COX-2/PGE2激活JAK/STAT3信號通路調(diào)控人口腔癌KB細胞增殖侵襲和轉(zhuǎn)移

周 濤， 錢 永， 劉韋淞， 鄧 達， 趙方騰， 姜垂廣

(海南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科， 海南 ?？?570312)

口腔上皮癌是世界上第六大最常見的癌癥，其預(yù)后很差，每年有超過50%的病例被診斷為口腔上皮癌[1]。研究發(fā)現(xiàn)口腔上皮癌的侵襲潛能與預(yù)后不良密切相關(guān)[2]。一些研究者已經(jīng)證實深部浸潤前的高惡性分級對口腔上皮癌的頸部區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后具有預(yù)測價值。因此，為了改善口腔上皮癌患者的預(yù)后，必須闡明其潛在的侵襲機制和新的治療策略。近些年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)COX-2在喉部鱗狀細胞癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌等多種癌癥中均有過表達，且生存率低、預(yù)后差[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)COX-2可促進細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。據(jù)報道COX-2可抑制細胞凋亡和免疫反應(yīng)。吲哚美辛通過下調(diào)COX-2抑制人胰腺星狀細胞的增殖和活化[5]。另外，在胃癌和乳腺癌中，COX-2的表達與VEGF-C和淋巴管密切相關(guān)，提示COX-2與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。COX-2介導(dǎo)腫瘤間質(zhì)催乳素信號以啟動腫瘤發(fā)生。但是有關(guān)COX-2具體調(diào)控口腔上皮癌發(fā)展的機制尚不明了。本研究主要通過分析COX-2調(diào)控口腔上皮癌KB細胞增殖、侵襲和EMT的作用機制，進一步闡明COX-2在口腔上皮癌發(fā)展過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1主要材料:人口腔上皮癌組織和癌旁正常組織均來自本醫(yī)院，樣本的采取經(jīng)過了患者和家屬的同意，并保存在-20℃?zhèn)溆?。人口腔上皮癌細?KB細胞)及其人永生化口腔上皮細胞(HIOEC細胞)來自中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶來自購自Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒和SDA-PAGE試劑盒來自上海碧云天生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara；Trizol來自美國Invitrogen公司;塞來昔布(celecoxib)和AH6809來自美國APExBIO公司；E-cadherin、N-cadherin、p-JAK、p-STAT3抗體購自Abcam；DAB顯色試劑盒來自北京中杉金橋生物科技有限公司；COX-2抗體來自Cell Signaling Technology公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染:取KB細胞和HIOEC細胞，用加入10% FBS、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞放在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中生長，待細胞融合度達90%左右時，用0.25%胰酶進行消化和傳代培養(yǎng)。傳代的細胞鋪于細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合達75%時，用Turbofect試劑按照說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染:取長滿后的KB細胞，用0.25%胰酶進行消化，將稀釋后的細胞接種于24孔板中，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，待細胞匯合至75%時。用輔助質(zhì)粒(GAG、REV、VSV-G)和目的基因轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)24 h，去上清，將2 mL Advanced DMEM，40μL血清，40μL L-Glu，20μL 1×chemically defined lipid concentrate，2μL 0.01 mmoL/L膽固醇和2μL 0.01 mmoL/L蛋黃卵磷脂混勻后加入細胞，48 h后收集上清液。將收集的慢病毒和500μL含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基混合，添加到KB細胞中，加入濃度為6μg/mL的聚凝胺，顯微鏡觀察細胞出現(xiàn)綠色熒光，添加終濃度為5μg/mL的嘌呤，觀察細胞發(fā)光數(shù)量達到90%以上，收取細胞系進行檢測。

1.2.3細胞增殖測定:取長滿后的KB穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，用0.25%胰酶進行消化，將稀釋后的KB細胞鋪于96孔板，每孔100μL，96孔板細胞置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞分為處理組和未處理組，皿底細胞觀察為70%～80%時，分別用celecoxib、AH6809或AG490處理細胞，于37℃、飽和濕度和5% CO2培養(yǎng)箱靜置48h，將10μL CCK-8工作液加入細胞中，慢慢晃勻后置于細胞培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)2 h，取出細胞培養(yǎng)板，在酶標儀上讀取各孔細胞在450 nm處的吸光值。

