老年db/db 小鼠疾病狀態(tài)和炎癥反應(yīng)程度的評(píng)價(jià)

樊蕊 郝云濤 劉欣然 康家偉 胡佳妮 徐美虹 李勇

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191）

糖尿病是當(dāng)前威脅人類健康的嚴(yán)重慢性疾病之一，長(zhǎng)期的高血糖引起全身多系統(tǒng)的代謝障礙，導(dǎo)致大血管和微血管的病變，出現(xiàn)嚴(yán)重的心、腦、腎、眼、神經(jīng)等的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。大量的研究表明炎癥介質(zhì)在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用〔1〕。純合子（db/db）小鼠是美國(guó)Jackson 實(shí)驗(yàn)室在1966 年從C57BL/6J 小鼠中篩選出的一株突變系，該小鼠由于常染色體隱性遺傳的瘦素受體基因缺陷，其長(zhǎng)鏈?zhǔn)菟厥荏wOb/Rb 被替換成了短鏈?zhǔn)菟厥荏wOb/Ra，導(dǎo)致具有自發(fā)糖尿病特性，db/db小鼠表現(xiàn)為肥胖及多飲、多食等癥狀。這種小鼠的發(fā)病過(guò)程與人類2 型糖尿病表現(xiàn)極為相似，是研究人類2 型糖尿病的理想動(dòng)物模型〔2〕。

研究表明，2 型糖尿病的發(fā)病通常伴隨有炎癥反應(yīng)急性期的反應(yīng)標(biāo)志物的升高，如C-反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8 等〔3〕，而國(guó)外研究表明，這些炎癥反應(yīng)因子或直接或間接參與了2 型糖尿病的胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生和發(fā)展〔4〕。腫瘤壞死因子（TNF）-α 抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 的表達(dá)，直接導(dǎo)致機(jī)體的胰島素抵抗〔5〕。而另一種炎癥因子IL-6，可以通過(guò)STAT3-SOCS3 信號(hào)通路影響胰島素受體信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致機(jī)體的胰島素抵抗〔6〕。

目前學(xué)者對(duì)于db/db 小鼠生命特征和疾病狀態(tài)的研究多集中在20 周齡以下，而對(duì)于老年db/db 小鼠生命特征和疾病狀態(tài)并未見報(bào)道，同時(shí)對(duì)于該模型老年小鼠的炎癥反應(yīng)并無(wú)報(bào)道。本文旨在探討老年db/db 小鼠疾病狀態(tài)及炎癥反應(yīng)程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常飼養(yǎng)的雄性db/db 糖尿病小鼠（20 只）及與之周齡、性別匹配的非糖尿病健康同窩出生仔畜（db/m 小鼠，20 只）。SPF 級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，濕度50%～60%。以美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)（AIN-93G）動(dòng)物飼料作為基礎(chǔ)飼料，所有動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。待正常飼養(yǎng)至72 w 的bd/bd 及db/m 小鼠進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，同時(shí)以正常飼養(yǎng)至25 w的db/db 型糖尿病小鼠（20 只）為青年對(duì)照組。

1.2 儀器 安穩(wěn)血糖儀、安穩(wěn)血糖試紙（三諾公司）；Andygene 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（北京麥格泰克科技有限公司）；352 型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察及體格指標(biāo)測(cè)定 每周觀測(cè)并記錄動(dòng)物的活動(dòng)度、毛發(fā)光澤、攝食量、飲水量、體質(zhì)重量。

1.3.2 糖耐量實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 將小鼠在測(cè)定前1 d 禁食12 h（自由飲水），禁食結(jié)束時(shí)灌胃葡萄糖溶液（50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），劑量為4 μg/（g· bw），測(cè)定給葡萄糖后0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h的血糖值，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。AUC=1/2×（0 h血糖值+0.5 h 血糖值）×0.5+1/2×（0.5 h 血糖值+1 h血糖值）×0.5+1/2×（1 h 血糖值+2 h 血糖值）×1。

