胰島移植緩解糖尿病大鼠腎臟纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

徐自強(qiáng) 金昊 王瑾珺

糖尿病腎病是引起終末期腎病的第一大疾病［1］。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，持續(xù)高血糖引起的代謝改變可影響糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。因此，維持穩(wěn)定理想的血糖是早期治療糖尿病腎病的關(guān)鍵［2］。近年來(lái)，隨著胰島分離純化技術(shù)的逐漸成熟和完善，胰島移植已成為治療糖尿病并發(fā)癥的重要方法之一。國(guó)內(nèi)多中心已常規(guī)開展胰島移植術(shù)來(lái)治療糖尿病患者。研究發(fā)現(xiàn)，胰島移植后可以明顯改善糖尿病患者腎臟疾病，尿微量白蛋白和血肌酐水平均明顯降低。然而，移植物排斥反應(yīng)仍是影響胰島細(xì)胞長(zhǎng)期存活的重要因素。海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉（APA）微囊是一種生物相容性較好的半透膜，可以阻止胰島細(xì)胞與受者免疫系統(tǒng)接觸，還能讓體積小的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自由進(jìn)入，具有免疫隔離作用［3］。本研究通過(guò)移植APA微囊化的胰島細(xì)胞至糖尿病大鼠腹腔內(nèi)，并觀察其對(duì)腎臟保護(hù)作用以及探討可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，16只8周健康雄性SD大鼠和12只8周健康雄性Wistar大鼠，體重約200～220 g。海藻酸鈉由上海精細(xì)化工科技有限公司提供；聚左賴氨酸、Ⅴ型膠原酶、鏈脲佐菌素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；雙硫腙（DTZ）為上海三愛思試劑有限公司產(chǎn)品；Ficoll-Paque PLUS溶液為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；RPMI 1640、D-Hank's液為吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；大鼠胰島素ELISA試劑盒購(gòu)自上海朗頓生物科技有限公司；兔源單克隆抗體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）和兔源單克隆抗體結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）購(gòu)自Bioworld公司。

1.2 胰島細(xì)胞分離和微囊化 異氟烷吸入麻醉成功后，Wistar大鼠腹部V形切口，破心處死。在左右肝管分叉處行膽總管插管；然后向胰管內(nèi)灌注8～10 mL（濃度0.8 mg/mL，pH 7.8）V型膠原酶溶液。待胰腺膨脹后，整塊獲取，立即放入相同濃度Ⅴ型膠原酶溶液離心管中；38℃恒溫水浴消化約15 min，等待大部分胰腺組織成乳糜狀后，加入35 mL 4℃ Hank's 液終止消化；棄上清液，再次加入25 mL 4℃ Hank's液振搖50 s，過(guò)800 μm不銹鋼篩網(wǎng)，將沉淀轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，加入RPMI 1640液至15 mL，離心洗滌5 min。在消化后的胰腺組織中加入5 mL Ficoll-Paque PLUS 溶液，充分混勻，加入Hank's 液5 mL，離心15 min，吸取Hank's液和Ficoll-Paque PLUS 液交界層液面的組織懸塊，即為純化的胰島，洗滌，采用RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)，準(zhǔn)備制備胰島微囊。FDA-PI染色計(jì)算胰島活性：將胰島細(xì)胞團(tuán)同PI、FDA各7 μL混勻，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色情況，估算存活的細(xì)胞在所有細(xì)胞中所占比例，并計(jì)數(shù)約50個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)的活性比例，最終計(jì)算出平均值作為胰島活性大小。胰島當(dāng)量（IEQ）計(jì)算：依據(jù)LEMBERT等［4］制定的方法，鏡下計(jì)數(shù)DTZ陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)，用標(biāo)尺測(cè)其直徑，用IEQ表?yè)Q算為直徑相當(dāng)于150 μm胰島的IEQ，然后根據(jù)以下公式算得總胰島當(dāng)量：總胰島當(dāng)量（IEO）=3次胰島總當(dāng)量÷3×20×樣本量（mL）。將4000當(dāng)量胰島與15 g/L海藻酸鈉溶液5 mL混合。采用高壓靜電成囊技術(shù)將上述混合液逐步滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中，從而形成海藻酸鈣微膠珠，再投入0.5%聚左賴氨酸溶液中反復(fù)振搖；然后用1.5 g/L海藻酸鈉溶液包裹；最后以55 mmol/L 檸檬酸鈉溶液液化囊心，生理鹽水洗滌，即得包裹胰島的APA微囊。

