基于胃黏膜活檢對(duì)兒童幽門螺桿菌多重耐藥及毒力基因分型的關(guān)聯(lián)性分析

王教常 黃達(dá)棟 王榮 徐賢坐 林敏 林福旭 湯清清 孟飛 林李淼*

幽門螺桿菌（Hp）自1983年被發(fā)現(xiàn)后一直備受關(guān)注。眾多研究已證實(shí)其與胃炎，消化性胃潰瘍等一系列胃部疾病相關(guān)，甚至與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)［1］。目前，Hp全球感染率已超50%，兒童Hp感染狀況不容樂(lè)觀［2-4］。兒童作為一個(gè)特殊群體，在Hp感染患兒中，僅部分有發(fā)病癥狀，且根除Hp效果也不盡相同。究其原因，可能與Hp毒力和抗生素耐藥有關(guān)。作者收集胃黏膜活檢組織標(biāo)本，進(jìn)行Hp分離培養(yǎng)鑒定，并進(jìn)一步對(duì)其毒力基因分型及6種抗生素耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，分析兒童Hp毒力基因分型與耐藥情況的關(guān)聯(lián)性，為本地區(qū)兒童Hp臨床根除治療及預(yù)防提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 招募2019年1～12月本院因上消化道癥狀就診且行胃鏡檢查的患兒430例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有腹痛、腹脹等消化道癥狀者；（2）4周內(nèi)未使用抗生素、鉍劑、質(zhì)子泵抑制劑或H2受體拮抗劑者；（3）經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人知情同意，胃鏡下取胃黏膜活檢標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有嚴(yán)重的肝、腎疾??；（2）對(duì)本研究中6種抗生素過(guò)敏者；（3）有精神疾病等不能正確表達(dá)主訴及不能合作者。胃黏膜組織Hp分離培養(yǎng)陽(yáng)性患兒249例，其中男111例，女138例；年齡4～14歲，平均年齡（9.27±2.71）歲。

1.2 方法 （1）Hp分離培養(yǎng)：將胃黏膜組織充分研磨后，涂布于Hp專用培養(yǎng)基上，置于37℃微需氧環(huán)境（5% O2，10% CO2，85% N2）培養(yǎng) 3～5 d，挑選透明可疑菌落進(jìn)行初步鏡檢，經(jīng)尿素酶、氧化酶及過(guò)氧化氫酶反應(yīng)均為陽(yáng)性后，判定為Hp陽(yáng)性菌株。（2）Hp耐藥檢測(cè)：采用瓊脂稀釋法，將6種抗生素（克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、甲硝唑、呋喃唑酮、鹽酸四環(huán)素）分別加入Hp專用培養(yǎng)基中稀釋成臨界濃度，制備含不同抗生素的平板。將鑒定后的Hp陽(yáng)性菌株分別接種于含不同抗生素平板上，置于37 ℃微需氧環(huán)境（5%O2，10%CO2，85%N2）培養(yǎng)3 d。所選抗生素及其耐藥臨界點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)為：克拉霉素1 μg/mL、左氧氟沙星2 μg/mL、阿莫西林2 μg/mL、甲硝唑8 μg/mL、呋喃唑酮2 μg/mL、鹽酸四環(huán)素 2 μg/mL［5］。本研究質(zhì)控菌株為：Hp ACTC11637。（3）毒力基因分型檢測(cè)：通過(guò)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）對(duì)所獲得的Hp菌株進(jìn)行DNA提取。通過(guò)PCR擴(kuò)增，對(duì)毒力基因VacA-s和VacA-m進(jìn)行擴(kuò)增。具體反應(yīng)體系如下：：2×T5 Super PCR Mix 15 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1μL，模板DNA 2μL，5×Enhancer buffer 6μL，ddH2O 5μL。擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性3 min；98℃ 30 s，退火（退火溫度56℃）10 s，72 ℃延伸10 s，PCR循環(huán)30次；最后72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。PCR反應(yīng)引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 Hp毒力基因VacA引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp耐藥率 249例Hp陽(yáng)性患兒對(duì)6種抗生素的耐藥率分別為：克拉霉素60.24%、左氧氟沙星42.17%、甲硝唑78.31%、阿莫西林0%、呋喃唑酮0%、鹽酸四環(huán)素0%。其中，對(duì)兩種抗生素組合耐藥66例，占比26.51%；對(duì)三種抗生素組合耐藥81例，占比32.53%。見(jiàn)表2。

表2 兒童Hp對(duì)6種抗生素耐藥情況統(tǒng)計(jì)

2.2 Hp毒力基因分型結(jié)果 249例兒童Hp進(jìn)行了毒力基因VacA（s1/s2、m1/m2）的檢測(cè)。VacA基因的檢出率為100%，其中VacAs1、VacAs2、VacAm1及VacAm2的檢出率分別為98.80%、1.20%（3/249）、38.55%及61.45%。VacA基因嵌合體中，基因亞型VacAs1m1占37.35%，基因亞型VacAs1m2占比最高，為61.45%，VacAs2m1為1.2%，VacAs2m2為0%。見(jiàn)表3。

表3 Hp毒力基因各基因型分型及其組合的檢出率統(tǒng)計(jì)

