手撕兔肉抑菌劑的篩選與復(fù)配

袁 洋

(廈門工商旅游學(xué)校，福建 廈門 360001)

1 材料與儀器設(shè)備

1.1 抑菌劑

茶多酚：食用級，鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；殼聚糖：食用級，鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；nisin：食用級，連云港友進(jìn)食品添加劑技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 受試菌種

以四種即食包裝制品中分離和鑒定出的各類腐敗菌各一株為受試菌種。

手撕兔肉抑菌試驗用受試菌種為產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、植物乳桿菌(L.xylosus)、熱殺索絲菌(B.thermosphacta)。

1.3 培養(yǎng)基

Pseudomonades培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、STAA瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 儀器設(shè)備

Allegra X22型臺式高速離心機(jī)：北京泰亞賽?？萍及l(fā)展有限責(zé)任公司；BS224S型電子精密天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DHG-9148A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HSX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；HVE50型高壓滅菌器：北京泰亞賽?？萍及l(fā)展有限責(zé)任公司；HH8型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；SW CJ1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BCD-203型電冰箱：海信(北京)電器有限公司；KDN-08A型半微量定氮儀：山東鄄城華魯儀器公司；打孔器(7 mm直徑)：上海禾汽玻璃儀器有限公司。

2 方法

2.1 抑菌劑濃度的設(shè)定

按三種抑菌劑允許的最大使用濃度(茶多酚0.03 g/100 mL、殼聚糖0.6 g/100 mL、nisin 0.05 g/100 mL)配制溶液設(shè)為實驗組，并以不加抑菌劑作為空白對照。

2.2 抑菌試驗

(1)菌懸液的預(yù)制備。取受試菌種接種于相應(yīng)斜面上，在37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h，用5 mL無菌水洗下菌苔，制成菌懸液，細(xì)菌濃度約為109CFU/mL。

(2)培養(yǎng)基打孔、菌懸液抑菌劑的加入。在無菌平板內(nèi)倒入冷卻至50 ℃的各類培養(yǎng)基約20 mL，待其凝固。用1 mL無菌吸管取200 μL的菌懸液于相應(yīng)的滅菌平皿中，在培養(yǎng)基平板上將菌懸液涂均勻，放置1 h。用外徑6 mm的無菌金屬打孔器在培養(yǎng)基上等距離打孔3～4個，并挖出孔內(nèi)培養(yǎng)基，然后于每孔內(nèi)滴加少量0.5%瓊脂封底，再分別加入各類抑菌劑100 μL。

3.貧困人口獲得健康能力低下，直接降低了健康扶貧政策的實際績效。單純疾病治療缺乏可持續(xù)效果，貧困者自身不能在扶貧中發(fā)揮有效作用，這也是目前健康扶貧的突出問題。阿瑪?shù)賮啞ど浞謴?qiáng)調(diào)了個人可行能力的重要性，“僅僅關(guān)注人們?nèi)绾螌崿F(xiàn)功能性活動是不夠的，關(guān)注一個人是否有能力去實現(xiàn)功能性活動也是同等重要的”。［12］世界衛(wèi)生組織《阿拉木圖宣言》也提出了初級衛(wèi)生保健九個部分內(nèi)容，健康教育，食品供給及適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)，安全飲用水，基本衛(wèi)生設(shè)施，婦幼保健，免疫接種、地方性疾病預(yù)防，普通疾病和受傷的治療，基本藥物供給等，這些政策體現(xiàn)了以提升貧困者健康可行能力為基礎(chǔ)的整體性政策建構(gòu)。

(3)最小抑菌濃度的確定。將上述培養(yǎng)基平板置于37 ℃溫箱中，培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑大小，直徑大于7 mm可判為抑菌有效。將有效抑菌劑之最低濃度確定為最小抑菌濃度。

2.3 抑菌劑的復(fù)配優(yōu)化

2.3.1 手撕兔肉復(fù)合抑菌劑的添加

復(fù)合抑菌劑均在食品熟制并冷卻后加入，真空包裝，備檢。每袋手撕兔肉樣品的重量約35 g，置于35 ℃溫箱中保藏，21 d后測定樣品的揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量。

