柑橘CLas 和CYVCV 雙重PCR 檢測體系的建立及應(yīng)用

王培育， 楊 學(xué)

(三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 福建沙縣365051)

柑橘(Citrus reticulataBlanco)又名寬皮橘、黃橘，是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)的常綠小喬木。 柑橘廣泛種植于北緯35°以南的區(qū)域，目前中國是柑橘最大的生產(chǎn)國，廣西是中國最大的柑橘產(chǎn)區(qū)(劉印璇，2019)。 柑橘營養(yǎng)豐富，色香味兼優(yōu)，既可鮮食又可加工成以果汁為主的各種加工制品(沈曉暉，2018)。 柑橘易受多種病害的影響，其中以柑橘黃龍病和黃化脈明病最為常見。

柑橘黃龍病是一種由韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter)引起的，對柑橘具有毀滅性的病害，可嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至造成柑橘樹枯死，能夠侵染包括柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香在內(nèi)的多種蕓香科植物(Guzet al，2020)。 我國的柑橘黃龍病主要是由柑橘黃龍病菌亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas)引起的。 柑橘木虱和帶病苗木或帶病接穗是遠(yuǎn)距離傳病的主因，往往使無病的新區(qū)變成病區(qū)，而柑橘長期以來通過扦插或嫁接的方式進(jìn)行種苗繁育，極易造成大面積帶病植株的傳播。 在商業(yè)化種植過程中，通常在柑橘發(fā)現(xiàn)病害時，將整株植株直接銷毀(Dinget al，2020；Zhou，2020；肖翠等，2019)。 柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)屬于印度柑橘病毒屬(Mandarivirus)，雖然80%的植物病毒病依賴于媒介昆蟲傳播，但前期研究未發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)該病毒在柑橘間進(jìn)行傳播的昆蟲(劉翠花等，2016；劉惠芳，2018)。 有研究發(fā)現(xiàn)，該病一旦發(fā)生，可在短時間內(nèi)迅速傳播，主要傳播方式是嫁接傳播，且傳毒效率較高，苗木帶毒可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播(張艷慧，2018)。 因此，培育不含CLas和CYVCV 的柑橘苗，并及早發(fā)現(xiàn)含有CLas 和CYVCV 的柑橘植株，是防控柑橘黃龍病和黃化脈明病的關(guān)鍵。

雖然受CLas 和CYVCV 感染的柑橘植株可表現(xiàn)出明顯特征，但并不排除表型良好的植株不含有CLas 和CYVCV，染病植株需經(jīng)過長短不一的潛伏期后才表現(xiàn)癥狀，待其癥狀明顯時，防治難度及經(jīng)濟(jì)損失增大(Zhou，2020；劉翠花等，2015)。 目前，對柑橘黃龍病和黃化脈明病已有大量研究，但其檢測技術(shù)仍較為復(fù)雜，且存在假陰性和假陽性現(xiàn)象(胡浩等，2006)。 本研究通過同時檢測CLas 和CYVCV，可大大提高檢測效率，縮短檢測時間和檢測成本，并且通過對特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測，能夠排除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性和假陽性的產(chǎn)生。 研究結(jié)果可為柑橘田間病毒的快速檢測和后期病害防治及脫毒技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)位于三明市尤溪柑橘園，選取5 年生以上的柑橘植株， 采集感染有柑橘黃龍病菌(CLas)、柑橘黃化脈明病毒(CYVCV)以及健康柑橘苗的葉片，其中以PCR 檢測后呈現(xiàn)陰性的健康柑橘苗葉片為陰性對照。 采集的柑橘葉樣品均經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已登錄的CLas 16S 和CYVCV 外殼蛋白(coat protein，CP)以及內(nèi)參CTACT基因的保守核苷酸序列，使用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)CLas 16S 和CYVCV 的特異性引物各2 對，內(nèi)參CTACT基因的特異性引物1 對(表1)，以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 引物序列和預(yù)期目的片段大小Table 1 Primer sequence and expected target fragment size

1.3 總RNA 的提取及cDNA 的合成

采用王培育等(2018)改良的Trizol UP RNA 方法提取葉片RNA，用酶標(biāo)儀檢測RNA 濃度，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量，使用Prime ScriptTMRT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKARA 生物公司)合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄后將各模板樣品稀釋至10 ng·L-1，保存于4 ℃冰箱備用。

1.4 供試樣品PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增體系參照王培育等(2019)的研究方法，取25 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以健康柑橘苗葉片作為陰性對照，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照保存。

1.5 靈敏度檢測

采用1.4 中的PCR 體系對柑橘樣品進(jìn)行檢測，樣品的cDNA 原液按10 倍梯度進(jìn)行稀釋，依次稀釋cDNA 原液濃度為100～10-5。 隨后在PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病和健康柑橘樣品表型

采集的柑橘樣品，對其健康和感病葉片拍照記錄。 如圖1 所示，圖1A 為健康的柑橘葉片，葉片平整，脈絡(luò)清晰，葉色翠綠且有光澤度。 圖1B 為感染柑橘黃龍病的葉片，出現(xiàn)斑駁黃化、均勻黃化及缺錳、鋅狀黃化；其果小、畸形，著色異常如紅鼻子果、青頭果等，表面無光澤。而在光照條件下，可以觀察到圖1C 為感染黃化脈明病的柑橘葉片，葉脈發(fā)黃透亮，周邊葉肉有黃斑，后期葉片皺縮；有些柑橘品種感病后還常伴隨著褪綠、花葉等。 該病在新葉上表現(xiàn)出癥狀，且表現(xiàn)的脈明癥狀會隨著葉片的老化逐漸減弱。 圖1D 為同時感染了柑橘黃龍病和黃化脈明病的柑橘葉片，表現(xiàn)出葉片斑駁黃化，葉脈明顯且葉片皺縮現(xiàn)象。

