魚腥草多酚對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用

董晶，王帥珂，吳蘋，王碩，劉晉倩，冀蘆沙，陳芳*

（1.聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城 252000）（2.聊城市人民醫(yī)院，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究聯(lián)合實驗室，山東聊城 252000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），其發(fā)病特征以結(jié)腸粘膜下層潰瘍以及炎癥為主，是一種常見的炎癥性腸炎。近幾年，UC 的發(fā)病率在發(fā)展中國家逐年上漲[1]。UC 發(fā)病機(jī)制及病因與多種因素有關(guān)：病理學(xué)因素、遺傳因素、藥物因素以及生活方式的改變，如飲食習(xí)慣、吸煙、壓力和缺乏鍛煉等。研究發(fā)現(xiàn)UC 黏膜炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤為主要特征。報告顯示，UC 可能與肝腸病變相互關(guān)聯(lián)[2-3]。“腸-肝軸”的概念由Marshal 等人[4]于1998 年提出，肝臟和腸道通過門靜脈和膽管相互關(guān)聯(lián)[5]。當(dāng)長期接觸酒精或飲用大量葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液可導(dǎo)致腸道屏障受損，腸源性內(nèi)毒素經(jīng)過受損的腸粘膜移位至肝臟與內(nèi)毒素蛋白、分化簇14 結(jié)合，激活NF-kappaB 炎癥信號通路，產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF-α）和趨化因子等多種炎癥因子，最終造成肝損傷。肝臟損傷程度與腸道損傷程度呈正相關(guān)，這可能成為UC 發(fā)病機(jī)制過程中的重要環(huán)節(jié)[6-8]。

DSS 是一種化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型，其具體的誘導(dǎo)機(jī)制仍不明確，但通常認(rèn)為與腫瘤壞死因子、IL-6、干擾素等相關(guān)，是目前腸炎造模最常用的方式。研究發(fā)現(xiàn)，腸道促炎細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素（IL-1β）和抗炎因子IL-10 等與UC 的發(fā)生密切相關(guān)。腸道細(xì)胞炎癥因子的長期浸潤使結(jié)腸部位病變。因此，治療UC的關(guān)鍵是調(diào)節(jié)腸道炎癥因子、抑制腸道炎癥反應(yīng)[9]。

潰瘍性結(jié)腸炎可致患者生活痛苦不堪，嚴(yán)重可引起肝腎器官損傷等并發(fā)癥。近年來，我國西藥治療UC取得了一定的療效，但仍存在較多的不良反應(yīng)。中醫(yī)治療具有一定的優(yōu)勢，在我國中醫(yī)理論中UC 的臨床表現(xiàn)歸屬“泄瀉、久痢、腸風(fēng)、臟毒”的范疇。魚腥草（Houttuynia cordata，HC）富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，藥用食用價值較高，味辛，性微寒，具有清熱解毒、抗病毒等作用[10]。HC 種植成本低廉、幾乎無毒副作用、藥用價值高且廣泛。多酚是一類植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于自然界中，具有抗氧化[11]、抗菌消炎[12]、護(hù)肝和提高免疫力等功效[13]。諸多研究顯示，魚腥草中富含多酚類物質(zhì)，且具有較強(qiáng)的活性，可用于臨床和醫(yī)學(xué)研究[14-15]。提示魚腥草多酚具有潛在的治療UC的功效。本研究將探討魚腥草多酚對UC 小鼠的保護(hù)效果及可能的抗炎機(jī)制，以期為UC 臨床抗炎藥物的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

KM 小鼠，體重18～22 g，雄性。購自：濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)許可證號（SCXK魯20140007）。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

魚腥草提取物（產(chǎn)品規(guī)格為10:1），西安瑞林生物科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉鹽，Sigma-Aldrich；血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血尿素氮（BUN)、血肌酐（Cr），碧云天生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒，碧云天生物科技有限公司。高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司；電子恒溫水浴鍋，上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；MK酶聯(lián)免疫檢測儀，Thermo 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚腥草中總酚含量測定