2.3.2 揮發(fā)性鹽基氮的測定

參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，采用半微量凱氏定氮法對TVB-N值進(jìn)行測定。

2.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。通過回歸方程的構(gòu)建，擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，尋求最優(yōu)的變量組合。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌劑對手撕兔肉抑菌效果的單因素實驗

對三種天然抑菌劑的抑菌效果進(jìn)行單因素實驗，結(jié)果見表1。

表1 三種天然抑菌劑對手撕兔肉菌株的抑菌效果

當(dāng)茶多酚濃度為0.006%時，對各菌株無抑菌效果；濃度為0.012%時，抑菌效果不明顯；濃度為0.018%時，熒光假單胞菌抑菌圈直徑為7.1 mm，即茶多酚對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度為0.018%；濃度為0.024%時，對產(chǎn)氣腸桿菌有抑菌效果，抑菌圈直徑為7.2 mm；茶多酚對植物乳桿菌、熱殺索絲菌、木糖葡萄球菌無抑菌作用。

當(dāng)殼聚糖濃度為0.12%時，抑菌效果不明顯；濃度為0.24%時，抑菌效果明顯，熒光假單胞菌抑菌圈直徑為7 mm，植物乳桿菌抑菌圈直徑為7.1 mm；濃度為0.36%時，對木糖葡萄球菌抑菌效果明顯，抑菌圈直徑為7.3 mm；殼聚糖對熱殺索絲菌和產(chǎn)氣腸桿菌無抑菌作用。

當(dāng)nisin濃度為0.01%～0.02%時，對各種腐敗菌均無明顯抑制效果；濃度為0.03%時，抑菌效果明顯，木糖葡萄球菌抑菌圈直徑為7.2 mm，熱殺索絲菌抑菌圈直徑為7.4 mm；濃度為0.04%時，植物乳桿菌抑菌圈直徑為7.2 mm；nisin對熒光假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌無抑菌作用。

3.2 手撕兔肉抑菌劑的復(fù)配優(yōu)化

采用Box-Behnken試驗設(shè)計，對茶多酚、殼聚糖和nisin三個因素進(jìn)行優(yōu)化組合，響應(yīng)值為TVB-N值，各因素及水平見表2，試驗結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面因素水平

表3 Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果

使用軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，TVB-N實測值=9.57-1.20*A-0.31*B-1.40*C-1.85*A*B+0.000*A*C-0.14*B*C+1.38*A2+0.51*B2+0.70*C2。

通過方差分析進(jìn)一步驗證回歸模型及各參數(shù)的顯著性，結(jié)果見表4。

由表4可知，該響應(yīng)模型的P=0.0008，說明模型的擬合度較好；失擬項P=0.1473，差異不顯著，說明該回歸模型不失擬。經(jīng)軟件分析，該模型的決定系數(shù)R2為0.9527，表明模型的擬合度很好；校正決定系數(shù)為0.8920，表明有10.8%的變異不能用該模型解釋；變異系數(shù)C.V.%=5.73%，信噪比(Adeq Precision)=12.977，表明該試驗誤差小。

表4 TVB-N方差分析的二次響應(yīng)模型

利用軟件繪制三種復(fù)合天然抑菌劑對手撕兔肉TVB-N值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖(見圖1、圖2、圖3)，對因素之間的交互作用進(jìn)行分析。

圖1 茶多酚和殼聚糖對手撕兔肉TVB-N值影響的響應(yīng)面和等高線

圖2 茶多酚和nisin對手撕兔肉TVB-N值影響的響應(yīng)面和等高線

圖3 殼聚糖和nisin對手撕兔肉TVB-N值影響的響應(yīng)面和等高線

使用響應(yīng)面軟件對模型方程求導(dǎo)，得出曲面極值點(TVB-N最小值)為7.2488 mg/100 g，對應(yīng)的茶多酚濃度為0.03%、殼聚糖濃度為0.48%、nisin濃度為0.05%。