成分泄漏，最終引起細胞死亡[8-9]。低溫等離子體中的活性物質及其含量受多種因素影響，如等離子體激發(fā)介質氣體成分、等離子體激發(fā)裝置的類型、輸入功率、處理時間和濕度水平等[10]。目前，關于低溫等離子體對微生物細胞的作用機制尚為完全統(tǒng)一。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus，G+），是一種常見的的人畜共患病病原菌，廣泛分布于各種食品中，能產(chǎn)生腸毒素，可引起急性腸胃炎[11-12]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa，G-），對化學藥物的抵抗力比一般革蘭氏陰性菌強，廣泛存在于水、土壤、空氣和動物機體中[13]，常會引起呼吸系統(tǒng)感染、腸道傳染病感染和傷口形成綠色膿液等[14-15]癥狀。

介質阻擋放電（Dielectric Barrier Discharge，DBD）是最常用的大氣壓下產(chǎn)生低溫離子體技術，本研究中采用此技術處理菌懸液，研究不同處理條件因素影響，分析低溫等離子體的殺菌效果，通過Linear、Weibull和Log-linear+Shoulder+Tail 三種殺菌動力學模型，擬合低溫等離子體對S.aureus和P.aeruginosa的殺菌動力學曲線，分析均方根誤差（RMSE）、決定系數(shù)（R2）、精確因子（Af）和偏差因子（Bf）評價三種模型的擬合效果，旨在篩選出最適合描述低溫等離子體殺菌過程的動力學模型，為食品殺菌技術提供理論指導[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌（S.aureus，ATCC 6538）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；銅綠假單胞菌（P.aeruginosa，CICC 21643）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

營養(yǎng)肉湯（NB）和平板計數(shù)瓊脂（PCA），青島海博生物技術有限公司；PBS 緩沖液，北京白鯊易科技有限公司；氯化鈉分析純，廣州化學試劑廠。

PL303 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；722G 紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限公司；GHP-9160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16MS 型臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BK130/36 高壓電轉換器，美國PHENIX 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

液體培養(yǎng)基，稱取營養(yǎng)肉湯（NB）1.8 g，溶于100 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養(yǎng)基，稱取平板計數(shù)瓊脂（PCA）23.5 g，溶于1000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 菌懸液制備

用接種環(huán)挑取保存于斜面的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)8.0 h，在4 ℃下6000 r/min離心15 min后，收集菌體，用0.01 mol/L 無菌PBS 緩沖液洗3 次，最后懸浮于0.01 mol/L 無菌PBS 緩沖液中，制成菌體懸液，使用分光光度計分別測量兩種菌體懸液的OD600，用0.01 mol/L 無菌PBS 緩沖液調整菌液濃度至1×108CFU/mL 左右備用。

1.2.3 低溫等離子體處理

分別取3.0 mL 菌懸液樣品置于無菌培養(yǎng)皿（直徑30 mm）中，置于包裝盒中間，充氣密封后進行低溫等離子體處理，處理后取樣測定菌落數(shù)量。

低溫等離子體處理實驗設計如下：

第一組處理時間分別為30、60、90、120、150 s，處理后靜置0 h；

第二組處理后靜置1 h，其它條件同第一組；

第三組處理后靜置2 h，其它條件同第一組；

第四組N2:O2分別為80:20、65:35、50:50、35:65、20:80，處理后靜置2 h；

第五組介質阻擋板分別為1、2、4、6、8、10 mm，處理后靜置2 h；

第六組處理電壓分別為45、55、65、75、85 kV，處理后靜置2 h。

1.2.4 微生物計數(shù)

參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》操作。取1 mL 樣品，進行10 倍系列梯度稀釋，取100 μL 于平板計數(shù)培養(yǎng)基上涂布涂勻，于36 ℃培養(yǎng)72 h 后進行計數(shù)，菌落數(shù)量采用CFU/mL 計數(shù)。