1.3.3 尿液收集 將正常飼養(yǎng)至82 周齡、35 周齡的小鼠置于代謝籠中，收集24 h 尿液，尿液采集后，立即混勻，測(cè)定體積。

1.3.4 血清炎癥指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，摘眼球采血，分離血清，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）說(shuō)明書操作，檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、脂多糖（LPS）水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 老年db/db 和db/m 小鼠體重、攝食量、飲水量及尿量的變化 由表1 可以看出，老年db/db 小鼠隨著生長(zhǎng)周齡的增加，其體重呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)。而db/m 小鼠體重的變化大體恒定，但是在整個(gè)老年期，db/db 小鼠整體體重高于db/m 小鼠。在老年期間，db/db 小鼠攝食量未呈現(xiàn)規(guī)律變化，而db/m 攝食量呈現(xiàn)曲折下降的趨勢(shì)，其整體攝入量始終低于db/db 小鼠。

表1 70～86 周齡db/db 和db/m 小鼠體重和攝食量的變化()

表1 70～86 周齡db/db 和db/m 小鼠體重和攝食量的變化()

82 周齡的db/db 小鼠的體重與同周齡db/m 小鼠和35 周齡db/db 小鼠之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而無(wú)論82 周齡db/db 小鼠還是35 周齡db/db 小鼠的飲水水量和尿量均顯著高于db/m 小鼠（P＜0.05）。各個(gè)周齡小鼠的攝食量順序依次為:db/db（35 周齡）＞db/db（82 周齡）＞db/m（82 周齡），其中35 周齡db/db 小鼠攝食量顯著高于db/m小鼠（P＜0.05）。見表2。

表2 臨近壽命終點(diǎn)db/db 和db/m 小鼠體重、攝食量、飲水量及尿量比較()

表2 臨近壽命終點(diǎn)db/db 和db/m 小鼠體重、攝食量、飲水量及尿量比較()

與db/m（82 周齡）相比:1）P＜0.05；與db/db（82 周齡）相比:2）P＜0.05；表3 同

2.2 db/db 和db/m 小鼠體型 由圖1 可以看出，db/m 體型顯著小于db/db 小鼠，雖然其下肢肌肉可見萎縮，但其脂肪明顯少于db/db 小鼠，而35 周齡db/db 小鼠體型略大于82 周齡db/db 小鼠，可清楚看到其腹腔的脂肪，雖然其下肢肌肉并未見明顯萎縮，但其下肢肌肉間存在明顯的脂肪浸潤(rùn)。

圖1 不同周齡的db/db 和db/m 小鼠體型

2.3 82 周齡db/db 小鼠糖耐量情況 82 周齡db/m小鼠餐后血糖在餐后0.5 h 達(dá)到血糖峰值，隨后血糖水平出現(xiàn)下降，此現(xiàn)象與35 周齡db/db 小鼠血糖變化相似，但35 周齡db/db 小鼠血糖水平明顯高于82 周齡db/m 小鼠，其血糖峰值水平將近db/m血糖峰值的3 倍。而82 周齡db/db 小鼠血糖在餐后0.5 h 持續(xù)上升，餐后1 h 達(dá)到血糖峰值，之后保持恒定，并未出現(xiàn)血糖值的回落。各個(gè)周齡小鼠口服糖耐量的AUC，可以清楚看到，各個(gè)周齡小鼠AUC 大小排序?yàn)?82 周齡db/m＜82 周齡db/db＜35周齡db/db，其中老年db/m 小鼠AUC 顯著小于老年db/db 和青年db/db 小鼠（P＜0.05）。見表3。

2.4 82 周齡db/db 小鼠炎癥反應(yīng)情況 無(wú)論82周齡還是35 周齡db/db 小鼠，其IL-1β、LPS 和TNF-α 含量均大于db/m 小鼠，其中，db/db 小鼠LPS 含量顯著高于db/m 小鼠（P＜0.05），而35 周齡db/db 小鼠IL-1β、IL-6、LPS 和TNF-α 的含量稍低于老年db/db 小鼠。見表3。

表3 db/db 和db/m 小鼠的口服葡萄糖耐量及血清炎癥指標(biāo)比較()

