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    趨化因子CXCL5和程序性死亡配體1在結(jié)腸直腸癌組織的表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系

    2022-01-05 04:15:46劉詩光趙敬坤陸愛國毛志海
    外科理論與實(shí)踐 2021年6期
    關(guān)鍵詞:趨化因子組織化學(xué)結(jié)腸

    劉詩光, 趙敬坤, 陸愛國, 毛志海

    (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科 上海市微創(chuàng)外科臨床醫(yī)學(xué)中心,上海 200025)

    結(jié)腸直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,也是引起病人死亡的主要癌癥之一。在世界范圍內(nèi),結(jié)腸直腸癌的發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌[1]。在我國,隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的變化,結(jié)腸直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢,嚴(yán)重威脅我國人民的健康[2]。一直以來,結(jié)腸直腸癌的治療采取以手術(shù)治療為主,結(jié)合放、化療的模式。近年來,以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為主的免疫治療受到廣泛關(guān)注,有望成為針對結(jié)腸直腸癌的一種新型治療方式。免疫治療通過再次激發(fā)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng),抑制腫瘤免疫逃逸,從而激活腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[3]。趨化因子是腫瘤微環(huán)境中重要的成分之一,是溝通免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵因子[4]。然而,趨化因子與免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物在結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后中的預(yù)測價(jià)值尚未充分闡述。

    CXCL5(C-X-C motif ligand 5)又稱上皮中性粒細(xì)胞激活肽78,屬于ELR+CXC趨化因子家族的一員[5]。近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CXCL5在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,CXCL5的高表達(dá)與NSCLC的血管生成相關(guān)[6]。Begley等[7]發(fā)現(xiàn)CXCL5在前列腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)升高。此外,CXCL5可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

    程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)是B7家族成員之一,又稱 B7-H1、CD274。其與受體PD-1結(jié)合,通過影響DC抗原提呈,或限制T淋巴細(xì)胞的活化和擴(kuò)散,從而在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[8]。本研究主要探討趨化因子CXCL5與PD-L1在聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后中的價(jià)值。

    研究對象與方法

    一、研究對象

    入組78例不同病理分期的結(jié)腸直腸癌病人。收集自2010年至2011年我院外科行腹腔鏡切除病人的腫瘤組織及癌旁正常組織,經(jīng)活檢和術(shù)后病理檢查、明確診斷。不納入急診手術(shù)病人。所有病人術(shù)前未接受任何放、化療及生物治療。組織芯片委托上海芯超生物芯片定制。取自結(jié)腸直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁正常組織,距離腫瘤>5 cm,后者作為對照。腫瘤的分期依照美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Commission on Cancer,AJCC)的pTNM分期。標(biāo)本的采集通過我院倫理委員會審批。

    二、免疫組織化學(xué)染色

    免疫組織化學(xué)染色一抗抗體:CXCL5(Mouse,R&D,USA);PD-L1(Rabbit,Abcam,UK)。 染色詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)[9]。組織芯片脫蠟至水后采用H2O2室溫停留10 min,磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline,PBS)沖洗 3 次,每次 3~5 min。 100 μL 正常非免疫動物血清封閉2 h,棄去封閉液后加入一抗,4℃冰箱過夜。PBS沖洗3次,每次3~5 min,加入二抗,室溫 20~30 min。PBS 沖洗 3 次,每次 3~5 min,加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的標(biāo)志物,室溫10 min。PBS沖洗3次,每次3~5 min。滴加DAB顯色,復(fù)染、脫水、封片。

    三、免疫組織化學(xué)評分

    免疫組織化學(xué)評分采用免疫危險(xiǎn)評分(immune risk score,IRS)標(biāo)準(zhǔn),由2名病理專業(yè)醫(yī)師在雙盲情況下,對每個點(diǎn)進(jìn)行染色評分。評分的內(nèi)容包括組織化學(xué)染色的強(qiáng)度和陽性染色細(xì)胞所占的百分比。IRS=染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度分為4級,陰性為未見陽性細(xì)胞,0級,弱陽性1級,中等陽性2級,強(qiáng)陽性3級。陽性細(xì)胞百分比分為5級,即 0 級(無染色)、1 級(染色細(xì)胞<10%)、2 級(10%~50%)、3 級(51%~80%)、4 級(>80%)。

