纖維素降解菌的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化

陳詩瑤， 勞艷婷， 謝 苗

(1.福建農林大學生命科學學院， 福建福州350002；2.閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室， 福建福州350002)

纖維素是植物細胞壁的重要組成成分，在大自然中分布很廣，在食品、醫(yī)藥、建筑、廢水處理以及造紙等行業(yè)中有著非常廣泛的應用(羅成成等，2015)。 但作為一種重要的資源和能源，廣泛存在的纖維素并沒有得到有效地處理或利用，大部分都被直接焚燒或丟棄，這樣的處理方式給環(huán)境和生態(tài)平衡帶來了極大的破壞(張瀚罡，2019)。 因此，如何高效、無害地降解以及利用環(huán)境中的纖維素成為目前急需解決的問題。

目前對纖維素的主要處理方法有物理法、化學法和生物學方法，但物理法和化學法工藝復雜，成本較高且有一定的環(huán)境污染，所以在實際應用中有所限制。 自然界中存在眾多高產纖維素酶的微生物，這些微生物能將自身產生的纖維素酶分泌至胞外且易于純化，且對纖維素降解有較強的專一性(王盼星等，2018)。 此外，纖維素降解菌對環(huán)境的危害小，能實現對資源的循環(huán)利用(佟碩秋等，2020；文少白等，2010)。 因此，利用微生物降解是當前降解纖維素最有效、最經濟、最環(huán)保、也是最熱門的方法(喬健敏等，2019)。 自20 世紀以來，國內外已經報道了數千個產纖維素酶的菌株(賈丙志等，2008)，如小刺青霉菌(簡立燕等，2017)、多粘芽孢桿菌(Gorskaet al，2001)、泡盛曲霉(邢力等，2019)等。 盡管目前在土壤(吳越等，2018)、植物(顧挺等，2011)、動物(李君風等，2017)和糞便(張智等，2017)等內都有獲得纖維素降解菌的相關報道，同時纖維素的生物學處理方法也得到了廣泛關注，但由于其產酶數量及產酶活力都沒有達到工業(yè)應用的要求、水解液中的產物會抑制微生物的發(fā)酵結果、部分菌株的耐受能力較低等原因，目前還難以運用到實際生產中(Daret al，2018；馬澤林等，2017)。 因此，人們仍需尋找更穩(wěn)定、更高效的纖維素降解酶來源。

廚余垃圾內有機物含量高、營養(yǎng)元素豐富，容易滋養(yǎng)病原菌等有害微生物，因此廚余垃圾的不當處理，會對環(huán)境造成嚴重污染(徐銳，2014)。 目前，對廚余垃圾的主要處理方法有焚燒、填埋、粉碎直排等非生物處理方法，好氧堆肥是主要的生物處理方法。 大部分的非生物處理方法經濟效益低，容易造成資源浪費且嚴重破壞生態(tài)環(huán)境(孫孟喜，2017)。 而采用生物處理法是較為簡單、易行、環(huán)保的方法(吳昊等，2011)。 研究表明，廚余垃圾內纖維素含量較高(鄭旴等，2016)，因此可能富含纖維素降解菌。 本研究通過剛果紅水解圈直徑初篩和測定酶活力等指標復篩，從經半年發(fā)酵的廚余垃圾中篩選出高效的纖維素降解菌，并使用響應面法優(yōu)化纖維素降解菌的培養(yǎng)條件，分析了不同碳源濃度、培養(yǎng)時間和溫度對菌株產酶活力的影響，以期得出菌株的最佳培養(yǎng)環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 福州某公司提供的已發(fā)酵6 個月的廚余垃圾。

1.1.2 培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)固體培養(yǎng)基:0.5 g KCl，0.5 g MgSO4，1.0 g K2HPO4，3.0 g NaNO3，5.0 g CMC-Na 和 20.0 g 瓊脂，溶于 1 000 mL 蒸餾水；CMC-Na 液體培養(yǎng)基:0.5 g MgSO4，3.0 g NaNO3，1.0 g K2HPO4，0.5 g KCl 和 5.0 g CMC-Na，溶于 1 000 mL 蒸餾水；LB 液體培養(yǎng)基:5.0 g 酵母提取物，5.0 g NaCl 和 10.0 g 蛋白胨，溶于 1 000 mL 蒸餾水，pH調至7.4；以上培養(yǎng)基均121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖維素降解菌的培養(yǎng)及分離純化 取10.0 g 樣品加入90 mL 無菌水中，振蕩30 min。運用梯度稀釋法制備稀釋度為10-1～10-5的樣品稀釋液。 在CMC-Na 固體培養(yǎng)基中分別進行平板涂布，28 ℃培養(yǎng)72 h。 使用三區(qū)劃線法從稀釋度為10-3～10-5且優(yōu)勢菌落分布均勻的平板中分離獲取形態(tài)大小不一的單菌株，并接種于LB 液體培養(yǎng)基制成菌液并保存。

