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    LncRNA TUG1靶向miR-222-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響

    2022-01-05 01:13:38李小麗張慶軍
    國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2021年24期
    關(guān)鍵詞:檢測

    李小麗,王 輝,張慶軍

    應(yīng)急總醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京 100028

    肺炎在全球發(fā)病率非常高,患者康復(fù)時間長且病死率高[1]。肺炎鏈球菌是一種機(jī)會性病原體,定植在人類上呼吸道的黏膜表面,通過局部擴(kuò)散、吸入或播種等方式到達(dá)血液中,引起肺炎等疾病[2-4]。因此,了解肺炎鏈球菌感染過程涉及的分子途徑對于預(yù)防和治療肺炎至關(guān)重要。越來越多的研究顯示,長鏈非編碼RNA(LncRNA)是多種人類疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物[5-6]。LncRNA?;撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過抑制微小RNA(miRNA)-127,保護(hù)脂多糖(LPS)誘發(fā)的MRC-5細(xì)胞損傷,在肺炎中顯示出較好的治療效果[6]。TUG1通過海綿miR-590-5p/FGF1促進(jìn)哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,并減少了細(xì)胞凋亡[7]。miR-222-3p在肺炎支原體肺炎患兒中高表達(dá),可能是診斷肺炎支原體肺炎和判斷患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[8]。但TUG1對肺炎鏈球菌感染的人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC細(xì)胞)凋亡的影響,以及miR-222-3p是否介導(dǎo)其作用過程,目前尚未明確。因此,本研究以肺炎鏈球菌感染HPAEpiC細(xì)胞構(gòu)建肺損傷模型,并評估TUG1在該模型中的影響,除此之外,還探討了TUG1和miR-222-3p之間的調(diào)控關(guān)系,同時評估m(xù)iR-222-3p在TUG1影響細(xì)胞損傷中的作用,揭示TUG1的潛在作用機(jī)制,為治療肺炎提供新的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1儀器與試劑 72株HPAEpiC細(xì)胞(美國ScienCell),肺炎鏈球菌-3型(美國菌種保藏中心),Lipofectamine 2000、TUG1小干擾RNA(Si-TUG1)、陰性對照siRNA(Si-NC,美國Invitrogen),miR-222-3p、miR-NC、anti-miR-222-3p、anti-miR-NC(上海吉瑪),PrimeScript RT試劑盒、SYBR Green Premix Ex Taq(大連Takara),miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒(北京Tiangen),膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/PI試劑盒(上海Beyotime),牛血清蛋白、總蛋白提取試劑盒(上海Solarbio),硝酸纖維素膜(美國Millipore),PGL3報告基因載體、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega)。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與肺炎鏈球菌感染 HPAEpiC細(xì)胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/F12中于37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境下培養(yǎng)。肺炎鏈球菌在含脫纖維羊血(5%)的血平板中培養(yǎng)。感染時,采用1×108CFU/mL肺炎鏈球菌(提前12 h在含0.5%酵母的托休二氏溶液中培養(yǎng))感染HPAEpiC細(xì)胞48 h[9]。

    1.2.2細(xì)胞分組與處理 HPAEpiC細(xì)胞分為對照(NC)組、肺炎鏈球菌組、肺炎鏈球菌+Si-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1組、肺炎鏈球菌+miR-NC組、肺炎鏈球菌+miR-222-3p組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組。NC組HPAEpiC細(xì)胞未做任何處理;肺炎鏈球菌組HPAEpiC細(xì)胞以1×108CFU/mL肺炎鏈球菌感染;肺炎鏈球菌+Si-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1組、肺炎鏈球菌+miR-NC組、肺炎鏈球菌+miR-222-3p組的HPAEpiC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Si-NC、Si-TUG1、miR-NC、miR-222-3p,肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組共轉(zhuǎn)染Si-TUG1+anti-miR-NC、Si-TUG1+anti-miR-222-3p,轉(zhuǎn)染后24 h,以1×108CFU/mL肺炎鏈球菌感染。HPAEpiC細(xì)胞轉(zhuǎn)染時,按照制造商的操作規(guī)程,將HPAEpiC細(xì)胞在六孔板上預(yù)孵育至40%~60%匯合,然后與寡核苷酸或siRNA及Lipofectamine 2000一起孵育進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

