EPO-CS/GP/GA水凝膠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化的研究

趙 亮，林曉鷺，陳宏柏，盧奕達(dá) (.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周病科，福建 廈門(mén) 36000；.吉林省醫(yī)學(xué)會(huì)秘書(shū)處，吉林 長(zhǎng)春 3004)

由炎性反應(yīng)、外傷和某些先天性疾病引發(fā)的牙槽骨缺損，是牙槽骨重建相關(guān)手術(shù)治療重點(diǎn)解決的難題之一。因此，探索新的治療方法以完成牙槽骨的再生修復(fù)，對(duì)恢復(fù)口腔功能具有重要的臨床意義。水凝膠常用于負(fù)載生物活性因子，在藥物釋放系統(tǒng)、骨組織工程支架材料體系中被廣泛應(yīng)用[1]。殼聚糖(CS)水凝膠具有良好的生物相容性和可降解性，是藥物荷載體系中最具應(yīng)用前景的材料之一[2]。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin , EPO)是一種細(xì)胞活性因子，主要功能是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的生成。EPO在造血系統(tǒng)中的作用已經(jīng)得到廣泛驗(yàn)證，目前人重組促紅細(xì)胞生成素在臨床上廣泛用于治療腎臟移植和貧血患者。除其在紅細(xì)胞生成中的經(jīng)典作用外，糖蛋白促紅細(xì)胞生成素(EPO)已被證明在多種非造血組織[3]中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和再生作用。最近有研究表明EPO能夠刺激骨折修復(fù)[4]。因此，本研究主要探討負(fù)載EPO的殼聚糖水凝膠在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1主要材料和試劑:明膠(Sigma)；胎牛血清(FBS，Gibco)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma)；β-甘油磷酸鈉(Merck)；噻唑藍(lán)(MTT)；氯化十六烷基吡啶(Sigma)； SYBR?Premix Ex TaqTM (Takara)；RNA 提取試劑盒(北京德邁德公司)；促人紅細(xì)胞生成素(EPO，三生藥業(yè)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；Primer Script?RT reagent Kit(Takara)。

1.2CS/GP/GA凝膠的合成及凝固時(shí)間測(cè)定：取一定體積的CS溶液，放置于20 ml無(wú)菌容器中，磁力攪拌，同時(shí)向CS溶液中逐滴滴加明膠(GA)溶液及β-甘油磷酸鈉(GP)溶液，使用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，待各組溶液均勻混合后，將容器靜止放置于37℃環(huán)境中，每間隔15 s將容器取出觀察，容器水平傾斜45°，觀察混合溶液液面是否隨容器傾斜而流動(dòng)，當(dāng)液面不再隨容器傾斜而流動(dòng)，則在37℃水浴中繼續(xù)放置30 s后將容器取出并完全倒置，若容器內(nèi)凝膠形狀15 s內(nèi)不發(fā)生明顯的變化，則該溶液視為已完全固化，記錄該反應(yīng)條件下凝膠溶液固化的時(shí)間，即凝膠形成時(shí)間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.3檢測(cè)EPO-CS/GP/GA的藥物釋放速率：取2 g EPO-CS/GP/GA 水凝膠，置于10 ml PBS中，37℃水浴中孵育，分別于不同時(shí)間點(diǎn)(培育2 h、4 h、8 h、24 h、2 d、4 d、10 d和15 d時(shí))吸取上清液，利用Elisa方法檢測(cè)上清液中EPO的含量，計(jì)算藥物釋放速率。

1.4EPO-CS/GP/GA水凝膠對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖及成骨分化作用的影響：取EPO-CS/GP/GA 水凝膠置于定量PBS中，37℃水浴中孵育，分別于2 h、4 h、8 h、24 h、2 d、4 d、10 d和15 d時(shí)吸取緩釋液，將緩釋液與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)，并誘導(dǎo)成骨向分化，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)觀察EPO-CS/GP/GA 水凝膠浸提液對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響。利用Real time-PCR檢測(cè)各組成骨基因的表達(dá)情況，結(jié)合EPO-CS/GP/GA 水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響，總結(jié) EPO 作用下成骨細(xì)胞相關(guān)基因的變化規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1pH值對(duì)水凝膠固化時(shí)間的影響:在室溫條件下，將三種材料的溶液均勻混合，殼聚糖：甘油磷酸鈉：明膠按照10∶1∶0.5的比例混合， pH值調(diào)節(jié)至4.0～7.0，當(dāng)pH值小于6時(shí)，在300 s內(nèi)沒(méi)有觀察到凝膠形成，反應(yīng)體系依然具有很強(qiáng)的流動(dòng)性；當(dāng)pH值為6.5和7.0時(shí)，凝膠時(shí)間分別為為(135±15)s和(110±15)s。

2.2EPO的緩釋速率:Elisa檢測(cè)結(jié)果表明，載EPO水凝膠藥物緩釋率在2 h為39.13%，4 d后EPO緩釋率約為80.22%，2周內(nèi)累計(jì)釋放率保持在95%左右。見(jiàn)圖1 。