1.2.2 纖維素降解菌的初篩 從上述菌液中各取2.5 μL 分別點種于CMC-Na 固體培養(yǎng)基中心，28 ℃培養(yǎng)72 h，重復3 次。 培養(yǎng)完畢后加入適量1 g·L-1剛果紅，均勻覆蓋培養(yǎng)基表面染色30 min 后，用1 mol·L-1NaCl 溶液浸泡30 min 洗滌。 分別測量、計算每個纖維素降解菌周圍的透明水解圈的平均直徑，經比較篩選出降解能力較強的菌株。

1.2.3 纖維素降解菌的復篩 將初篩得到的菌株分別接種于50 mL 0.5%的CMC-Na 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)72 h。 培養(yǎng)完成后進行CMC-Na 酶活力和濾紙酶活力測定，復篩出酶活力更高的菌株。

1.2.4 纖維素酶活力測定 采用二硝基水楊酸法(DNS 法)，并在馮?，|等(2013)的方法上加以改進，測定還原糖含量。 首先取干燥的葡萄糖配制1 mg·mL-1葡萄糖溶液，再取7 只試管，分別按表1 加入各試劑，沸水浴5 min，立刻冷卻至室溫，并在540 nm 波長處測定吸光值(OD值)，并以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

CMC-Na 酶活力測定，在段杰(2015)方法的基礎上略有改進，各菌株取10 mL 菌液，4 ℃，4 000 r·min-1離心15 min，取2 mL 上清液于試管中，并加入2 mL 1% CMC-Na 溶液進行充分混合，60 ℃水浴30 min。 加3 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，并定容至10 mL。 在540 nm 處測定各菌株吸光值，按葡萄糖標準曲線計算每個菌株的葡萄糖含量。 其中，對照組以2 mL 蒸餾水代替上清液。

濾紙酶活力測定，在段杰(2015)方法的基礎上略有改進:各菌株取10 mL 菌液，4 ℃，4 000 r·min-1離心15 min，取2 mL 上清液加入50 mg 干燥濾紙條于試管中振蕩充分混合，60 ℃水浴30 min。 取出濾紙條，加入3 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，并將體積定容至10 mL。 在540 nm 處測定各菌株吸光值，按葡萄糖標準曲線計算每個菌株的葡萄糖含量。 其中，以2 mL 蒸餾水代替上清液作對照組。 上述條件下，定義1 mL 酶液在60 ℃條件下，每分鐘水解纖維素產生的葡萄糖的μg 數為1 個酶活單位，以U·mL-1表示。

式中:A表示計算得出的葡萄糖含量(mg)；K表示稀釋倍數；V表示粗酶液體積(mL)；T表示反應時間(min)。

1.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.3.1 不同碳源濃度對菌株產酶的影響 分別接種1 mL 菌液在CMC-Na 濃度為0.5%，0.7%，0.9%，1.1%，1.3%，1.5%，1.7%，1.9%和 2.1%的 50 mLCMC-Na 液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h 后，在540 nm 波長下測定菌液吸光值，計算其CMC-Na 酶活力。

1.3.2 不同培養(yǎng)時間對菌株產酶的影響 取1 mL 菌液加入50 mL 0.5%的CMC-Na 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)，每隔 6 h 在 540 nm 波長下測定菌液吸光值。 從第 48 h 開始記錄數據、繪制曲線，并計算其CMC-Na 酶活力。

1.3.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株產酶的影響 取1 mL 菌液加入50 mL 0.5%的CMC-Na 液體培養(yǎng)基中，分別在 20、25、30、35、40 和 45 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng) 72 h，培養(yǎng)結束后在 540 nm 波長下測定吸光值、繪制曲線，并計算其CMC-Na 酶活力。

1.3.4 響應面試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件 在以上3個單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert 8.0.6 軟件中Box-Behnken 試驗設計，選擇碳源濃度(A)、培養(yǎng)時間(B)、培養(yǎng)溫度(C)對菌株的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以菌株經培養(yǎng)后用DNS 法所測得的540 nm 吸光值作為響應值。 試驗因素水平見表2。