1.2.4細胞侵襲實驗:取長滿后的KB穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，用0.25%胰酶進行消化，將稀釋后的KB細胞鋪于12孔板，觀察密度為70%～80%時，分別用celecoxib、AH6809或AG490處理細胞，長滿后進行消化制成細胞懸液，將100μL融化的Matrigel基質(zhì)加入Transwell上室，上室中加入1×105個的細胞懸液，下室中加入600μL完全DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出小室，加入4%多聚甲醛進行固定，取PBS加入其中進行洗滌，再加入0.1%結(jié)晶紫染色，20min后隨機選取5個視野中的細胞進行觀察和計數(shù)。

1.2.5ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中PGE2表達:將長滿后的KB穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系用0.25%胰酶消化，鋪于96孔板，在常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，皿底細胞觀察為70%～80%時，用celecoxib處理細胞，同時設(shè)置未處理組作為對照，于37℃、飽和濕度和5% CO2培養(yǎng)箱靜置48h，用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中PGE2表達。

1.2.6qRT-PCR:收取分別用celecoxib、AH6809或AG490處理后處于對數(shù)期的KB穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，加入Trizol提取細胞總RNA，在紫外風(fēng)光光度計下讀取RNA濃度和純度，取A260/280值在1.8～2.0范圍內(nèi)的RNA樣品，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄二步法將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Real-Time試劑盒進行qRT-PCR，重復(fù)3個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△Ct法分析結(jié)果。引物見表1。

1.2.7Western blot:收取分別用celecoxib、AH6809或AG490處理后處于對數(shù)期的KB穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，加入裂解液在冰上充分裂解，用BCA試劑盒定量上清蛋白的濃度，每孔取50μg蛋白進行點SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后通過濕轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。加入5%的脫脂奶粉進行過夜封閉，封閉完成后PVDF膜在相應(yīng)的的一抗中過夜孵育，加入TBST清洗5次，再和二抗在室溫條件下孵育2h，加入TBST清洗，清洗干凈后用ECL試劑盒進行蛋白曝光。

表1 引物序列

1.3統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05時，表示差異顯著或極顯著。

2 結(jié) 果

2.1COX-2在口腔上皮癌組織和口腔上皮癌KB細胞中表達上調(diào):由圖1A和1B結(jié)果可知，和癌旁正常組織相比，口腔上皮癌組織中COX-2的基因和蛋白表達量明顯上升(P<0.05)。由圖1C和1D結(jié)果可知，和HIOEC細胞相比，KB細胞中COX-2基因和蛋白表達量明顯升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明COX-2在口腔上皮癌組織和口腔上皮癌KB細胞中表達上調(diào)。

圖1 COX-2在口腔上皮癌組織和口腔上皮癌KB細胞中表達上調(diào)

2.2過表達COX-2促進KB細胞增殖、侵襲和EMT:由圖2A 可知，Lenti-COX-2細胞中COX-2的基因表達量明顯高于Lenti-GFP細胞(P<0.01)。由圖2B-2C可知，Lenti-COX-2細胞中COX-2的蛋白表達量明顯高于Lenti-GFP細胞(P<0.01)，說明過表達COX-2的KB穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建成功。由圖2D -2H結(jié)果可知，和Lenti-GFP細胞相比，Lenti-COX-2細胞增殖能力明顯提高(P<0.05)，細胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。和Lenti-COX-2細胞相比，Lenti-COX-2+celecoxib細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。表明COX-2能夠增強KB細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖2 過表達COX-2促進KB細胞增殖、侵襲和EMT

2.3COX-2上調(diào)KB細胞內(nèi)PGE2表達和激活JAK/STAT3通路:由圖3A-3C 可知，和Lenti-GFP細胞相比，Lenti-COX-2細胞內(nèi)PGE2表達明顯提高(P<0.001)，p-JAK/JAK比值明顯增加(P<0.01)，p-STAT3/STAT3比值明顯上升(P<0.01)，和Lenti-COX-2細胞相比，Lenti-COX-2+celecoxib細胞內(nèi)PGE2表達明顯降低(P<0.001)，p-JAK/JAK比值明顯降低(P<0.01)，p-STAT3/STAT3比值明顯降低(P<0.01)。表明COX-2能夠上調(diào)KB細胞內(nèi)PGE2表達和激活JAK/STAT3通路。