1.3 動力學模型擬合

1.3.1 Linear 模型

式中：

N——處理后樣品的菌落數(shù)，CFU/mL；

N0——處理前樣品的菌落數(shù)，CFU/mL；

t——處理時間，s；

D 為減少90%的活菌所需要的時間，s。

1.3.2 Weibull 模型

式中：

b——表示比例因子；

n——表示形狀因子。

1.3.3 Log-linear+Shoulder+Tail 模型

式中：

Nres——抗逆性更強的微生物亞群，CFU/mL；

Kmax——最大殺菌速率，1/s；

tl——肩部的時間長度，s。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗重復三次，以平均值±標準誤差匯報結果。采用SPSS Statistics 23 和Excel 2019 進行數(shù)據(jù)處理和方差分析（ANOVA），使用Origin 2018 對實驗數(shù)據(jù)進行模型擬合，通過比較均方根誤差（RMSE）、決定系數(shù)（R2）、準確度因素（Af）和偏移因素（Bf）四個參數(shù)來篩選模型。RMSE 和R2表示模型的擬合度，R2越接近1，RMSE 越小，說明模型的擬合度越高。Af表示實測值與預測值間的偏離度，Af越小模型擬合度越高；Bf表示實測值與預測值間的大小關系，Bf越接近1 模型擬合度越高。RMSE、Af和Bf計算公式如下：

式中：

α——預測值；

β——實測值；

n——實驗值個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同低溫等離子體處理條件對殺菌效果影響

2.1.1 處理后放置時間對殺菌效果影響

由圖1 和圖2 可知，S.aureus和P.aeruginosa菌落總數(shù)隨處理時間延長而逐漸降低，處理后放置時間對菌落總數(shù)影響明顯。處理后放置不同時間時，S.aureus和P.aeruginosa菌落數(shù)隨著放置時間的延長而降低。S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)分別從1.02×108CFU/mL 和 1.12×108CFU/mL減少至1.00×107CFU/mL 和1.12×106CFU/mL，殺菌率分別為90.00%和98.99%，當其他條件不變，處理后放置2 h 時，S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)分別從1.01×108CFU/mL 和 1.07×108CFU/mL 減少至9.86×106CFU/mL 和4.17×105CFU/mL，殺菌率分別為90.27%和99.61%。

圖1 低溫等離子體處理時間對S.aureus 的殺菌曲線Fig.1 Bactericidal curve of S.aureus treated by cold plasma treatment time

圖2 低溫等離子體處理時間對P.aeruginosa 的殺菌曲線Fig.2 Bactericidal curve of P.aeruginosa treated by cold plasma treatment time.

在樣品處理后放置0 h 的情況下，S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)量都隨著處理時間延長而減少，呈現(xiàn)明顯“肩部”，當處理時間超過60 s，菌落數(shù)量都快速下降。當樣品處理后放置時間延長至1 h 時，S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)量隨處理時間延長成直線下降趨勢，“肩部”消失。

當樣品處理后放置時間延長至2 h 時，S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)量快速減少，經(jīng)相同時間處理的S.aureus和P.aeruginosa，其菌落減少量超過處理后放置0 h 的組。但當處理時間大于30 s 后，S.aureus的菌落數(shù)量下降趨勢減緩，和處理后放置0 h的組差距減小。

延長處理時間，能夠增加低溫等離子體中活性成分含量以及它們與菌體作用時間，從而增加對菌體的損傷，增強殺菌效果。由于低溫等離子體中的活性成分半衰期不同[17]，與菌體作用會有一系列鏈式反應，因此，延長處理后的放置時間能夠適度增強殺菌效果。隨著處理后的放置時間延長，包裝內的活性成分與細菌細胞快速反應后濃度下降甚至消失，此時再繼續(xù)延長處理后的放置時間將難以繼續(xù)降低細菌的數(shù)量。不同菌株之間對低溫等離子體處理的敏感度不同，其原因可能和革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的細胞壁的差異有關[18]，革蘭氏陰性菌細胞壁較薄而疏松，革蘭氏陽性菌相比革蘭氏陰性菌有更厚的細胞壁、更致密的肽聚糖層和大量磷壁酸，使具有殺菌作用的活性成分很難穿透[19]，因此S.aureus比P.aeruginosa更難被低溫等離子體殺死。