本實驗采用優(yōu)化的三氯化鐵-鐵氰化鉀方法，測定HC 多酚含量，以沒食子酸為對照品，配制不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，于760 nm 處測定溶液吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量測定。以沒食子酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為y=0.1521x+0.0072，r=0.9989，結(jié)果表明沒食子酸在0.31～0.94 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取適量待測樣品置于10 mL 容量瓶中，加入0.3%的十二烷基硫酸鈉，加入鐵氰化鉀溶液與鐵氰化鉀混合溶液（1:1）1.5 mL，混勻，于暗處放置20 min，760 nm 處測定溶液吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算多酚含量[16]。

1.3.2 動物分組與造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為5 組，魚腥草多酚低、中、高劑量組，空白對照組、模型組（n=10）?？瞻捉M給予無菌水，模型組和魚腥草多酚組自由飲用0.4 mL 3.5%的DSS 溶液9 d（開始給予DSS 為實驗第4 d），造模后，魚腥草多酚組分別按照低、中、高劑量（40 mg/kg、60 mg/kg、100 mg/kg）進(jìn)行藥物灌胃處理，每日一次共10 d。每日稱重并觀察小鼠進(jìn)食變化，糞便情況（收集糞便）。給藥結(jié)束3 d 后，麻醉并解剖小鼠，通過摘取眼球從每只小鼠采集約1 mL 血液，分離血清于-20 ℃保存。沿腹腔中線打開腹腔，分離結(jié)腸和肝腎，測量、觀察、稱重于-80 ℃冰箱保存樣品備用。

1.3.3 疾病活動指數(shù)（Disease activity index，DAI）評分

DAI 評分包括：動物體重下降數(shù)值、動物糞便粘稠度、動物糞便隱血情況，可以比較直觀的反映動物建模是否成功。DAI 評分范圍為0～12 分[17]，評分按照嚴(yán)重程度劃分為：體重下降（0～4 分）；腹瀉情況（0～4分）；出血情況（0～4 分）。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查

解剖小鼠后，取結(jié)腸組織，使用10%的中性甲醛溶液固定24 h，乙醇梯度洗脫（70%、85%、95%、100%的酒精），石蠟鋪好后切成片（厚度為4 μm），二甲苯脫蠟，依紅染色，乙醇洗脫，二甲苯澄清，封片。光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 酶聯(lián)免疫法測定結(jié)腸中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β

取適量動物結(jié)腸標(biāo)本約80 mg，冰水浴中制備5%的組織勻漿液，采用Bradford 法測組織總蛋白濃度。按照酶聯(lián)免疫吸附制造商說明書測定炎癥因子濃度，450 nm 處測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 小鼠血清中AST、ALT、Cr 和BUN 水平測定

使用全自動生化分析儀檢測動物血清，按說明步驟操作，實驗設(shè)立對照組孔、模型組孔、多酚組孔，每組四個重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得AST、ALT、Cr、BUN。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析方法

數(shù)據(jù)來自至少3個獨立實驗，采用GraphPad Prism 5.0 程序進(jìn)行單因素方差比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）呈現(xiàn)。p＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 HC 多酚含量測定

多酚類物質(zhì)存在于多種植物中，具有抗炎、抗病毒、保護(hù)神經(jīng)等多種生物活性，多酚物質(zhì)作為魚腥草中的活性成分，其含量測定在魚腥草藥材的質(zhì)量控制中具有重要意義。文獻(xiàn)報道，魚腥草葉片中含豐富的多酚類物質(zhì)[18]，本實驗以魚腥草葉片純提取物為原料，采用分光光度法，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟反應(yīng)后，測得吸光值，將實驗結(jié)果換算為每克魚腥草純提取物中含有的多酚相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)（mg/g），測得HC 多酚平均含量為22.80 mg/g，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[19]。

2.2 HC 多酚對小鼠體重的影響

實驗中觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大部分小鼠第5 d 時開始同時出現(xiàn)稀便，第6～7 d 出現(xiàn)不同程度的便血。該實驗結(jié)果表明3.5%的DSS 可以成功誘導(dǎo)腸炎模型的建立，以體重減輕、腹瀉等為主要特征。如圖2 所示，給予DSS 溶液后第7 d，除空白組外，各組小鼠體重均呈下降趨勢：DSS 組下降了6.12%、低劑量組下降了6.01%、中劑量組下降了5.83%、高劑量組下降了6.24%。在造模第10 d，經(jīng)過不同劑量魚腥草多酚藥物干預(yù)后，實驗小鼠體重情況如下：DSS 組下降了12.03%、低劑量組增加了6.07%、中劑量組增加了10.02%、高劑量組增加重了13.04%（p＜0.01）。上述數(shù)據(jù)表明，魚腥草多酚可以改善小鼠結(jié)腸炎所導(dǎo)致的體重下降，且各劑量組間呈劑量依賴性。

