紫草酸對Sepsis 大鼠下肢深靜脈血栓的影響及作用機制

田佳 郭旭 雷振林 高小新 魏曉芬 徐志育 屈恒星

（海南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,海南 ?？?570010）

膿毒血癥是因為感染導(dǎo)致免疫失調(diào)引起各種器官功能障礙，其發(fā)展較為快速，病死率高達(dá)70%～80%〔1〕，主要生理表現(xiàn)為血流速度緩慢、炎癥介質(zhì)過量釋放、自身免疫系統(tǒng)失調(diào)、造成血小板過度活化、對血管內(nèi)皮產(chǎn)生損傷。研究指出，下肢深靜脈血栓是膿毒血癥的主要并發(fā)癥，其發(fā)生率為30%～50%，增加患者死亡風(fēng)險〔2，3〕。目前臨床中主要通過抗血栓藥物治療，以單信號通路、單作用靶點為主要作用途徑，其治療效果并不明確。也有研究指出，膿毒血癥大多伴隨凝血功能障礙，造成患者活動性出血增多，因此抗血栓藥物治療具有一定局限性〔4〕。丹參的主要有效成分包括脂溶性二萜醌類化合物和水溶性酚酸類化合物，其中水溶性酚酸類化合物屬于丹參酚酸類物質(zhì)，紫草酸是丹參主要的水溶性有效成分，有較好的消化道吸收作用，并且作用相對緩和，能夠降低出血風(fēng)險〔5，6〕。紫草酸在川芎、當(dāng)歸、藏紅花等中藥材中廣泛存在，并且提取方便，價格較低。王毓國等〔7〕指出，血栓素（TX）A2 和前列環(huán)素（PGI2）生成后迅速代謝產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的TXB2 和6 酮前列腺素（6-keto-PG）F1α，通對檢測兩種產(chǎn)物，根據(jù)其濃度變化反映TXA2 與PGI2 水平。本研究探討紫草酸對膿毒血癥大鼠下肢深靜脈血栓的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級健康雄性SD 大鼠60只，8～10 周齡，平均（9.8±1.2）周齡，體重200～220 g，平均（210.4±5.2）g，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作，環(huán)境溫度保持于22～25℃，濕度45%～55%，每小時通風(fēng)6～10 次，每天按時給水及添加飼料，每2天更換墊料1 次。環(huán)境清潔度為10 萬級，菌落數(shù)＜12.2 個/皿，噪聲＜60 dB（A），光照和黑暗各12 h。本研究所做實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑:兔抗人TXB2、6-keto-PGF1α、β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）抗兔二抗均購自英國Abcam 公司。放射免疫計數(shù)器和放射免疫分析試劑購自天津九鼎公司。紫草酸購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 模型建立 大鼠均于術(shù)前12 h 禁食，不禁水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 后，采用盲腸結(jié)扎-穿孔法制作膿毒血癥模型，使用苯巴比妥50 mg/kg 進(jìn)行腹腔注射麻醉，備皮，大鼠取仰臥位進(jìn)行固定，消毒、鋪巾，沿腹白線行1 cm 腹部切口，進(jìn)入腹腔，將盲腸暴露后給予結(jié)扎，采用18 號針穿刺，當(dāng)腸內(nèi)容物溢出后，將盲腸置入腹腔，之后將腹部切口分層縫合，腹腔注射50 ml/kg 的生理鹽水進(jìn)行抗休克。造模后24 h 內(nèi)觀察大鼠癥狀:精神倦怠、躁動、寒戰(zhàn)、腹脹、眼角分泌物增多、豎毛等均符合膿毒血癥癥狀，說明膿毒血癥模型建立成功，總計50 只。

1.3 給藥干預(yù) 將建模成功的大鼠隨機分為空白對照組10 只，給予生理鹽水灌胃干預(yù)；低分子肝素鈉組10 只，給予低分子肝素皮下注射，劑量為100 IU/kg每天；小、中、大劑量紫草酸組各10 只，分別給予1、3、5 mg/kg 紫草酸灌胃干預(yù)，劑量為1 ml/100 g 每天。連續(xù)干預(yù)3 d，期間大鼠均自由飲水和進(jìn)食，統(tǒng)計病死率，觀察大鼠嘔血、便血、尿血、手術(shù)切口血性滲液等癥狀，計算活動性出血發(fā)生率。

1.4 下肢深靜脈血栓模型建立 所有大鼠在最后一次給藥干預(yù)8 h 后，通過結(jié)扎股靜脈建立下肢深靜脈血栓模型。采用苯巴比妥50 mg/kg 進(jìn)行腹腔注射麻醉后，取仰臥位，固定，在大鼠腹股溝區(qū)備皮、消毒、鋪巾，暴露大鼠股靜脈并結(jié)扎，2 h 后采用神經(jīng)血管鉗夾住結(jié)扎線下方約2 cm 處，將股靜脈縱向打開，觀察下肢深靜脈血栓模型建立情況。