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SAS 8.0、SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用 Pearson χ2檢驗(yàn)分析 CXCL5、PD-L1 與臨床特征之間的關(guān)系。用Kaplan-Meier方法繪制總體生存期曲線,并用對數(shù)秩和檢驗(yàn)檢出兩組間差異。用Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、CXCL5、PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織與正常組織中表達(dá)的比較

    CXCL5與PD-L1免疫組織化學(xué)染色評分最佳cut-off值運(yùn)用X-tile軟件 (版本3.6.1,Yale University School of Medicine,USA)依據(jù)病人的生存期計(jì)算得出。采用X-tile軟件計(jì)算,CXCL5的最佳cutoff值為4.5,PD-L1最佳cut-off值為0.4。 當(dāng) PD-L1為0.4時IRS分值≥4.5為高表達(dá),IRS分值<4.5為低表達(dá)(見圖1)。

    圖1 基于結(jié)腸直腸癌病人生存數(shù)據(jù)的X-tile分析顯示CXCL5和PD-L1免疫組織化學(xué)染色評分的cut-off值

    CXCL5主要表達(dá)于結(jié)腸直腸癌組織的細(xì)胞質(zhì),其中48例(61.5%)高表達(dá),30例低表達(dá)。與癌旁正常組織相比,其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見表1、圖2 A~B)。PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織中表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜及浸潤性淋巴細(xì)胞,其中37例(47.4%)高表達(dá),41例低表達(dá)。在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá),其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見表 1、圖 2 C~D)。

    圖2 免疫組織化學(xué)染色顯示CXCL5與PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá)

    二、結(jié)腸直腸癌組織中CXCL5、PD-L1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

    結(jié)腸直腸癌組織中CXCL5的表達(dá),在不同腫瘤直徑、TNM分期間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),不同性別、年齡、組織學(xué)分型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。同樣,PD-L1的表達(dá),在不同腫瘤直徑、TNM分期間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而不同性別、年齡、組織學(xué)分型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

    表1 結(jié)腸直腸癌組織中CXCL5、PD-L1表達(dá)與病人臨床特征的關(guān)系

    三、CXCL5、PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá)與病人預(yù)后的相關(guān)性分析

    本研究結(jié)腸直腸癌病人5年總生存率為73.1%(57/78),中位生存時間為52(18~60)個月。Cox單因素回歸分析結(jié)果顯示,TNM分期、CXCL5高表達(dá)、PD-L1高表達(dá)是結(jié)腸直腸癌病人總生存率的 預(yù) 后 危 險(xiǎn) 因 素 (P=0.002、P=0.019、P=0.040)。CXCL5高表達(dá)從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度未能成為獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素(P=0.098),但其P值接近0.05。造成該現(xiàn)象的原因可能是樣本量有限。在將PD-L1納入模型的情況下,TNM分期和PD-L1高表達(dá)成為結(jié)腸直腸癌病人總生存的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素 (P=0.013、P=0.006)。多因素回歸分析顯示,在未將PD-L1納入模型的情況下,TNM分期是結(jié)腸直腸癌病人總生存的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素(P=0.011)。CXCL5高表達(dá)不是獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素(P=0.728)(見表2)。

    表2 結(jié)腸直腸癌病人單因素與多因素Cox回歸分析

    四、CXCL5、PD-L1高表達(dá)對結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后生存的影響

    CXCL5高表達(dá)組5年生存率64.6%(31/48),中位生存時間為50(18~60)個月。CXCL5低表達(dá)組5年生存率86.7%(26/30),顯著高于高表達(dá)組,中位生存時間為53(19~60)個月。運(yùn)用 Kaplan-Meier生存曲線法以及Log-Rank分析結(jié)果顯示CXCL5低表達(dá)組5年生存率顯著高于高表達(dá)組 (86.7%比64.6%,P<0.05)(見圖 3 A)。表明 CXCL5 表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人不良預(yù)后相關(guān)。