2.1.2 氧氣濃度、處理電壓和介質厚度對殺菌效果的影響

如圖3 所示，隨著包裝內氧氣濃度增加，低溫等離子體處理后S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)量逐漸降低，當濃度超過65%時，兩種細菌的菌落數(shù)量降低緩慢。低溫等離子體對S.aureus和P.aeruginosa的殺菌率隨著氧氣濃度增加而逐漸增加。相同處理條件下，P.aeruginosa的殺菌率達到99.99%，而S.aureus的殺菌率低于90.00%。兩種細菌對低溫等離子體處理條件的敏感度有顯著差異，P.aeruginosa更容易被殺死。原子氧、單線態(tài)氧在等離子體殺菌中占有重要位置，而工作氣體中氧氣濃度對其含量造成顯著影響[17]，但相同功率下，當氧氣濃度達到一定值時，低溫等離子體能夠激發(fā)生成的含氧活性物質含量也是一定的，繼續(xù)提高氧氣濃度并不會生成更多的含氧活性物質，所以再提高氧氣濃度時殺菌效果提高不明顯[20]。

圖3 氧氣濃度對低溫等離子體殺菌效果的影響Fig.3 Effect of oxygen concentration on bactericidal efficacy of cold plasma

處理電壓對低溫等離子體殺菌作用影響如圖4 所示，隨著處理電壓升高，S.aureus和P.aeruginosa的菌落數(shù)量逐漸下降。當處理電壓升高至85 kV 時，P.aeruginosa被完全殺滅，而S.aureus的菌落數(shù)量減少了1.21 logCFU/mL。相似結果在其它菌株有報到，當電壓升高，激發(fā)形成等離子體的能量增加，NOx生成量增加，而NOx濃度的增加有利于HNOx(x=1，4)的生成，NOx及其與水的反應產(chǎn)物HNOx(x=1，4)具有重要的殺菌作用[21]，也有研究表明隨著電壓的提高，更多的高能電子可以直接與液體表面發(fā)生碰撞，從而使具有殺菌作用的活性物質直接作用到液體中，對細菌的損傷作用增強，導致更多菌體死亡[17]。在本實驗中，當電壓為85 kV 時可獲得最佳的處理效果，但同時會經(jīng)常出現(xiàn)電弧擊穿介質阻擋板的現(xiàn)象，這會導致電壓電流劇烈波動，同時嚴重消耗介質阻擋板的使用壽命，因此在擬合分析中采用75 kV 的數(shù)據(jù)進行分析。

圖4 處理電壓對低溫等離子體殺菌效果的影響Fig.4 Effect of treatment voltage on bactericidal efficacy of cold plasma

本研究采用DBD 系統(tǒng)，阻擋介質是此系統(tǒng)中的重要組成部分。如圖5 所示，阻擋介質厚度變化對低溫等離子體殺菌效果影響明顯。當阻擋介質的厚度逐漸增加，低溫等離子體對S.aureus和P.aeruginosa的殺菌效果逐漸減弱。當阻擋介質的厚度從1 mm 增加至10 mm，低溫等離子體處理后S.aureus和P.aeruginosa的殺菌率分別減少了57.87%和8.56%。隨著阻擋介質板厚度的增加，相同的電壓下，電流變小，等離子體激發(fā)生成殺菌活性物質含量變小，殺菌效果也相應變弱。

圖5 介質厚度對低溫等離子體殺菌效果的影響Fig.5 Effect of medium thickness on bactericidal efficacy of cold plasma

2.2 殺菌模型曲線擬合

采用Linear 模型、Weibull 模型和Log-linear+ Shoulder+Tail 模型針對低溫等離子體處理后放置0 h、1 h 和2 h 的殺菌效果分別進行動力學曲線擬合，S.aureus和P.aeruginosa的菌落擬合曲線分別見圖6 和圖7。

圖6 Linear、Weibull 和Log-linear+Shoulder+Tail 模型對S.aureus 的擬合曲線Fig.6 Fitting curve of S.aureus by Linear,Weibull and Log-linear+Shoulder+Tail models

圖7 Linear、Weibull 和Log-linear+Shoulder+Tail 模型對P.aeruginosa 的擬合曲線Fig.7 Fitting curve of P.aeruginosa by Linear,Weibull and Log-linear+Shoulder+Tail models