1.5 血栓組織病理學(xué)觀察 所有大鼠建模成功后禁食和禁水，斷頭處死，立即提取大鼠下肢深靜脈血栓組織，使用濾紙干燥后，在電子分析天平上稱重，計算大鼠血栓形成抑制率=對照組血栓重-干預(yù)組血栓重/對照組血栓重×100%。將提取的組織制作標(biāo)本，使用40 ml/L 的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作5 μm 的組織切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察。

1.6 TXB2 和6-keto-PGF1α 活性檢測 使用放射免疫計數(shù)器。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測纖溶酶原激活物（t-PA）、凝血酶原激活物抑制因子（PAI）-1、血漿纖溶酶（PLG）、抗凝血酶（AT）-Ⅲ活性 取大鼠膿毒血癥模型建立前、下肢深靜脈血栓模型建立前、建模2 h后的股靜脈取血2 ml，保存。將采集到的血液標(biāo)本，取包被液（pH9.5，0.05 mol/L CB）適當(dāng)稀釋的抗t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ0.1 ml，添加至聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，加蓋后溫度4℃24 h，次日使用洗滌劑洗滌3 次后，甩干。在各孔中加入稀釋液（pH7.4，0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液）稀釋的待測標(biāo)本0.1 ml，同時加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，在43℃放置60 min，將液體移除洗滌3 次后，甩干。在各孔中加入t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ酶標(biāo)抗體0.1 ml，43℃放置60 min。液體移去后洗滌3 次，甩干。在各個空中加入底物液（0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L）5.14 ml，0.05 mol/L 枸櫞酸（10.5 g/L）4.86 ml 混勻，加入鄰苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，臨用時加30% H2O24.0 μl，混勻）0.1 ml，暗盒放置20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取405 吸收值。

1.8 Western 印跡檢測TXB2、6-keto-PGF1α 蛋白表達(dá) 將采集到的標(biāo)本，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行定量分析。50 μg 的蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），通過蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，將膜完全浸沒于5%脫脂奶粉Tris-HCl 緩沖液（TBST）中，室溫下輕搖1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液（TXB2、6-keto-PGF1α 按照1 ∶1 000 比例進(jìn)行稀釋），4℃過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液（TXB2、6-keto-PGF1α 按照1 ∶5 000比例進(jìn)行稀釋），在溫床中孵育1 h 后再次洗滌，加入電化學(xué)發(fā)光液（ECL），曝光2～3 次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH 做內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組血栓組織病理學(xué)觀察 空白對照組有大量炎性細(xì)胞浸潤，并且分布較為分散，血栓充滿管腔，內(nèi)膜下有空泡細(xì)胞。低分子肝素鈉組有少量的炎性細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹。小劑量紫草酸組和大劑量紫草酸組隨著濃度增加血管壁與血栓逐漸分離。中劑量紫草酸組血管壁與血栓分離較為明顯，并且血栓周圍、中央有大面積機化再通，血栓的長度縮短，溶解。見圖1?？瞻讓φ战M血栓抑制率為0%，低分子肝素鈉組血栓抑制率為10%，小劑量紫草酸組血栓抑制率為50%，中劑量紫草酸組血栓抑制率為77%，大劑量紫草酸組血栓抑制率為60%，具有統(tǒng)計差異（P＜0.05）。

2.2 紫草酸對病死率、活動性出血發(fā)生率影響 各組病死率、活動性出血發(fā)生率比較具有統(tǒng)計差異（P＜0.05）。中劑量紫草酸組病死率、活動性出血發(fā)生率最低。見表1。

表1 各組病死率、活動性出血發(fā)生率比較〔n(%),n=10〕

2.3 紫草酸對TXB2 和6-keto-PGF1α 活性及蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組相比，低分子肝素鈉組、小、大、中劑量紫草酸組TXB2 活性及蛋白表達(dá)顯著降低，6-keto-PGF1α 活性及蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與低分子肝素鈉組相比，小、大、中劑量紫草酸組TXB2 活性及蛋白表達(dá)顯著降低，6-keto-PGF1α活性及蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；中劑量紫草酸組TXB2 活性及蛋白表達(dá)顯著低于小、大劑量紫草酸組，6-keto-PGF1α 活性及蛋白表達(dá)顯著高于小、大劑量紫草酸組（P＜0.05）。見表2、表3、圖2。

圖2 各組TXB2、6-keto-PGF1α 蛋白表達(dá)