2.3 Hp毒力基因分型和耐藥情況的關(guān)聯(lián)性 單一耐藥和雙重耐藥型在毒力基因亞型VacAs1m1和VacAs1m2之間都表現(xiàn)為無(wú)差異，但三重耐藥型在毒力基因亞型VacAs1m1和VacAs1m2之間差異明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表4。在毒力基因亞型VacAs1m2中，單一耐藥、雙重耐藥及三重耐藥型之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在毒力基因亞型VacAs1m1中，單一耐藥、雙重耐藥及三重耐藥型之間差異明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表4 不同耐藥型在毒力基因亞型VacAs1m1和VacAs1m2的關(guān)系

表5 毒力基因亞型在不同耐藥型之間的關(guān)系

3 討論

Hp是一種定植于人體胃黏膜上的革蘭氏陰性菌，可以導(dǎo)致兒童腸道疾病的發(fā)生［6］。兒童感染Hp后，其臨床根治效果主要受到Hp菌株耐藥和Hp毒力基因分型的影響。目前，臨床上常用于兒童感染Hp的藥物主要有克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑等，但是隨著抗生素在食品及藥品方面的濫用，Hp耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，影響兒童Hp的根除效果。本研究成功分離出249例患兒Hp陽(yáng)性菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克拉霉素、左氧氟沙星及甲硝唑的耐藥率分別為60.24%、42.17%及78.31%，尤其克拉霉素耐藥率普遍高于其他地區(qū)，如嘉興地區(qū)［7］（克拉霉素14.81%，甲硝唑51.85%），臺(tái)州地區(qū)［8］（克拉霉素20.94%，左氧氟沙星10.26%），蕭山地區(qū)［9］（克拉霉素16.74%，左氧氟沙星5.02%，甲硝唑71.55%）。究其原因，可能于當(dāng)?shù)乜股啬退幱嘘P(guān)。經(jīng)浙江省Hp監(jiān)測(cè)大數(shù)據(jù)［5］分析發(fā)現(xiàn)，溫州地區(qū)克拉霉素耐藥率明顯高于嘉興、臺(tái)州及杭州等浙江省內(nèi)地區(qū)。此外，本研究中雙重耐藥Hp菌株占比26.51%，三重耐藥Hp菌株占比達(dá)32.53%，可見(jiàn)本地區(qū)兒童Hp多重耐藥情況已十分嚴(yán)重，需引起足夠重視。

毒力基因VacA可通過(guò)編碼VacA蛋白釋放空泡毒素，引起細(xì)胞損傷及凋亡［10］。毒力基因VacA不同亞型中，VacAs1m1型可以產(chǎn)生大量毒素故而毒性最強(qiáng)具有高毒素活性，VacAs1m2型空泡毒性次于VacAs1m1型則具有次高毒素活性，VacAs2m2不能誘導(dǎo)空泡形成可視為無(wú)毒素活性［11-12］。本研究結(jié)果顯示，本地區(qū)兒童Hp感染VacA基因亞型以VacAs1m2為主（61.45%），其次為基因型 VacAs1m1（37.35%），VacAs2m1（1.20%），無(wú)毒素活性基因型VacAs2m2并未發(fā)現(xiàn)，與上海某三甲醫(yī)院Hp毒力研究得出的結(jié)論相一致（基因型VacAs1m1占39%，VacAs1m2占61%）［13］。不同國(guó)家、地區(qū)人群Hp菌株的VacA基因型各有不同，日本兒童［14］及中國(guó)東北地區(qū)［15］VacA基因亞型以VacAs1m1為主，美國(guó)VacAs1m1和VacAs2m2各占約50%。

目前，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展較多關(guān)于Hp毒力基因分型和耐藥情況的關(guān)聯(lián)性研究［16-18］。本研究結(jié)果顯示，單一耐藥和雙重耐藥型在毒力基因亞型VacAs1m1和VacAs1m2間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但三重耐藥型Hp在毒力基因亞型VacAs1m1和VacAs1m2間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明毒力基因亞型VacAs1m1（高毒素活性）的Hp菌株出現(xiàn)對(duì)抗生素多重耐藥的幾率較大。原因可能與VacA可使Hp持續(xù)定植于胃黏膜相關(guān)［19］，高毒素活性毒力基因致使Hp更易定植于胃黏膜從而加大Hp根除難度，加重多重耐藥的可能性。高毒素活性毒力基因亞型VacAs1m1中，單一耐藥、雙重耐藥及三重耐藥型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），三重耐藥比例明顯高于單一耐藥及雙重耐藥比例；而次高毒素活性基因亞型VacAs1m2中，三種耐藥型間無(wú)明顯差異。表明高毒素活性毒力基因型Hp菌株更容易產(chǎn)生多重耐藥的情況。

綜上所述，本研究地區(qū)兒童Hp毒力基因亞型以VacAs1m2為主，毒素活性相對(duì)較弱，然而Hp多重耐藥情況依然十分嚴(yán)重。本地區(qū)兒童Hp毒力基因VacA與耐藥型存在一定相關(guān)性，高毒素活性毒力基因型（VacAs1m1）Hp菌株更容易產(chǎn)生多重耐藥，為Hp根除提供新思路，對(duì)于本地區(qū)兒童抗生素用藥具有一定指導(dǎo)意義。