圖1 Elisa法檢測(cè)EPO釋放率的結(jié)果

2.3載EPO殼聚糖溫敏水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖及分化作用的影響:通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)考察不同時(shí)間點(diǎn)吸取的EPO-CS/GP/GA緩釋液(保持EPO濃度不變)對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖效果的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)2 d后，1 d、2 d、4 d、10 d和15 d的EPO-CS/GP/GA緩釋液均對(duì)BMSCs的增殖具有促進(jìn)作用，細(xì)胞增殖率均達(dá)到120 %以上，與未經(jīng)處理的EPO作用組無(wú)明顯差別。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)15 d的緩釋后，凝膠中的EPO依然保持完整的生物學(xué)活性，具有促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖的功能。見(jiàn)圖2。

圖2 不同緩釋時(shí)間的凝膠浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖作用的影響

Real time-PCR結(jié)果顯示，EPO-CS/GP/GA組成骨基因的表達(dá)與空白對(duì)照組相比，在第3天時(shí)，RUNX2和COL I的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，SP7的表達(dá)也高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7天時(shí)，EPO-CS/GP/GA組成骨基因RUNX2、COLI和SP7的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，ALP的表達(dá)與對(duì)照組表達(dá)也有提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14天時(shí)，EPO-CS/GP/GA組成骨基因RUNX2、COLI、ALP和SP7的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

①為P<0.05，②為P<0.01圖3 水凝膠緩釋液對(duì)BMSCs細(xì)胞成骨基因表達(dá)的影響

3 討論

溫敏水凝膠可作為注射劑型應(yīng)用，在液體狀態(tài)時(shí)，通過(guò)注射可以將材料遞送至不規(guī)則形狀的組織缺損內(nèi)[5]；在溫度達(dá)到成膠條件時(shí)凝結(jié)成固體，在體內(nèi)達(dá)到良好的填充缺損的功能，負(fù)載的藥物可在局部穩(wěn)定緩慢釋放，達(dá)到減少給藥次數(shù)并繼續(xù)發(fā)揮作用的目的[6]。

殼聚糖通常通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與其他天然或合成生物材料結(jié)合，形成各種多功能水凝膠[7]，通過(guò)細(xì)胞和材料的相互作用，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖和功能分化的目的[8]，離子交聯(lián)法是制備殼聚糖基水凝膠的典型方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，離子交聯(lián)法所制備的水凝膠具有更優(yōu)良的生物相容性。有研究證明殼聚糖可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦物沉積，所以使用殼聚糖作為支架材料成了骨組織修復(fù)一個(gè)新的選擇。由于殼聚糖是陽(yáng)離子聚合物，可以通過(guò)經(jīng)典相互作用與其他的粘多糖(GAGs)和蛋白多糖結(jié)合，而GAGs可以調(diào)節(jié)成骨相關(guān)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)。因此，基于CS的可注射水凝膠的開(kāi)發(fā)將有助于骨再生的有效治療，特別是對(duì)骨組織不規(guī)則缺陷部位的治療。

事實(shí)上骨移植物不能直接成為受體的功能組織器官，而是與受體的組織交錯(cuò)融合并逐漸被新沉積的骨質(zhì)所代替，水凝膠的實(shí)質(zhì)是一個(gè)親水性多聚物所構(gòu)成的三維網(wǎng)絡(luò)，而這種高含水量的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)非常相似。促紅細(xì)胞生成素的主要功能是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成，其在造血系統(tǒng)中的作用得到充分驗(yàn)證，目前人重組促紅細(xì)胞生成素已經(jīng)商品化廣泛應(yīng)用于臨床治療腎臟移植和貧血患者[9]。除其在紅細(xì)胞生成中的經(jīng)典作用外，促紅細(xì)胞生成素已被證明在多種非造血組織[10]中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和再生作用，在骨修復(fù)方面，最近有研究表明EPO能夠刺激骨折修復(fù)[11]。EPO可以通過(guò)介導(dǎo)Jak/Stat信號(hào)通路達(dá)到促進(jìn)骨形成蛋白分泌的目的，直接促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，繼而促進(jìn)骨組織再生修復(fù)[12]。Eph受體和Ephrin配體的雙向信號(hào)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的偶聯(lián)關(guān)系，炎性反應(yīng)微環(huán)境中，這些蛋白在細(xì)胞反應(yīng)和組織重建中發(fā)揮重要作用[13]。

EPO在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用歸因于EPO介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和血管生成的刺激作用，與此同時(shí)，在骨折骨痂周細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)的一氧化氮合成酶也被證明在骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]，目前研究表明這主要與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮型和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)增加有關(guān)[15-16]。

綜上所述，筆者推斷緩釋EPO可以通過(guò)刺激細(xì)胞增殖、VEGF介導(dǎo)的血管生成、eNOS和iNOS的表達(dá)以及活化Jak/Stat信號(hào)通路提高BMP水平，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，所有這些都將成為臨床應(yīng)用EPO治療骨吸收破壞性疾病的潛在可能。