表3 各組TXB2、6-keto-PGF1α 蛋白表達(dá)比較(,n=10)

表3 各組TXB2、6-keto-PGF1α 蛋白表達(dá)比較(,n=10)

2.4 紫草酸對t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性的影響 與空白對照組相比，低分子肝素鈉組、小、大、中劑量紫草酸組t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性顯著升高（P＜0.05）。與低分子肝素鈉組相比，小、大、中劑量紫草酸組t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性顯著升高（P＜0.05）；中劑量紫草酸組t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性顯著高于小、大劑量紫草酸組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組TXB2、6-keto-PGF1α 及t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性比較(,n=10)

表2 各組TXB2、6-keto-PGF1α 及t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性比較(,n=10)

與空白對照組比較:1）P＜0.05；與低分子肝素鈉組比較:2）P＜0.05；與小劑量紫草酸組比較:3）P＜0.05；與大劑量紫草酸組比較:4）P＜0.05；下表同

3 討論

膿毒血癥的發(fā)生是因為機體受到外界的刺激，導(dǎo)致機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，有大量的炎性介質(zhì)產(chǎn)生，免疫功能會出現(xiàn)巨大缺陷，患者多種器官和組織出現(xiàn)功能性障礙〔8〕。下肢深靜脈血栓是膿毒血癥主要的并發(fā)癥，目前臨床治療主要以抗靜脈血栓藥物為主，其特點是單藥、單作用靶點、單信號通道，在治療膿毒血癥并發(fā)的多信號通路、多蛋白表達(dá)中，效果并不理想〔9，10〕。因此尋找多作用靶點及多信號通路，安全性高的抗血栓藥物，至關(guān)重要。

本研究說明紫草酸能夠有效地抑制大鼠下肢深靜脈血栓形成，中劑量紫草酸作用效果明顯。此外，紫草酸能降低大鼠病死率和活動性出血發(fā)生率，促進(jìn)大鼠成活，紫草酸在治療膿毒血癥應(yīng)用較為安全。TXA2 與PGI2 是花生四烯酸代謝過程重要的產(chǎn)物，TXA2 主要通過血小板產(chǎn)生，引發(fā)血管收縮，促進(jìn)血小板大量聚集，能導(dǎo)致微血管損傷，參與血栓形成過程〔11，12〕。TXA2 和PGI2 在正常生理狀態(tài)下能有效維持動態(tài)平衡，通過相互間的拮抗、協(xié)調(diào)作用，促進(jìn)血管收縮性和血小板正常功能，有助于凝血功能正?！?3，14〕。有研究指出，TXA2 和PGI2 極容易發(fā)生紊亂，很快會轉(zhuǎn)化為TXB2 和6-keto-PGF1α〔15〕。本研究說明紫草酸能有效改善TXB2 和6-keto-PGF1α 活性，并且呈濃度依賴。汪能等〔16〕研究指出，消栓飲干預(yù)創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓模型大鼠，能降低TXB2水平，升高6-keto-PGF1α 水平，促進(jìn)TXB2/6-keto-PGF1α 值接近正常，對血栓形成后TXB2/6-keto-PGF1α 的平衡失調(diào)有糾正作用。本文研究結(jié)果與其保持一致，說明中劑量紫草酸也能起到相同的作用效果。組織t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ等因子通過局部作用對血管內(nèi)皮及血小板產(chǎn)生影響，在這一過程中，TXA2 與PGI2 蛋白表達(dá)起到相應(yīng)的靶向作用〔17〕。齊中意等〔18〕指出，膿毒血癥發(fā)病與凝血功能異常有關(guān)，凝血系統(tǒng)激活是膿毒癥發(fā)病重要的環(huán)節(jié)，與炎癥反應(yīng)之間相互作用，在病理生理過程中具有促進(jìn)作用。t-PA 活性能夠有效地反映內(nèi)皮損傷情況和新血栓形成情況〔19〕。AT-Ⅲ異常會造成機體內(nèi)生理性抗凝機制產(chǎn)生損傷，形成血液高凝狀態(tài)〔20〕。本研究結(jié)果說明紫草酸能提高t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性，提高纖溶系統(tǒng)活性。紫草酸能抑制TXB2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)6-keto-PGF1α 蛋白表達(dá)，起到改善TXB2 和6-keto-PGF1α 水平，改善膿毒血癥并發(fā)下肢深靜脈血栓的效果。

綜上，紫草酸能降低膿毒血癥大鼠下肢深靜脈血栓活動性出血發(fā)生率，通過調(diào)控TXB2 和6-keto-PGF1α 蛋白，提高t-PA、PAI-1、PLG、AT-Ⅲ活性，從而抑制血栓形成。