圖6 和圖7 所示，處理后的放置時間從0 h 增加到2 h，S.aureus和P.aeruginosa的殺菌曲線逐漸從向上凸（有明顯“肩部”）變?yōu)橄蛳峦?，這是處理后放置過程中包裝內的低溫等離子體與細菌菌體充分反應導致的。而隨著處理時間延長，包裝盒內低溫等離子體含量增多，殺菌效果增強，處理后放置與否對殺菌效果的影響減小。因此，隨著處理時間延長，當處理時間超過 150 s 時，Weibull 模型擬合曲線和Log-linear+Shoulder+Tail 模型擬合曲線的形狀將逐漸趨于一致。

2.3 擬合模型評價

三種動力學模型對S.aureus和P.aeruginosa殺菌的擬合參數(shù)見表1 和表2，S.aureus和P.aeruginosa經(jīng)處理后放置0 h、1 h、2 h 的擬合參數(shù)R2、RMSE、Af和Bf如表3 和表4 所示。

表1 三種動力學模型對S.aureus 的擬合參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of three fitting models for inactivation of S.aureus by cold plasma

表2 三種動力學模型對P.aeruginosa 的擬合參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of three fitting models for inactivation of P.aeruginosa by cold plasma

如表3 所示，S.aureus經(jīng)處理后放置1 h，進行Linear、Weibull 和Log-linear+1Shoulder+Tail 模型擬合的R2值分別為0.989、0.991 和0.991；處理后放置0 h、2 h 時，三種模型的R2值分別為0.926、0.975、0.995和0.612、0.999、0.997。由此可見，在處理時間為0 s到150 s 的區(qū)間內，處理后放置時間為0 h 和2 h 時，Weibull和Log-linear+Shoulder+Tail模型都可以較好的描述低溫等離子體滅菌曲線，而當處理后放置時間為1 h 時三種模型的R2、RMSE、Af和Bf的值非常接近，所以三種模型都可以較好地描述這一過程。對于0 h和2 h 的情況，在放置0 h 時Log-linear+Shoulder+Tail模型略優(yōu)于Weibull 模型,而放置2 h 時則相反。由表3可知，Weibull 模型與Log-linear+Shoulder+Tail 模型的擬合參數(shù)R2、RMSE、Af和Bf整體上較為接近。但是在放置0 h 時Log-linear+Shoulder+Tail 模型相對于Weibull 模型的RMSE 和Af更小，說明Log-linear+ Shoulder+Tail 模型預測的平均精確度更高，離散程度更低，同時R2更接近于1。P.aeruginosa的相關數(shù)據(jù)如表4 所示，其情況與上述對S.aureus的分析相似。因此，在放置0 h 時Log-linear+Shoulder+Tail 模型可以更好的描述低溫等離子體對S.aureus和P.aeruginosa的滅菌動力學過程。而放置2 h 時則情況相反，Weibull 模型的擬合效果更好。

表3 三種模型對S.aureus 的殺菌曲線擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of three fitting models for inactivation of S.aureus by cold plasma

表4 三種模型對P.aeruginosa 的殺菌曲線擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters of three fitting models for inactivation of P.aeruginosaby cold plasma

為了比較Linear、Weibull 和Log-linear+Shoulder +Tail 模型擬合方程的預測值和實測值之間的差異，以實測值和預測值分別為橫坐標和縱坐標作相關性圖。

當曲線斜率和相關性系數(shù)越接近1，方程截距越趨于0，表明實測值和預測值的一致性越好。如圖8所示，S.aureus處理后放置0 h 時，Weibull 模型的預測值與實測值線性回歸方程為：y=0.9634x+0.2737（R2=0.975），Log-linear+Shoulder+Tail 模型的預測值與實測值線性回歸方程：y=0.9945 x+0.0413（R2=0.994）。Log-linear+Shoulder+Tail 模型的回歸方程斜率和相關系數(shù)都超過0.990，截距為0.0413，表明此模型比Weibull 模型更符合實際殺菌過程。處理后放置1 h時，Linear、Weibull和Log-linear+Shoulder+Tail模型預測值與實測值線性回歸方程分別為：y=0.9717x+0.2073（R2=0.989），y=0.9924x+0.0576（R2=0.991），y=0.9966x+0.0246（R2=0.991），三種模型的回歸方程曲線斜率、相關性系數(shù)和方程截距都很接近，其中Log-linear+Shoulder+Tail 模型在數(shù)值上略優(yōu)。處理后放置2 h 時，Weibull 模型的預測值與實測值線性回歸方程：y=1.0001x-0.0012（R2=0.999），Log-linear+Shoulder+Tail 模型預測值與實測值線性回 歸方程：y=1.0005x-0.0038（R2=0.997），Weibull 模型預測值和實測值的回歸方程斜率為1.0001，相關系數(shù)R2為0.999，均比Log-linear+Shoulder+Tail 模型更趨于1，截距為-0.0012，也更趨于0，這表明處理后放置2 h 時，Weibull 模型比Log-linear+Shoulder+Tail 模型更符合實際殺菌過程。