圖1 健康和感病柑橘葉片表型Figure 1 Phenotype of healthy and susceptible in Citrus leaf

2.2 應(yīng)用PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCV 的感病情況

PCR 擴(kuò)增約2 h 后，將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后觀察拍照，結(jié)果如圖2 所示。 1 號泳道以H2O 為模板，無條帶擴(kuò)增；2 號泳道為2 對CLas 和1 對CTACT特異引物組合，以感染黃龍病病葉cDNA 為模板，同時擴(kuò)增得到840、748 bp CLas 特異片段和120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段；3 號泳道為2 對CYVCV 和1 對CTACT特異引物組合，以感染黃化脈明病病葉cDNA 為模板，同時擴(kuò)增得到447、325 bp CYVCV 特異片段和120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段；4 號泳道為2 對CLas、2 對CYVCV 和1 對CTACT特異引物組合，以同時感染黃龍病和黃化脈明病病葉cDNA 為模板，除擴(kuò)增出120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段，還同時擴(kuò)增得到840、748 bp CLas 特異片段和447、325 bp CYVCV 特異片段；5 號泳道以健康葉片cDNA 為模板(陰性對照)，使用表1 所述的5 組引物組合，采用1.4 中PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，并進(jìn)行雙重檢測，只擴(kuò)增出120 bp 的內(nèi)參條帶，排除了假陽性和假陰性產(chǎn)生的可能。 結(jié)果表明，待測葉片感染了 CLas 和 CYVCV。

圖2 PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCVFigure 2 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

2.3 靈敏度檢測

分別以100～105稀釋倍數(shù)的cDNA 液為模板進(jìn)行目標(biāo)片段PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。 檢測結(jié)果如圖3 所示，以CLas 16S F118、CLas 16S R866、CLas 16S R958 組合分別可以擴(kuò)增出 748 和 840bp 特異性條帶；CYVCV CP F41、CYVCV CP F163、CYVCV CP R488 組合分別可以擴(kuò)增出447 和325 bp 特異性條帶；CTACTF460、CTACTR580組合可擴(kuò)增出120 bp 特異性條帶。 結(jié)果表明，待測樣品含有CLas 和CYVCV 且cDNA 合成質(zhì)量可用。 圖 3 中泳道 1～5 分別為待測樣品 cDNA 在原液及稀釋 101、102、103、104倍條件下擴(kuò)增出的CLas、CYVCV 及CTACT目的條帶；泳道6 為待測樣品cDNA 在稀釋105倍條件下還能擴(kuò)增出CYVCV 目的條帶。 結(jié)果表明，該特異性引物組合不僅能夠排除假陽性和假陰性產(chǎn)生，還具有高度靈敏性。

圖3 PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCVFigure 3 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

3 結(jié)論與討論

柑橘產(chǎn)業(yè)深受病害問題的困擾。 迄今為止，我國的柑橘病害有300 多種，分為侵染性病害和非侵染性病害兩大類。 在病菌類病害中，以黃龍病最嚴(yán)重，曾造成大批柑橘園毀害，使用常用藥劑防治，效果不佳(Bove 等，2011)。 培育脫毒柑橘母本樹和苗木以及進(jìn)行抗病品種選育工作時，對其進(jìn)行病原菌檢測，在病害防治過程中起到至關(guān)重要的作用。 PCR 檢測方法雖然具有較高的特異性和靈敏度，但其檢測技術(shù)復(fù)雜、效率低，具有一定的局限性。 因此，多重PCR技術(shù)在植物病原菌檢測方面得到大力地推廣應(yīng)用(張婧穎，2016)。 劉歡等(2016)利用多重PCR 技術(shù)一次性擴(kuò)增出番茄煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)和馬鈴薯X 病毒(PVX)的特異性片段；匡云波等(2018)運(yùn)用多重PCR 技術(shù)建立PCR檢測方法，可快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地檢測太子參蠶豆萎蔫病毒(BBWV2)和蕪菁花葉病毒(TuMV)；焦楠等(2019)建立了西番蓮夜來香花葉病毒(TeMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的雙重 PCR 檢測體系。 本方法利用雙重PCR 技術(shù)進(jìn)行CLas 和CYVCV 檢測，大大提高檢測效率，縮短檢測時間和檢測成本；同時，對CLas 和CYVCV 特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測，可排除假陽性的產(chǎn)生，對內(nèi)參基因CTACT特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測，能夠排除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，首次建立起能同時檢測柑橘CLas 和CYVCV 的測體系。 以單一PCR 檢測為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物，對樣品柑橘進(jìn)行檢測，靈敏度試驗(yàn)顯示建立的PCR 體系具有較高的靈敏性，能夠檢測到10-5mg 的組織量，這是PCR 技術(shù)在柑橘病原菌檢測上的應(yīng)用，對培育脫毒柑橘母本樹和苗木以及進(jìn)行抗病品種的選育具有重要意義。