表2 響應面分析因素水平表Table 2 Independent variables and levels of the response surface analysis experiment

1.4 優(yōu)化條件的檢驗

根據1.3.4 分析所得最佳培養(yǎng)條件，設計對應、可行的條件數值進行重復試驗，比較菌株經培養(yǎng)后的540 nm 處吸光值以及回歸方程模擬推測的最大吸光值，并計算其相對誤差，以檢驗優(yōu)化是否成功。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離和篩選

2.1.1 初篩結果 剛果紅染色后即形成以菌株為中心的透明水解圈。 菌株纖維素降解能力越大，分解纖維素越多，即透明水解圈直徑越大。 初篩后獲得3 個優(yōu)勢菌株為1、5、10 號，其水解圈平均直徑分別為10.50、16.50、13.33 mm。

2.1.2 復篩結果 根據葡萄糖標準曲線，計算出1、5、10 號菌株產生的葡萄糖含量。 并通過公式(1)計算CMC-Na 酶活力和濾紙酶活力(表3)。

表3 CMC-Na 酶活力及濾紙酶活力測定結果Table 3 The results of CMC-Na enzyme activity and filter paper enzyme activity test

CMC-Na 酶活力與濾紙酶活力大小均為5 號＞10 號＞1 號。 因此，選擇 5 號菌株、10號菌株進行后續(xù)培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究。

2.2 纖維素降解菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源濃度對菌株酶活的影響 如圖1 所示，5 號菌和10 號菌在低濃度CMC-Na 培養(yǎng)基中，酶活力都隨著碳源濃度的上升而逐步上升。 當碳源濃度達到1.7%時，5 號菌和10 號菌的CMC-Na 酶活力都達到最高值，分別為212.625 和49.657 U·mL-1。 到達最高值后，兩菌株的酶活力都隨著碳源濃度的增加而快速下降。

圖1 不同碳源濃度對菌株酶活的影響Figure 1 Effect of different carbon source concentrations on enzyme activity

2.2.2 不同培養(yǎng)時間對菌株酶活的影響 如圖2 所示，在培養(yǎng)48 h 后，5 號菌的酶活力隨著培養(yǎng)時間的增加而平穩(wěn)上升，當培養(yǎng)時間達到 72 h 時，CMC-Na 酶活力達到最高值172.742 U·mL-1。 在培養(yǎng)時間達到54 h 前，10 號菌株的產酶能力很弱，酶活力都很低，這可能是因為10 號菌的繁殖能力相對較弱；54 h 后，隨著培養(yǎng)時間增加，菌株酶活力逐步升高，當培養(yǎng)時間為66 h 時，其CMC-Na 酶活力達到最高值48.996 U·mL-1。 到達最高值后，兩菌株的酶活力都隨著培養(yǎng)時間的進一步增加而呈緩慢下降趨勢。

圖2 不同培養(yǎng)時間對菌株酶活的影響Figure 2 Effect of different culture times on enzyme activity

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株酶活的影響如圖3 所示，在低溫培養(yǎng)條件下，5 號菌株的酶活力隨著培養(yǎng)溫度的升高而穩(wěn)定增加。 當培養(yǎng)溫度達到 40 ℃時，菌株的CMC-Na 酶 活 性 達 到 最 高 值177.100 U·mL-1。 在低溫培養(yǎng)條件下，10號菌的活性逐漸增加，當溫度達到35 ℃時， 其 CMC-Na 酶 活 性 達 到 最 高 值47.940 U·mL-1。 到達最高值后，兩菌株的酶活力都隨著培養(yǎng)溫度的升高而持續(xù)下降。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對菌株酶活的影響Figure 3 Effect of different culture temperatures on enzyme activity

2.2.4 響應面試驗優(yōu)化 根據以上3 個單因素試驗的試驗結果，以菌株在540 nm 處的吸光值為因變量，碳源濃度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度為自變量，選用3 因素3 水平的Box-Behnken 進行試驗分析(表4、表5)。

表4 5 號菌響應面試驗設計及結果Table 4 The results of response surface methodology for bacteria No.5

表5 10 號菌響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of response surface methodology for bacteria No.10

分別對碳源濃度(A)、培養(yǎng)時間(B)、培養(yǎng)溫度(C)3 個影響因素的試驗數據進行回歸擬合(表6、表7)，得到兩個菌株經培養(yǎng)后540 nm 處吸光值的二次多項式回歸方程。