圖8 S.aureus 在處理后放置不同時間時Linear、Weibull 和Log-linear+Shoulder+Tail 模型的預測值和實測值相關性Fig.8 The correlation between predicted and measured values of Linear,Weibull and Log-linear+Shoulder+Tail models when S.aureusis placed at 0 h,1 h and 2 h after treatment

如圖9 所示，P.aeruginosa的模型擬合情況與S.aureus相似。綜上所述，對S.aureus和P.aeruginosa來說，在處理后放置0 h 和1 h 時Log-linear+Shoulder +Tail 模型最適合描述殺菌過程，在處理后放置2 h 時Weibull 模型最適合描述殺菌過程。

圖9 P.aeruginosa 在處理后放置不同時間時Linear、Weibull和Log-linear+Shoulder+Tail 模型的預測值和實測值相關性Fig.9 The correlation between predicted and measured values of Linear,Weibull and Log-linear+Shoulder+Tail models when P.aeruginosa is placed at 0 h,1 h and 2 h after treatment

3 結論

3.1 在O2:N2=65:35、75 kV、2 mm 阻擋介質的情況下，使用低溫等離子體處理30、60、90、120、150 s時，無論處理后放置0 h、1 h 還是2 h 均可顯著降低初始濃度為1.00×108CFU/mL 左右的S.aureus和P.aeruginosa的殘存菌落數(shù)量（p＜0.05）。處理時間越長，殺菌效果越好。在處理150 s，處理后放置0 h 的情況下，對S.aureus和P.aeruginosa的殺菌率分別為90.00%和98.99%，當其他條件不變，處理后放置2 h時，對S.aureus和P.aeruginosa的殺菌率分別提高至90.27%和99.61%。雖然阻擋介質厚度越小殺菌效果越好，但同時介質的老化速度也會越快，所以要根據(jù)實際需求選擇。

3.2 低溫等離子體對S.aureus和P.aeruginosa的殺菌效果受處理電壓、處理時間、阻擋介質厚度、處理后放置時間等多種因素影響明顯，提高處理電壓、延長處理時間和處理后放置時間能夠顯著（p＜0.05）增強殺菌效果。當處理條件為O2:N2=65:35、85 kV、150 s、2 mm 阻擋介質、處理后放置2 h 時，可獲得最佳的處理效果，可使?jié)舛葹?.16×108CFU/mL 的S.aureus減少 94.61%，并且能夠完全殺死濃度為 0.75×108CFU/mL 的P.aeruginosa。雖然當電壓為85 kV 時可獲得最佳的處理效果，但同時會經(jīng)常出現(xiàn)電弧擊穿介質阻擋板的現(xiàn)象，這會導致電壓電流劇烈波動，同時嚴重消耗介質阻擋板的使用壽命，因此本實驗采用75 kV 的數(shù)據(jù)進行擬合分析。

3.3 處理后放置時間從0 h 增加到2 h，殺菌擬合曲線逐漸從向上凸轉變?yōu)橄蛳峦?，肩部逐漸消失。延長處理時間，Weibull 模型的擬合曲線可能會變得更接近Log-linear+Shoulder+Tail 模型的擬合曲線，因此，具有Shoulder+Log-linear、Log-linear+Tail、Log-linear+ Shoulder+Tail 三種變形的Log-linear+Shoulder+Tail 模型，適用范圍更廣，更符合低溫等離子體殺菌過程菌的預測。