    1.2.3實時定量PCR檢測TUG1、miR-222-3p表達(dá) 根據(jù)制造商的規(guī)程,通過TRIzol試劑從HPAEpiC細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行cDNA合成。使用SYBR Green Premix Ex Taq和miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒在ABI 7500系統(tǒng)上進(jìn)行實時定量PCR檢測。GAPDH和U6充當(dāng)內(nèi)源性對照。引物序列為TUG1正向5′-GGACACAATTCGCCACGACTT-3′,反向5′-GCGCAGTCCCAGATTCCA-3′;GAPDH正向5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-222-3p正向5′-AGCTACATCTGGCTACTGG-3′,反向5′-GTATCCAGTGCAGGGTCC-3′;U6正向5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′,反向5′-TGGTGTCGT GGAGTCG-3′。

    1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 借助Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測HPAEpiC細(xì)胞凋亡(1×105個細(xì)胞/孔)。將500 μL結(jié)合緩沖液與HPAEpiC細(xì)胞懸液混合。然后,添加5 μL Annexin V-FITC并保持5 min,隨后添加5 μL PI并在黑暗中于室溫下反應(yīng)10 min。使用Beckman Coulter流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

    1.2.5Western blotting檢測蛋白表達(dá) 使用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白,并使用二辛可寧酸方法對HPAEpiC細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量。制備分離凝膠(10%)和濃縮凝膠(5%),每個孔中加入20 μL蛋白樣品,進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)束,在3 mA下2 h完成硝酸纖維素膜的轉(zhuǎn)移。室溫下用5%牛血清清蛋白封閉膜2 h。將一抗Bcl2相關(guān)X蛋白(Bax蛋白,1∶3 000稀釋)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(Bcl2蛋白,1∶3 000稀釋)與膜在4 ℃條件下孵育過夜,然后,將其與HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000稀釋)在室溫下混合2 h,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光保持30 min后,再采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行蛋白水平分析。

    1.2.6雙熒光素酶報告實驗 含有miR-222-3p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)-TUG1/突變型(MUT)-TUG1序列被擴(kuò)增并克隆到PGL3報告基因載體中。將HPAEpiC細(xì)胞接種到六孔板中后培養(yǎng)過夜,并與WT-TUG1/MUT-TUG1報告基因質(zhì)粒和miR-222-3p/miR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h,螢火蟲和海腎熒光素酶活性使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測量。針對海腎熒光素酶基因的活性對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

    2 結(jié) 果

    2.1肺炎鏈球菌感染對HPAEpiC細(xì)胞中miR-222-3p和TUG1表達(dá)的影響 肺炎鏈球菌感染前后,肺炎鏈球菌組HPAEpiC細(xì)胞中TUG1表達(dá)量為(0.43±0.03),約為NC組(1.03±0.02)的0.42倍,肺炎鏈球菌組miR-222-3p表達(dá)量為(2.30±0.09),約為NC組(1.01±0.03)的2.28倍,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.790,P<0.001;t=13.860,P<0.001)。

    2.2轉(zhuǎn)染TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響 肺炎鏈球菌組和肺炎鏈球菌+Si-NC組HPAEpiC細(xì)胞的TUG1表達(dá)量均低于NC組,凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量均高于NC組,Bcl2蛋白表達(dá)量低于NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肺炎鏈球菌+Si-TUG1組HPAEpiC細(xì)胞的TUG1表達(dá)量低于肺炎鏈球菌+Si-NC組,凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量均高于肺炎鏈球菌+Si-NC組,Bcl2蛋白表達(dá)量低于肺炎鏈球菌+Si-NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

    表1 轉(zhuǎn)染TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響

    注:A為蛋白質(zhì)電泳圖;B、C、D、E均為流式凋亡圖。

    2.3TUG1靶向調(diào)控miR-222-3p的表達(dá) miR-222-3p與TUG1含有靶向結(jié)合的核苷酸序列,生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果見圖2。miR-222-3p與WT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(0.46±0.03)是miR-NC與WT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(1.00±0.01)的0.46倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.960,P<0.001);而miR-222-3p、MUT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(1.00±0.02)與miR-NC、MUT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(1.02±0.03)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.429,P=0.674)。

    圖2 miR-222-3p含有與TUG1靶向結(jié)合的位點(diǎn)

    2.4過表達(dá)miR-222-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響 肺炎鏈球菌+miR-222-3p組HPAEpiC細(xì)胞的miR-222-3p表達(dá)量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量比肺炎鏈球菌+miR-NC組高,且Bcl2蛋白表達(dá)量比肺炎鏈球菌+miR-NC組低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