    PD-L1高表達(dá)組5年生存率54.1%(20/37),中位生存時間為50(18~60)個月。PD-L1低表達(dá)組5年生存率為90.2%(37/41),中位生存時間為53(32~60)個月。運(yùn)用 Kaplan-Meier生存曲線法及Log-Rank分析,結(jié)果顯示PD-L1低表達(dá)組5年生存率顯著高于高表達(dá)組(92.7%比54.1%,P<0.05)(見圖3B)。表明PD-L1表達(dá)預(yù)示結(jié)腸直腸癌病人不良預(yù)后。

    五、CXCL5及PD-L1聯(lián)合表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人生存期的關(guān)系

    依據(jù)CXCL5與PD-L1表達(dá)情況,將78例結(jié)腸直腸癌臨床標(biāo)本分為4組樣本[CXCL5高表達(dá)PDL1高表達(dá)組 (32例)、CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組(16例)、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組(5例)、CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組(25例)](見圖3C)。Kaplan-Meier生存曲線法及 Log-Rank分析結(jié)果顯示,CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較另外3組(CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組)5年生存率顯著降低(46.9%比100%、80%、87.5%,P<0.05)。CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組預(yù)后差(46.9%比100%,P<0.05)。CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組5年生存率與CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(80%比87.5%,P>0.05)。 同樣,CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組間的生存率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100%比80%,P>0.05)(見圖 3D)。

    討 論

    趨化因子是腫瘤外微環(huán)境與腫瘤溝通的橋梁。趨化因子的表達(dá)受多種因素影響。

    CXCL5在腫瘤的進(jìn)展、生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用[10-11]。CXCL5基因定位于人4號染色體q13-q21,包含4個外顯子和3個內(nèi)含子,其mRNA全長2 475 bp,開放閱讀框共342個核苷酸,編碼含114個氨基酸的肽鏈[12]。CXCL5與受體CXCR2特異結(jié)合后,可趨化中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的游走、脫顆粒等一系列生物學(xué)效應(yīng),在機(jī)體的抗感染、抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。CXCL5同時具有促血管生成、介導(dǎo)炎性反應(yīng)及參與結(jié)締組織重塑等重要生物學(xué)功能[13-14]。PD-L1的表達(dá)則有助于構(gòu)建免疫耐受微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[15]。PD-L1除在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表達(dá)外,也表達(dá)于多種類型的腫瘤細(xì)胞表面[16-18]。在結(jié)腸直腸腫瘤中,研究發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白的陽性表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后[19]。然而,也有學(xué)者認(rèn)為結(jié)腸直腸癌病人中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)與良好預(yù)后有關(guān)[20]。由此可見,PD-L1高表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系尚存爭議,有必要進(jìn)一步研究明確。目前在其他實(shí)體瘤中尚無CXCL5與PD-L1聯(lián)合預(yù)測腫瘤病人預(yù)后的研究,但已有研究證實(shí)CXCL5與PD-L1之間的關(guān)聯(lián)。如小鼠結(jié)腸癌模型中,腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可分泌CXCL5促進(jìn)腫瘤表面PD-L1的表達(dá)[21]。本研究探討CXCL5與PD-L1聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的意義,具有一定創(chuàng)新性。如上所述,采用免疫組織化學(xué)的方法在78例結(jié)腸直腸癌組織樣本中分別檢測CXCL5和PD-L1的表達(dá),并將結(jié)果與臨床隨訪資料進(jìn)行對比。筆者發(fā)現(xiàn)CXCL5在腫瘤組織中高表達(dá)。CXCL5的高表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期相關(guān),而與性別、年齡、組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性。同樣,PD-L1蛋白在結(jié)腸直腸癌組織中也呈現(xiàn)高表達(dá),在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)。且PD-L1高表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期相關(guān),而與性別、年齡、組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性。這與Droeser等[20]的研究結(jié)果大致相符。