圖3 COX-2上調(diào)KB細胞內(nèi)PGE2表達和激活JAK/STAT3通路

2.4AH6809或AG490作用細胞明顯抑制了KB細胞增殖、侵襲和EMT:由圖4A-4E結(jié)果可知，和Lenti-GFP細胞相比，Lenti-COX-2細胞增殖能力明顯提高(P<0.05)，細胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。和Lenti-COX-2細胞相比，Lenti-COX-2+AH6809細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，Lenti-COX-2+AG490細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。表明AH6809或AG490作用細胞明顯抑制了KB細胞增殖、侵襲和EMT。

圖4 AH6809或AG490作用細胞明顯抑制了KB細胞增殖、侵襲和EMT

3 討 論

口腔上皮癌是世界上最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都在迅速上升，但其預(yù)后仍不理想。然而，口腔癌相關(guān)蛋白和基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚，限制了臨床治療的改進，充分地了解參與惡性行為的蛋白可能有助于改善口腔癌的治療。近些年的研究表明COX-2能夠作為人類疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。如通過抑制COX-2過表達的癌細胞中的delta-5去飽和酶來抑制癌細胞的遷移和侵襲。本研究首先發(fā)現(xiàn)COX-2在口腔癌組織和KB細胞中表達上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致，COX-2在口腔癌KB細胞中作為癌基因發(fā)揮作用。我們建立了COX-2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，進一步研究表明過表達COX-2促進了KB細胞的增殖、侵襲和EMT，而用塞來西布抑制COX-2后，明顯下調(diào)了COX-2對KB細胞增殖、侵襲和EMT的促進作用。研究結(jié)果提示COX-2在口腔癌發(fā)展中具有重要作用，有望成為腫瘤治療的新靶點。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)COX-2上調(diào)KB細胞內(nèi)PGE2表達和激活JAK/STAT3通路。PGE2作為花生四烯酸COX-2的主要催化產(chǎn)物，是COX-2的下游產(chǎn)物，且COX-2/PGE2通路在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。有文獻報道乙型肝炎病毒X蛋白可通過COX-2/PGE2信號通路促進了乙肝相關(guān)性肝細胞癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)PGE2具有4中受體，而其中PTGER2在PGE2參與的腫瘤發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，抑制劑作用PTGER2能夠下調(diào)PGE2對腫瘤發(fā)展的調(diào)控作用。我們研究發(fā)現(xiàn)COX-2能夠上調(diào)KB細胞內(nèi)PGE2表達，塞來西布抑制COX-2表達后，發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)液中PGE2表達量明顯降低。

考慮到COX-2/PGE2軸在腫瘤發(fā)展中的關(guān)鍵作用，我們用AH6809抑制了PGE2受體PTGER2的表達，進一步探討了KB細胞系的生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2對KB細胞增殖、侵襲和EMT的促進作用明顯受到抑制。這些年的研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT3通路在癌癥增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如丹參酮I通過抑制JAK/STAT3信號通路抑制骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移[7]。癌相關(guān)成纖維細胞通過分泌IL-11靶向JAK/STAT3/Bcl2途徑促進胃癌化療耐藥[8]。而且研究表明在肝癌細胞中，COX-2和JAK/STAT通路密切聯(lián)系，抑制COX-2的過度表達可能影響JAK/STAT細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性[9]。此外還發(fā)現(xiàn)小檗堿通過COX-2/PGE2介導(dǎo)的JAK2/STAT3信號通路抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。此外文獻報道在肝細胞癌(HCC)中，TLR4信號促進COX-2/PGE2/STAT3正反饋環(huán)路，參與HCC進展[11]。ATPγS通過/JAK2/STAT3/cpl(2)信號通路誘導(dǎo)A549細胞中COX-2的表達和PGE(2)的產(chǎn)生。考慮到COX-2/PGE2與JAK2/STAT3信號通路在肺癌、直腸癌等癌癥中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，我們猜想在口腔癌KB細胞中，COX-2/PGE2也可能通過JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮作用。因此我們用AG490抑制了KB細胞內(nèi)JAK/STAT3通路，發(fā)現(xiàn)能夠過表達COX-2后，KB細胞的增殖、侵襲和EMT能力明顯下調(diào)。研究結(jié)果表明COX-2/PEGE/JAK-STAT3軸在口腔癌KB細胞發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，值得進一步深入的研究。

綜上所述，該研究表明COX-2在口腔癌KB細胞中高表達，COX-2/PGE2激活JAK/STAT3信號通路促進人口腔癌KB細胞增殖、侵襲和EMT。本研究結(jié)果為口腔癌患者的靶向治療提供了新的研究方向。