圖2 HC 多酚對小鼠體重影響Fig.2 The effects of total polyphenol from Houttuynia cordata on body weight in mice with colitis (Mean±SD,n=10)

2.3 HC 多酚對小鼠DAI 評分和結(jié)腸外觀的影響

實驗記錄發(fā)現(xiàn)空白組小鼠，動作靈活，毛發(fā)順滑，糞便正常，精神狀況正常；模型組小鼠可見動作反應(yīng)遲緩，飲水和進(jìn)食量銳減，且大多呈蜷縮狀，大便不成形，肛周粘有稀便。模型組小鼠腸壁明顯增厚，潰瘍面有深褐色壞死物附著，腸管段狹窄嚴(yán)重粘連，充血水腫較明顯，腸壁變薄且不易分離（圖3b)。各治療組小鼠腸管有不同程度的點狀或節(jié)段性黏膜充血，嚴(yán)重程度較模型組減輕。模型組小鼠在給予DSS 溶液飲水第3～4 d，DAI 評分顯著升高；經(jīng)過魚腥草多酚干預(yù)第10～12 d，DAI 評分較空白組分別降低了26.83%、41.46%、54.46%（p＜0.01)；多酚劑量組結(jié)腸分別平均增加了2 cm、3.17 cm、4.52 cm，且腸肌層比較完整。結(jié)果表明，魚腥草多酚可以降低DAI 評分，改善DSS 所致的腹瀉和便血情況。

圖3 HC 多酚對小鼠DAI 評分和結(jié)腸外觀的影響Fig.3 The effects of total polyphenol from Houttuynia cordata on DAI score and colonic appearance in mice with colitis(Mean±SD,n=10)

2.4 HC 多酚對小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

組織病理學(xué)染色結(jié)果直接表明DSS 成功誘導(dǎo)了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎（圖4）。模型組小鼠腸粘膜組織結(jié)構(gòu)受損，粘膜內(nèi)外壁厚薄不均，結(jié)腸腺體變形粘膜，內(nèi)層嚴(yán)重潰瘍及糜爛面形成；相反，空白組小鼠腸粘膜完整，上皮細(xì)胞致密且排列有序，內(nèi)層無潰瘍面。多酚低劑量組切片上存在著少量的潰瘍面且黏膜外壁不完整，相比模型組有一定程度的減輕；多酚中劑量組組織結(jié)構(gòu)較完整，仍存在輕微潰瘍面；多酚高劑量組結(jié)腸切片上潰瘍面不明顯，幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤，可趨近于正常組的狀態(tài)。HC 活性成分顯著減弱了結(jié)腸病理變化，可以減輕DSS 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤。

圖4 小鼠結(jié)腸組織H&E 染色Fig.4 Colon histopathology analysis

2.5 HC 多酚對UC 小鼠結(jié)腸長度/重量的影響

如表1 所示，模型組小鼠結(jié)腸平均長度為6.35 cm，空白組長度為11.63 cm，DSS 灌胃處理后結(jié)小鼠結(jié)腸縮減至6.35 cm，較空白對照組相比縮短了45.50%（p＜0.05）。通過灌胃給予魚腥草多酚藥物干預(yù)后，模型組小鼠結(jié)腸長度增加明顯[20]。經(jīng)多酚各劑量組干預(yù)后的小鼠結(jié)腸平均長度為8.35 cm、9.52 cm、10.87 cm，分別增加了23.02%、33.33%、41.60%。結(jié)腸重量方面，DSS 組小鼠結(jié)腸重量較照組增加了49.40%（p＜0.05），藥物治療中、高劑量組平均重量為241.93 mg、232.65 mg，分別減少了25.60%、28.40%。低劑量組平均重250.35 mg，僅能減少22.80%。治療組間相比，多酚高劑量組治療效果優(yōu)于其余兩組。模型組的結(jié)腸重量長度比顯著增加至 51.01 cm（p＜0.05），結(jié)果顯示，HC 多酚可以改善DSS 引起的結(jié)腸縮短和腸重增加，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 HC 多酚對UC 小鼠的結(jié)腸長度、重量的影響Table 1 Effects of polyphenol from Houttuynia cordata on colon length and colon weight in UC mice (Mean±SD,n=10)