    生存相關(guān)分析結(jié)果顯示,TNM分期、CXCL5高表達(dá)、PD-L1高表達(dá)是結(jié)腸直腸癌病人總生存的預(yù)后危險(xiǎn)因素。多因素回歸分析顯示,TNM分期和PD-L1高表達(dá)成為結(jié)腸直腸癌病人總生存的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。CXCL5高表達(dá)不是獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。表明PD-L1比CXCL5能更好地預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人的預(yù)后。這與國內(nèi)Wang等[22]報(bào)道一致,在膀胱癌病人中,PD-L1的表達(dá)水平是一個獨(dú)立可評估膀胱癌病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

    生存分析顯示CXCL5在腫瘤組織中的上調(diào)與結(jié)腸直腸癌病人較差的預(yù)后呈顯著正相關(guān)。與CXCL5低表達(dá)的結(jié)腸直腸癌病人相比,CXCL5高表達(dá)的結(jié)腸直腸癌病人有較差的總生存率。相反,Speetjens等[23]證明腫瘤組織中CXCL5低表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人的不良預(yù)后呈正相關(guān)。將這種現(xiàn)象歸因于T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤,這種相反結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是研究中Ⅰ和Ⅱ期病人比例較高(67.1%比61.5%),且無Ⅳ期病人。

    本研究對PD-L1表達(dá)情況與結(jié)腸直腸癌病人生存期所進(jìn)行的分析結(jié)果顯示,PD-L1低表達(dá)組5年生存率及平均生存時間明顯優(yōu)于高表達(dá)組。該結(jié)果與大多數(shù)研究所報(bào)道的結(jié)果一致[19]。Shi等[19]研究結(jié)果顯示,PD-L1高表達(dá)的結(jié)腸直腸癌病人腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)率、腫瘤相關(guān)死亡率顯著升高,總體生存率顯著下降,提示PD-L1的表達(dá)水平可預(yù)測腫瘤進(jìn)展及相關(guān)死亡。

    最后,筆者探討CXCL5與PD-L1聯(lián)合對結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的影響,并依據(jù)CXCL5與PD-L1表達(dá)的4組獨(dú)立樣本,發(fā)現(xiàn)CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組預(yù)后差,提示在CXCL5高表達(dá)時,PD-L1直接或間接影響CXCL5所影響的預(yù)后,PD-L1表達(dá)水平是影響預(yù)后的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外,CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較另外3組(CXCL5高表達(dá)PDL1低表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組)5年生存率顯著降低。表明CXCL5與PD-L1聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后具有更好的預(yù)測效果。

    目前,對于CXCL5與PD-L1在結(jié)腸直腸癌的表達(dá)情況已有相關(guān)研究,然而對于兩者相關(guān)性以及聯(lián)合影響結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的研究尚未成熟。本研究首次提出CXCL5與PD-L1的相互影響,以及兩者聯(lián)合可更精準(zhǔn)預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后。這有利于對亞群病人的篩選。此外,從治療角度,降低趨化因子表達(dá)水平,理論上可能對腫瘤病人預(yù)后有正向作用。除相關(guān)靶點(diǎn)藥物的研發(fā),護(hù)理因素在該過程中也可能起到重要作用。綜合護(hù)理措施主要從心理護(hù)理、疼痛護(hù)理、生命體征監(jiān)測以及并發(fā)癥護(hù)理等,根據(jù)病人的不同情況給予針對性護(hù)理[24],可加速創(chuàng)面的愈合,控制趨化因子,降低炎性反應(yīng),促進(jìn)康復(fù)。

    因此,深入探討趨化因子在結(jié)腸直腸癌預(yù)后中的作用,有助于醫(yī)護(hù)人員從多角度采取多種策略以期提高預(yù)后生存水平,符合結(jié)腸直腸癌多學(xué)科綜合治療的理念[25]。相關(guān)研究有待進(jìn)一步開展。

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