表6 5 號菌回歸方程的顯著性檢驗Table 6 Significance analysis of the regression model of bacteria No.5

表7 10 號菌回歸方程的顯著性檢驗Table 7 Significance analysis of the regression model of bacteria No.10

5 號菌的回歸方程為:吸光值＝2.380＋0.110A＋0.066B-0.072C-3.000×10-3AB＋0.071AC＋9.000×10-3BC-0.190A2-0.130B2-0.470C2。 10 號菌的回歸方程為:吸光值 ＝ 0.180 ＋7.875×10-3A-8.000×10-3B＋ 0.020C＋ 5.250×10-3AB＋0.014AC-5.750 × 10-3BC-0.020A2-7.050×10-3B2-0.072C2。

在菌株吸光值回歸模型的顯著性考察中，當P＜0.05 時，說明模型差異顯著，P＜0.01 時，表示模型差異極顯著(張學彬等，2019)。 根據表6 可知，在5 號菌的回歸方程中，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2均達到極顯著水平；根據表7 可知，在10 號菌回歸方程中，一次項C，二次項A2、C2達到極顯著水平。 由此可得，兩個回歸模型擬合度都較好，預測值較為準確，可采用回歸方程計算值模擬試驗結果，進行預測和研究分析。

根據P值的比較結果可以得出，3 個因素對5 號菌酶活力影響程度的順序為:碳源濃度＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間；10 號菌為:培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間＞碳源濃度。 其中兩種菌株的交互作用項中均為AC的P值最小，表示碳源濃度和培養(yǎng)溫度的交互作用對兩種菌株酶活力的影響最顯著。

由響應面試驗法分析得出，5 號菌最佳培養(yǎng)條件為碳源濃度1.73%，培養(yǎng)時間69.96 h，培養(yǎng)溫度37.78 ℃，預測吸光值為2.407；10 號菌最佳培養(yǎng)條件為碳源濃度1.72%，培養(yǎng)時間63.41 h，培養(yǎng)溫度38.91 ℃，預測吸光值為0.186。

2.2.5 響應面分析 根據所擬合的響應面的形狀，分析3 種因素對菌株酶活力的影響。 等高線的形狀呈橢圓形表示兩因素作用顯著，呈圓形則與之相反。 3D 交互圖曲面圖則根據形成的平面坡面陡峭度來判斷顯著性，坡面越陡峭，因素的交互作用顯著，否則與之相反(李佳橋等，2016)。

由圖4～圖6 可知，5 號菌AB 交互作用的等高線近似圓形，交互曲線較為平滑，兩者的交互作用不顯著，而AC、BC 交互作用的等高線雖然都是橢圓，但AC 的交互曲線較為陡峭，因此，AC 兩元素間的交互作用最為顯著。 由圖7 ～ 圖 9 可知，10 號菌 AB、AC、BC 交互作用的等高線都為橢圓，但AC 的3D 交互圖曲面先上升后下降且最為陡峭，因此，AC 兩元素間的交互作用最為顯著。 綜上，碳源濃度(A)和培養(yǎng)溫度(C)的交互作用對5 號菌和10 號菌的酶活力影響最顯著，這與2.2.4 分析結果一致。

圖4 5 號菌碳源濃度、培養(yǎng)時間交互作用對菌株酶活的影響Figure 4 The interaction effects of carbon source concentration and culture time on the enzyme activity of bacteria No.5

圖5 5 號菌碳源濃度、培養(yǎng)溫度交互作用對菌株酶活的影響Figure 5 The interaction effects of carbon source concentration and culture temperature on the enzyme activity of bacteria No.5

圖6 5 號菌培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度交互作用對菌株酶活的影響Figure 6 The interaction effects of culture time and culture temperature on the enzyme activity of bacteria No.5

圖7 10 號菌碳源濃度、培養(yǎng)時間交互作用對菌株酶活的影響Figure 7 The interaction effects of carbon source concentration and culture time on the enzyme activity of bacteria No.10

圖9 10 號菌培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度交互作用對菌株酶活的影響Figure 9 The interaction effects of culture time and culture temperature on the enzyme activity of bacteria No.10

圖8 10 號菌碳源濃度、培養(yǎng)溫度交互作用對菌株酶活的影響Figure 8 The interaction effects of carbon source concentration and culture temperature on the enzyme activity of bacteria No.10