1.3 APA微囊化大鼠胰島及未包囊胰島糖刺激實(shí)驗(yàn) 將500當(dāng)量微囊化和未微囊化胰島置于12孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。去培養(yǎng)液后，胰島細(xì)胞首先在37 ℃低葡萄糖（2.22 mmol/L）培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h，取上清液于4℃保存；然后再更換37℃高葡萄糖（22.2 mmol/L）培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h，取上清液。用ELISA 試劑盒測(cè)定兩種濃度培養(yǎng)后上清液的胰島素濃度，按以下公式計(jì)算刺激指數(shù)（SI）：SI=高糖環(huán)境下胰島素的分泌濃度／低糖環(huán)境下胰島素的分泌濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和收集標(biāo)本 SD大鼠按50 mg/kg劑量給予鏈脲佐菌素（溶劑為0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.2），腹腔一次性注射。術(shù)后每日予以正常飲食。在72 h后連續(xù)3次測(cè)大鼠血糖均維持在＞16.6 mmol/L，認(rèn)為糖尿病大鼠建模成功。實(shí)驗(yàn)分三組。糖尿病腎病組（n=6）；微囊移植組（n=4），糖尿病建模后8周，腹腔內(nèi)移植1200當(dāng)量的APA微囊化胰島，術(shù)后非禁食下血糖持續(xù)≤16.6 mmol/L，可作為胰島功能存活判定標(biāo)準(zhǔn)；正常對(duì)照組（n=6）。實(shí)驗(yàn)分組后4周，收集各組24 h尿液，行24 h尿蛋白定量。麻醉后處死大鼠，收集腎臟和腎動(dòng)脈標(biāo)本，并且觀察微囊在腹腔中的狀態(tài)。在0°鹽水環(huán)境下收集雙腎。雙刀法組織修塊，快速分離出3～5小塊腎皮質(zhì)（大小約1×1×1 mm3），立即浸泡于2.5%戊二醛電鏡保存液中固定，置于4℃冰箱備電鏡檢測(cè)，剩余的腎組織和腎動(dòng)脈標(biāo)本放入預(yù)冷的4%多聚甲醛中，4～6 h固定，備檢免疫組化。

1.5 電鏡標(biāo)本制作與觀察 在冰鹽水環(huán)境下橫斷皮質(zhì)髓質(zhì)，迅速取大小約1×1×1 mm3腎皮質(zhì)組織塊于2.5%戊二醛前固定＞2 h，漂洗，1%鋨酸后固定1 h，漂洗3次，塊染（1%醋酸鈾2 h），梯度脫水，浸透（100%丙酮：包埋劑 1∶1，37℃烘箱2 h，丙酮：包埋液1∶4，37℃烘箱過(guò)夜；純包埋液45℃烘箱2 h），包埋聚合（環(huán)氧樹脂45℃烘箱3 h），半薄切片定位腎小球，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立H7500透射電鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學(xué) 石蠟切片（3μm）脫蠟水化，微波修復(fù)，采用SP法免疫組化試劑盒檢測(cè)腎臟組織CTGF和TGF-β1表達(dá)，采用相同方法檢測(cè)腎動(dòng)脈MCP-1表達(dá)。所有操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。陽(yáng)性結(jié)果為胞膜或胞漿內(nèi)棕黃色線狀或顆粒物顯色。采用單盲法，各組大鼠每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400）拍照，應(yīng)用Imagepro plus圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，測(cè)定陽(yáng)性部位的平均光密度（MD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖刺激胰島分泌實(shí)驗(yàn) 未微囊化胰島和微囊化胰島在低糖下的胰島分泌濃度分別為（0.25±0.03）ng/mL和（0.25±0.03）ng/mL，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高糖刺激下胰島素釋放量為（0.63±0.07）ng/mL和（0.60±0.06）ng/mL，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高糖刺激下胰島素釋放量為低糖刺激的＞2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組SI分別為（2.54±0.36）和（2.43±0.47），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè) 移植前，糖尿病腎病組和微囊移植組大鼠血糖均明顯升高（28.57±1.58 mmol/LVS.30.35±0.90 mmol/L，P＞0.05），兩組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；糖尿病腎病組和微囊移植組大鼠24小時(shí)尿蛋白均顯著高于正常組（P＜0.05），但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（51.26±4.69 mgVS.52.45±2.58 mg，P＞0.05）。手術(shù)術(shù)后，微囊移植組血糖逐步下降，至2周左右下降至最低，但仍高于正常。術(shù)后3周，微囊移植組血糖開始逐步升高。術(shù)后28 d，微囊移植組血糖和糖尿病腎病組血糖比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（20.35±1.40 mmol/LVS.31.62±1.51 mmol/L，P＜0.05）。24 h 尿蛋白定量微囊移植組比糖尿病腎病組明顯下降（25.58±4.68 mgVS.51.26±4.69 mg，P＜0.001）。微囊移植組與正常組24 h尿蛋白比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 直視及電鏡改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，打開移植組大鼠腹腔，觀察到APA微囊成簇聚集，表面可見纖維樣組織包裹，局部還可見新生血管，大部分黏附于大網(wǎng)膜、腸系膜及腹壁上（見圖1）。在電鏡下，糖尿病腎病組腎小球?yàn)V過(guò)膜上的足細(xì)胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為局部足突增寬、相互融合，且基底膜節(jié)段增厚；而微囊移植組腎小球足細(xì)胞足突排列整齊，基底膜結(jié)構(gòu)清晰，不規(guī)則增厚少見，形態(tài)接近于正常組腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)（見圖2）。