表3 db/db 和db/m 小鼠的口服葡萄糖耐量及血清炎癥指標(biāo)比較()

3 討論

db/db 小鼠于出生4 w 后，逐漸出現(xiàn)肥胖、高血糖、高血脂和胰島素抵抗等特征，8～12 w 后，血糖持續(xù)升高，直至出現(xiàn)慢性并發(fā)癥和胰島β 細(xì)胞功能衰竭，10 個(gè)月左右死亡，這種小鼠的發(fā)病過(guò)程與人類2 型糖尿病表現(xiàn)極為相似，是研究人類2 型糖尿病的理想動(dòng)物模型〔2，7～9〕。

db/db 小鼠在早期發(fā)育階段，甚至于在3～4 周齡時(shí)即顯現(xiàn)糖尿病征兆。從血糖水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，老年db/db 2 型糖尿病小鼠餐后1 h 血糖達(dá)到峰值，且峰值持續(xù)1 h，而青年db/db 小鼠，db/m 小鼠餐后0.5 h 達(dá)到血糖峰值，之后很快血糖出現(xiàn)下降，只不過(guò)青年db/db 小鼠血糖峰值高于db/m 小鼠。此結(jié)論與劉靜等〔10〕研究相似，其報(bào)道13 周齡的db/db 小鼠能維持穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)，糖耐量異常，其口服葡萄糖 0.5 h 達(dá)到血糖峰值，AUC 為56.2 mmol/（L·h），但其并未比較青年和老年db/db 血糖水平及糖耐量情況，這恰巧是本文的創(chuàng)新之處。本文發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，db/db 小鼠糖耐量有所變化，主要表現(xiàn)在血糖峰值出現(xiàn)的時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。

近年來(lái)，糖尿病的炎癥學(xué)說(shuō)日益受到關(guān)注，認(rèn)為T2DM 是一種自然免疫和低度炎癥性疾病〔11〕。炎性因子（如IL-6，TNF-α）激活的一系列酶會(huì)阻礙胰島素受體底物正常的酪氨酸磷酸化，從而干擾胰島素信號(hào)通路的下傳，引起胰島素抵抗。炎性因子IL-6 和TNF-α 有引發(fā)胰島素抵抗的共同作用機(jī)制，即通過(guò)干擾胰島素的生物信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制其生物學(xué)作用和通過(guò)影響GLUT-4 的合成來(lái)降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能〔12，13〕。炎性因子還作用于胰島素受體底物，使其絲氨酸、蘇氨酸磷酸化后加速胰島素受體底物的降解，促進(jìn)胰島β 細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合與前期報(bào)道〔14〕相似，2 型糖尿病往往伴有慢性低度炎癥，甚至在糖尿病前期就存在，表現(xiàn)為循環(huán)系統(tǒng)炎癥因子如IL-6、TNF-α、IL-1 水平升高，報(bào)道稱，LPS 釋放入血后，先與LPS 結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，之后在于單核細(xì)胞、T 細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞表面的蛋白復(fù)合物受體相互作用，將LPS 信靠轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)，激活靶基因，產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子〔15〕。本文結(jié)果顯示，db/db 小鼠血清中LPS 含量顯著高于db/m 小鼠，此指標(biāo)也被學(xué)者發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者血清中發(fā)現(xiàn)含量升高〔16〕。

本文結(jié)論與前期報(bào)道〔17～19〕相似，陳洋等〔17〕報(bào)道與青年小鼠（3 月齡）比較，自然衰老小鼠（24 月齡）血清中炎癥細(xì)胞TNF-α、ICAM-1、IL-2、IL-6 的含量均明顯上調(diào)。馬瑩娟等〔18〕報(bào)道D-半乳糖所致衰老大鼠腦內(nèi)促炎性因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)增加，而抗炎因細(xì)胞因子IL-4 和IL-10 表達(dá)減少。劉芳等〔19〕比較了自發(fā)性2 型糖尿病小鼠db/db 和誘發(fā)性2 型糖尿病小鼠，db/db 小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)較誘發(fā)性糖尿病小鼠高，其中IL-6、TNF-α 具有顯著性差異。