    表2 肺炎鏈球菌+miR-NC組和肺炎鏈球菌+miR-222-3p組的miR-222-3p、凋亡率、凋亡蛋白比較

    2.5干擾miR-222-3p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響 與肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組比較,肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組HPAEpiC細(xì)胞中miR-222-3p表達(dá)量、凋亡率和Bax蛋白表達(dá)量降低,Bcl2蛋白表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

    注:A為蛋白質(zhì)電泳圖;B、C均為流式凋亡圖。

    注:A為蛋白質(zhì)電泳圖;B、C均為流式凋亡圖。

    表3 肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組與肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組的miR-222-3p、凋亡率、凋亡蛋白比較

    3 討 論

    本研究探討了TUG1對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細(xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌觸發(fā)了HPAEpiC細(xì)胞凋亡。此外,干擾TUG1加速了肺炎鏈球菌誘發(fā)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡。另外,干擾miR-222-3p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響。

    TUG1已被廣泛應(yīng)用于各種癌癥研究中,包括腎細(xì)胞癌[10]、前列腺癌[11]、胃癌[12]、結(jié)腸癌[13]。越來越多的證據(jù)證實TUG1在多種癌癥病理、生理過程中均發(fā)揮了特定的生物學(xué)功能。例如,一項研究表明,過表達(dá)的TUG1通過減弱細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)來保護(hù)小鼠免受寒冷誘導(dǎo)的肝損傷[14]。此外,研究表明,在LPS引起的MRC-5細(xì)胞損傷中,TUG1減輕了細(xì)胞凋亡,下調(diào)Bax蛋白表達(dá)而上調(diào)Bcl2蛋白表達(dá),機(jī)制與調(diào)控miR-127有關(guān)[6]。在哮喘大鼠模型中,沉默TUG1可增加哮喘中氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡,而TUG1過表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[7]。然而,目前研究尚未揭示TUG1是否能保護(hù)HPAEpiC細(xì)胞免受肺炎鏈球菌觸發(fā)的細(xì)胞損傷。本研究觀察到,TUG1在肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細(xì)胞中低表達(dá),干擾TUG1能明顯促進(jìn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡。同時,干擾TUG1可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax蛋白的表達(dá)并抑制抗凋亡蛋白Bcl2蛋白的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)均提示,TUG1對HPAEpiC細(xì)胞中肺炎鏈球菌觸發(fā)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

    miRNA通過控制參與組織發(fā)育和再生的多個信號和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),已成為病理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15]。根據(jù)報道,在胃癌[16]、腎細(xì)胞癌[17]、非小細(xì)胞肺癌[18]和宮頸癌[19]患者中,miR-222-3p表達(dá)增加。然而,在卵巢癌[20]及嚴(yán)重心肌纖維化患者中觀察到較低的miR-222-3p水平[21]??梢娫诓煌膊』颊咧?,miR-222-3p表達(dá)不同。研究顯示,與正常椎間盤組織比較,椎間盤退變組織中的miR-222-3p明顯增加;miR-222-3p過表達(dá)明顯增加了髓核細(xì)胞的凋亡并減少其增殖,miR-222-3p的下調(diào)可抑制髓核細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)增殖;miR-222-3p會加速椎間盤退變的發(fā)展[22]。本研究發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌感染使HPAEpiC細(xì)胞miR-222-3p表達(dá)上調(diào),與以往研究報道一致[8]。更重要的是,miR-222-3p過表達(dá)可以增加肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡,同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax蛋白,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2蛋白。上述數(shù)據(jù)與以往的研究部分相似[22],提示miR-222-3p可能加重肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細(xì)胞損傷。

    本研究的生物信息學(xué)預(yù)測表明,TUG1序列中存在假定的miR-222-3p結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果揭示了miR-222-3p為TUG1的靶標(biāo),TUG1可以靶向調(diào)控miR-222-3p的表達(dá)。但miR-222-3p是否影響TUG1對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細(xì)胞損傷的保護(hù)活性仍然未知。本研究進(jìn)一步觀察到,干擾miR-222-3p表達(dá)后,干擾TUG1促進(jìn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的作用被部分逆轉(zhuǎn)。表明TUG1通過靶向調(diào)控肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細(xì)胞中miR-222-3p的表達(dá),減輕細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,TUG1通過靶向miR-222-3p對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細(xì)胞起保護(hù)活性。這些發(fā)現(xiàn)可能為肺炎鏈球菌感染的肺炎提供一種新的治療方法。

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