圖1 腹腔內(nèi)包含胰島素的APA微囊聚集成簇（黑色箭頭）

圖2 各組腎臟電鏡檢查

2.4 免疫組化結(jié)果 TGF-β1在腎內(nèi)主要表達(dá)部位為腎小球。糖尿病腎病組和微囊移植組TGF-β1表達(dá)較正常對(duì)照組升高。微囊移植組TGF-β1在腎小球的表達(dá)較糖尿病腎病組降低（0.12±0.02VS.0.26±0.04，P＜0.05）。CTGF主要表達(dá)部位為腎小管間質(zhì)，在正常組中幾乎不表達(dá)，但在其他兩組腎小管間質(zhì)中明顯表達(dá)。糖尿病腎病組CTGF在腎間質(zhì)中表達(dá)較微囊移植組明顯升高（0.35±0.04VS.0.14±0.03，P＜0.05）。MCP-1主要在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。在糖尿病組中，大鼠腎動(dòng)脈平滑肌層中MCP-1表達(dá)明顯升高，但其在微囊移植組中的表達(dá)明顯降低（0.34±0.05VS.0.25±0.04，P＜0.05）。見圖3～5。

圖3 各組TGF-β1免疫組化

圖4 各組CTGF免疫組化

圖5 各組腎動(dòng)脈MCP-1表達(dá)

3 討論

糖尿病腎病典型的病理表現(xiàn)與代謝相關(guān)的腎小球硬化癥［5］。持續(xù)的高血糖狀態(tài)引起的代謝改變是影響糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。因此，良好的血糖控制是糖尿病腎病治療的關(guān)鍵。胰島移植短期內(nèi)恢復(fù)受者血糖的效果非常理想［6］。此外，大量臨床研究發(fā)現(xiàn)胰島移植可以逆轉(zhuǎn)早期糖尿病腎病，恢復(fù)正常的腎小球?yàn)V過(guò)功能［7-8］。然而胰島移植遠(yuǎn)期效果并不理想，大部分患者常需要二次移植。主要原因包括移植物慢性排斥反應(yīng)，免疫藥物毒副作用和局部炎癥反應(yīng)［9-11］。因此，目前大部分研究者專注于通過(guò)改進(jìn)胰島純化技術(shù)，增加單次移植的胰島數(shù)量；改進(jìn)免疫抑制方案，減少藥物對(duì)胰島損害；或采用新的生物材料包裹胰島細(xì)胞，起到保護(hù)隔絕作用，從而延長(zhǎng)移植物的存活。