2.6 HC 多酚對UC 小鼠肝腎指數(shù)影響

分別計算小鼠肝指數(shù)（肝重/體重×100%）、腎指數(shù)（腎重/體重×100%），如表2 所示，不同劑量藥物治療組肝臟均重為1.46 g、1.36 g、1.32 g，肝指數(shù)分別為4.31%、4.18%、4.10%，變化不明顯；模型組小鼠肝腎平均重量：1.51 g、0.55 g與空白組比較，分別增加了17.92%、19.63%。模型組與空白組小鼠重量比較明顯加重，說明通過DSS 造模不僅使小鼠腸道受損還造成一定肝臟損傷。提示飲用DSS 會損傷腸粘膜，腸內(nèi)容物通過門靜脈進(jìn)入肝臟，進(jìn)而使肝指數(shù)增加。

表2 HC 多酚對UC 小鼠的肝腎指數(shù)的影響Table 2 Effects of polyphenol from Houttuynia cordata on liver and kidney index in UC mice (Mean±SD,n=10)

2.7 HC 多酚對小鼠炎癥因子的影響

IL-lβ是一種促炎性細(xì)胞因子，可激活多種炎癥細(xì)胞[21]。TNF-α是機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞凋亡，參與UC 炎性反應(yīng)的發(fā)生[22]。如表3 所示，DSS 顯著增加了炎癥因子濃度，與空白組比較差異極顯著（p＜0.01），DSS 模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α含量較正常組增加了6 倍、IL-1β增加了7 倍、IL-6 增加了10 倍、IFN-γ增加了6倍（p＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，小鼠HC 多酚低、中、高各劑量組TNF-α水平分別降低了10.92%、48.24%、56.27%；IL-1β水平降低了59.14%、62.57%、70.1%；IL-6 水平降低了67.55%、49.25%、56.13%；IFN-γ水平降低了44.90%、74.05%、76.50%，與Lee 等[23]的研究結(jié)果一致，魚腥草提取物抑制了TNF-α、促炎因子白細(xì)胞介素的生成。

表3 小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 濃度Table 3 Comparison of concentrations of TNF-α,IL-1β,IL-6,and IFN-γ in serum (Mean±SD,n=10)

表4 模型組動物血清中血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)水平分別為156 U/L、56 U/L，與空白組比較明顯升高了20.51%、42.86%（p＜0.05）；觀察給藥組中、高劑量小鼠AST、ALT 水平，明顯低于DSS 模型組（p＜0.05）且優(yōu)于低劑量組；而模型組小鼠的血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）水平為10.48 U/L、68.27 U/L，較空白組分別增加了26.62%、40.72%。多酚高劑量組Cr、BUN、AST、ALT 水平顯著低于模型組（p＜0.05）。以上結(jié)果表明，HC 提取物多酚不僅可以抑制UC 小鼠腸道炎癥因子的生成，且對DSS 誘導(dǎo)的肝腎指標(biāo)的上升具有一定調(diào)節(jié)作用。

表4 小鼠血清中AST、ALT、CR 和BUN 水平Table 4 Comparison of concentrations of AST,ALT,CR and BUN in serum (Mean±SD,n=10)