2.3 優(yōu)化條件檢驗

為檢驗響應面分析結果的準確性，根據試驗的操作性和可行性進行進一步的結果檢驗，設計5 號菌在CMC-Na 濃度為 1.73%，培養(yǎng)時間 70.0 h，培養(yǎng)溫度37.8 ℃的條件下進行培養(yǎng)；10號菌在CMC-Na濃度為1.72%，培養(yǎng)時間為63.5 h，培養(yǎng)溫度39.0 ℃的條件下進行培養(yǎng)。 運用回歸方程模擬預測5 號菌在540 nm 處吸光值為2.407，10 號菌為0.186。 而在優(yōu)化條件下培養(yǎng)后，5 號菌實際測得的吸光值為2.389，10 號菌測得的吸光值為0.182(表8)。 由此可知，試驗觀測值與模型預測值較為接近，兩菌株的檢驗結果與預測值相對誤差均小于2.5%。 這表明模型預測性良好，所得經優(yōu)化的菌株最適培養(yǎng)條件穩(wěn)定合理，客觀可行。

表8 優(yōu)化條件檢驗Table 8 The results of the optimum condition test

3 結論與討論

本研究以發(fā)酵半年的廚余垃圾為原材料，運用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基分離純化，并使用剛果紅染色法、CMC-Na 酶活力以及濾紙酶活力檢測進行初篩和復篩，最終成功篩選獲得5 號菌和10 號菌兩株優(yōu)勢纖維素降解菌。

單因素試驗表明，兩菌株的CMC-Na 酶活力都隨著碳源濃度的上升而上升，并在碳源濃度為1.7%時達到最高值，此后開始快速下降。 這可能是因為在碳源濃度過低時，菌株的營養(yǎng)不足，導致菌體生長緩慢或不良；在碳源濃度過高時，雖然菌株的能量、碳源充足，但會使菌體生長過于旺盛，導致發(fā)酵液粘度過大，氧氣供應不足，使得產酶量降低(張粲，2014)。 兩菌株的CMC-Na 酶活力也隨著培養(yǎng)時間的增加而上升，5 號菌培養(yǎng)72 h 時，酶活力達到最高值；10 號菌培養(yǎng)66 h 時，酶活力達到最高值。 此后，兩菌株的酶活力都隨著培養(yǎng)時間的進一步增加而緩慢下降。 這可能是因為菌株的產酶活力會隨著其進入對數生長期而逐漸升高，在進入穩(wěn)定期后，其產酶活力達到峰值。 此后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質不斷被消耗，菌株代謝產物也不斷積累，從而導致菌株生長緩慢甚至死亡，其產酶活力大小也呈現出下降趨勢(張悅等，2018)。 兩菌株的CMC-Na 酶活力同樣隨著培養(yǎng)溫度的升高而升高，5 號菌的培養(yǎng)溫度達到40 ℃時，酶活力達到最高值；10 號菌的培養(yǎng)溫度達到35 ℃時，酶活力達到最高值。 當溫度繼續(xù)升高，兩菌株的酶活力都開始下降。 這可能是因為過低或過高的培養(yǎng)溫度會降低菌株的活力，影響其繁殖效率，從而導致產酶能力下降，酶活力降低(馮?，|等，2013)。

為了進一步優(yōu)化兩菌株的培養(yǎng)條件，根據單因素試驗的結果，又進行了響應面試驗優(yōu)化，所得模型預測性良好，所得到的菌株最適培養(yǎng)條件穩(wěn)定合理，客觀可行。 結果表明，兩種菌株的條件優(yōu)化結果與單因素試驗結果相比較，最適培養(yǎng)時間都縮短了，即菌株的培養(yǎng)條件經優(yōu)化后不僅能得到更高的酶活力，同時還提高了產酶效率。 崔秀秀等(2016)利用此方法優(yōu)化耐冷纖維素降解菌，使其CMCase 酶活較優(yōu)化前提高2.96 倍、楊培新等(2015)利用此方法優(yōu)化分離得到的1 株產纖維素酶真菌，使其發(fā)酵產纖維素酶活性提高了15.02%，也都證明了使用響應面法優(yōu)化菌種培養(yǎng)條件是可行、有效的。

本研究從廚余垃圾中篩選出兩株優(yōu)勢纖維素降解菌，并通過響應面法優(yōu)化了兩菌株的培養(yǎng)條件，使菌株有了更高的產酶效率及酶活力，在降解纖維素應用方面有很好的潛力。