本實(shí)驗(yàn)中，采用APA微囊包裹胰島，腹腔移植改善糖尿病大鼠持續(xù)高血糖狀態(tài)。APA微囊是一種生物相容性良好的半透膜。其孔徑允許氧氣、糖等營(yíng)養(yǎng)成分自由進(jìn)出，同時(shí)可以阻止胰島細(xì)胞直接與受者的免疫細(xì)胞直接接觸［12］。因此，微囊化胰島細(xì)胞團(tuán)體內(nèi)移植后，可以在不使用免疫抑制劑的情況下維持胰島分泌功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移植后糖尿病腎病大鼠腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)得到顯著改善。在實(shí)驗(yàn)后期，隨著微囊內(nèi)胰島分泌功能下降，移植組大鼠血糖逐步上升，但至結(jié)束時(shí)微囊組大鼠血糖仍低于糖尿病組。相比于前期胰島移植實(shí)驗(yàn)，微囊化的胰島移植對(duì)體內(nèi)血糖調(diào)控效果略差。主要因機(jī)體的抗異物反應(yīng)，導(dǎo)致微囊被纖維組織包裹，引起囊內(nèi)胰島細(xì)胞缺氧死亡，而體內(nèi)局部炎癥反應(yīng)，加重這一過(guò)程［13］。因此，較多研究者希望利用新的相容性更好的人工生物材料來(lái)包裹胰島細(xì)胞團(tuán)，減少體內(nèi)反應(yīng)，延長(zhǎng)存活時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，微囊表面結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞，可以促進(jìn)血管新生，達(dá)到延長(zhǎng)微囊內(nèi)胰島細(xì)胞團(tuán)存活時(shí)間［14］。

TGF-β1是重要的調(diào)節(jié)因子，其能引起腎臟組織一系列顯微結(jié)構(gòu)改變，包括系膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡；此外，TGF-β1使內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致腎小球硬化，且促進(jìn)腎小管和間質(zhì)纖維化［15］。CTGF是TGF-β1下游介質(zhì)之一，能介導(dǎo)細(xì)胞間相互粘附，并促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移浸潤(rùn)及誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成［16］。TGF-β1表達(dá)增加可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中CTGF表達(dá)上調(diào)。持續(xù)高血糖狀態(tài)可以促進(jìn)TGF-β1過(guò)度表達(dá)，激活TGF-β1/Smad途徑，上調(diào)下游促纖維介質(zhì)活化，導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化過(guò)程［17］。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，糖尿病腎病大鼠血糖明顯好轉(zhuǎn)，雖不能完全恢復(fù)正常，但大鼠腎組織纖維化程度仍明顯緩解。隨著大鼠血糖好轉(zhuǎn)，腎臟組織中TGF-β1及下游的CTGF蛋白的表達(dá)均明顯下降。作者推測(cè)胰島細(xì)胞團(tuán)可以根據(jù)血糖波動(dòng)持續(xù)分泌胰島素，糾正體內(nèi)高血糖狀態(tài)，并且可以維持穩(wěn)定的血糖狀態(tài)，這可能更有利于早期糖尿病腎病的恢復(fù)。還有文獻(xiàn)報(bào)道，胰島分泌的C肽對(duì)于糖尿病腎病也有治療作用，但具體機(jī)制尚不明確［18］。MCP-1是評(píng)估血管硬化的重要指標(biāo)。持續(xù)高血糖可通過(guò)多種途徑引起腎臟損害，不僅直接導(dǎo)致腎小球硬化癥，還會(huì)造成腎內(nèi)各級(jí)動(dòng)脈硬化、閉塞，減少腎內(nèi)血流，加重腎臟纖維化。實(shí)驗(yàn)顯示，糾正持續(xù)高血糖可以顯著改善糖尿病大鼠腎動(dòng)脈硬化程度。因此，推測(cè)腎臟內(nèi)動(dòng)脈的硬化程度也得到一定的改善，從而抑制腎小球的纖維化。

綜上所述，采用腹腔APA微囊化胰島移植，可以顯著減少早期糖尿病腎病大鼠的尿蛋白總量。其可能機(jī)制是通過(guò)抑制TGF-β1及下游CTGF表達(dá)，以及改善腎臟血管硬化程度，最終達(dá)到緩解腎臟纖維化過(guò)程。目前微囊化的胰島移植長(zhǎng)期治療效果仍不理想，但隨著生物工程進(jìn)步，微囊化胰島移植技術(shù)將為臨床治療糖尿病腎病提供一個(gè)新的策略。