3 討論

大量研究表明多酚具有抗炎作用：藍(lán)莓果實多酚提取物能夠抑制LPS（脂多糖）誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少NO 的分泌，下調(diào)炎癥因子[24]；黑覆盆子的根部和果實多酚通過降低NO 的分泌、細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、IL-10）和前列腺素，證明多酚具有抗炎活性[25]。本研究從實驗誘導(dǎo)期開始，除空白組外，其余各組小鼠體重開始下降，灌胃給予腸炎小鼠40 mg/kg、60 mg/kg、100 mg/kg 的多酚后，比較第10 d 時發(fā)現(xiàn)，多酚各劑量組動物體重呈上升趨勢，多酚干預(yù)可以顯著抑制DSS 引起的腸炎小鼠體重下降。每3 d 使用EP 管搜集一次糞便，觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠實驗過程重糞便狀態(tài)始終正常，干燥且成型不粘著；除空白對照組外，小鼠糞便從實驗誘導(dǎo)期開始，變化較為明顯，顏色開始變深，松散不成型，出現(xiàn)稀便，進(jìn)入誘導(dǎo)期第6～7 d，模型組部分小鼠開始出現(xiàn)嚴(yán)重的便血現(xiàn)象。直至多酚干預(yù)后第10 d 開始得到緩解，第11 d 后，糞便顏色開始變淺，稀便、便血現(xiàn)象減少。多酚高劑量組動物糞便趨于正常狀態(tài)。解剖小鼠后，通過測量結(jié)腸長度，觀察結(jié)腸狀態(tài)，如圖2 所示，與DSS 組比較，多酚高劑量組的結(jié)腸長度最長，中劑量組次之，低劑量組最短；解剖時發(fā)現(xiàn)HC 多酚高劑量組結(jié)腸腫脹程度較少，低劑量組略有粘連，說明高劑量組對于DSS 誘導(dǎo)的UC 結(jié)腸外觀的改善作用優(yōu)于低劑量組。圖1 和圖2 表明多酚藥物干預(yù)UC 小鼠，可以顯著降低DAI 指數(shù)包括DSS 誘導(dǎo)引起的動物體重下降、便血、結(jié)腸縮短現(xiàn)象。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of galic acid

病理學(xué)切片觀察顯示，模型組小鼠腸道杯狀細(xì)胞被破壞以及大量炎癥細(xì)胞浸潤，HC 多酚改善了結(jié)腸組織病變，其中高劑量組明顯抑制了結(jié)腸組織腫脹和潰瘍嚴(yán)重程度，圖3 切片顯示，UC 小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞增加，腸粘膜完整，高劑量組療效最佳，其次為中劑量組，呈劑量依賴性。說明HC 多酚可通過修復(fù)腸黏膜，減少炎癥細(xì)胞浸潤，從而改善潰瘍性結(jié)腸炎。

研究表明，TNF-α，IL-6 和IL-1β等炎癥因子的異常升高是腸道黏膜的炎性損傷和UC 發(fā)生的原因之一[26]。本實驗中DSS 組小鼠血清中炎癥因子IL-lβ、TNF-a及AST、ALT 表達(dá)水平均高于空白組小鼠。Gabele 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，DSS 誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥可以促進(jìn)腸道內(nèi)毒素移位至肝臟、導(dǎo)致肝臟損傷，與本實驗研究結(jié)果相似。小鼠在經(jīng)過DSS 刺激后，激發(fā)機(jī)體內(nèi)天然免疫途徑，通過受損的腸道黏膜移位至肝臟，通過NF-kappaB炎癥信號通路產(chǎn)生大量的肝臟和腸道炎癥因子。如表3 所示，經(jīng)多酚各劑量組藥物干預(yù)后，UC 小鼠腸道炎癥因子顯著下降（p＜0.05），說明在降低小鼠血清TNF-α，IL-6 等炎癥因子方面具有一定療效；ALT、AST 是存在與肝臟內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶，該指標(biāo)異常升高可顯示肝臟炎癥或病變，表4 顯示，多酚各劑量組數(shù)值較模型組下降，肝臟炎癥較少；多酚高劑量組腎臟指標(biāo)Cr 和BUN 數(shù)值顯著降低（p＜0.05），而低劑量組療效不明顯。HC 多酚可以改善DSS 引起的肝腎炎癥指標(biāo)和肝腎指數(shù)的增加。

4 結(jié)論

綜上所述，魚腥草多酚提取物可以降低DAI 系數(shù)、肝腎炎癥指數(shù)，抑制腸道炎癥因子的升高，改善DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎，且對肝腎沒有毒性。因此，HC 多酚防治DSS 誘導(dǎo)的UC 的作用機(jī)制可能通過作用于NF-κB 通路，減弱炎癥因子表達(dá)量的上調(diào)，促進(jìn)UC 小鼠腸粘膜修復(fù)，從而抑制腸道炎癥反應(yīng)。其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究與證實。因此，魚腥草多酚具有潛在的藥用價值，可作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的中草藥進(jìn)行開發(fā)利用。