無(wú)刺花椒離體培養(yǎng)再生體系的建立

張彩霞

（甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅天水 741020）

花椒屬蕓香科花椒屬落葉小喬木，是我國(guó)主要的香料和油料作物，近年來(lái)種植效益較高，人們種植的積極性也很高［1］。但由于花椒的枝干上均密生皮刺，其采摘困難，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，制約了花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。雖然經(jīng)過(guò)多年的試驗(yàn)，但目前仍然未能找到很好代替人工采摘的機(jī)械或化學(xué)方法，因此，選用和種植無(wú)刺花椒是解決花椒采摘難、采摘成本高這一問(wèn)題的主要途徑［2］。

目前，我國(guó)無(wú)刺花椒品種資源較為豐富，有從日本引進(jìn)的葡萄山椒、朝倉(cāng)花椒，我國(guó)自己培育出的隴南無(wú)刺椒、農(nóng)城1 號(hào)、漢源無(wú)刺花椒等［3］。這些無(wú)刺花椒品種利用實(shí)生繁殖常會(huì)發(fā)生無(wú)刺性狀變異的現(xiàn)象［4］，因此目前普遍采用無(wú)性繁殖。植物組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)無(wú)性繁殖技術(shù)相比，能保持品種的優(yōu)良性狀，并且繁殖速度快、效率高，因此通過(guò)離體培養(yǎng)在短期內(nèi)獲得性狀穩(wěn)定的大量?jī)?yōu)良無(wú)刺花椒種苗，是促進(jìn)無(wú)刺花椒發(fā)展的有效途徑［5-6］。以隴南無(wú)刺花椒嫩葉為材料，研究了不同消毒劑種類和不同消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響和不同配方的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率及芽分化率的影響，建立了初代離體再生體系，以期為無(wú)刺花椒種苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

隴南無(wú)刺花椒，采集于甘肅省武都區(qū)，選擇具有典型性狀、無(wú)病蟲害的健壯無(wú)刺花椒植株，剪取當(dāng)年生新梢，選取幼嫩葉片為外植體材料。試驗(yàn)于甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院林木組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理

將選取的嫩枝剪下葉片，沿中脈將葉片剪成 1～2 cm2的小塊，置于燒杯中流水沖洗60 min，然后將材料于70%的酒精中浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3～4 次，再分別用0.1% HgCl2和2% NaClO 進(jìn)行消毒處理（0.1% HgCl2處理時(shí)間分別為3 min、6 min、8 min，2% NaClO處理時(shí)間分別為8 min、12 min、15 min）。最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，然后將消毒好的嫩葉切成0.5 cm2的小塊，接種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種10～15 d 后觀察污染、死亡及啟動(dòng)情況：有菌斑出現(xiàn)，即統(tǒng)計(jì)為污染，按瓶數(shù)計(jì)算；外植體保持新鮮，沒(méi)有出現(xiàn)變黑死亡，且10 d 后葉片周圍切口出現(xiàn)膨大腫脹，說(shuō)明成活，成活率按照成活外植體數(shù)占接種葉片總塊數(shù)的百分比來(lái)計(jì)算。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加蔗糖 30 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，將pH 值調(diào)至5.8～6.0。誘導(dǎo)外植體材料產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+2,4-D（0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1），共9 個(gè)處理，每個(gè)處理20 瓶，3 次重復(fù)。15 d 后統(tǒng)計(jì)不同植物激素濃度配比下無(wú)刺花椒愈傷組織誘導(dǎo)率，用產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)量占培養(yǎng)外植體總數(shù)量的百分比表示。設(shè)置培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

1.2.3 芽誘導(dǎo)

誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織后，選擇生長(zhǎng)良好的愈傷組織，將其分離，轉(zhuǎn)接于不同激素配比的培養(yǎng)基中，配方為MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+NAA（0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1），誘導(dǎo)愈傷組織再分化產(chǎn)生不定芽，統(tǒng)計(jì)芽分化率及芽生長(zhǎng)狀況，用誘導(dǎo)產(chǎn)生芽的愈傷組織數(shù)占培養(yǎng)的總愈傷組織的百分比來(lái)表示。共9 個(gè)處理，每處理接種20 瓶，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)外植體消毒效果的影響

外植體消毒接種10 d 后開始觀察統(tǒng)計(jì)污染情況及外植體存活率，發(fā)現(xiàn)各處理均有不同程度的污染，污染類型多為白色、灰色霉菌污染及黏液狀白色細(xì)菌污染，菌落主要在外植體邊緣的培養(yǎng)基上，隨著時(shí)間的推移菌斑會(huì)向外擴(kuò)散，污染嚴(yán)重的會(huì)長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，說(shuō)明污染是由于外植體消毒不徹底造成的。2 種不同消毒劑消毒效果見(jiàn)表1。從表1 可以看出，0.1% HgCl2在3種不同消毒時(shí)間處理下污染率平均較2% NaClO 處理的低，成活率總體也較2% NaClO 處理的低，而且隨著2% NaClO 消毒時(shí)間延長(zhǎng)，外植體成活率沒(méi)有降低。在使用0.1% HgCl2消毒的3 個(gè)處理中，消毒6 min 污染率較低，為18.3%，而外植體成活率較其他2 個(gè)處理要高，為55.3%；在使用2% NaClO 消毒的3 個(gè)處理中，消毒15 min 污染率較低，為13.3%，外植體成活率最高，為62.8%。說(shuō)明隴南無(wú)刺花椒嫩葉采用70%酒精處理30 s后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，或者用2% NaClO 消毒15 min 均能達(dá)到較好的消毒效果且能保證較高的外 植體成活率。

表1 不同消毒處理的消毒效果

2.2 不同激素濃度配比對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織的試驗(yàn)中，共9 個(gè)處理，激素配比組合如表2 所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中添加6-BA 和2,4-D 濃度較低時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率較低，觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織生長(zhǎng)也較為緩慢，但愈傷組織的質(zhì)地較好，松散且顏色呈淡黃綠色。隨著培養(yǎng)基中6-BA和2,4-D 的濃度升高，愈傷組織誘導(dǎo)率有較大的提高，當(dāng)6-BA 濃度為1.0 mg·L-1、2,4-D 濃度為0.3 mg·L-1和0.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，分別為65.9%和60.6%。但當(dāng)6-BA 濃度繼續(xù)增加，愈傷組織誘導(dǎo)率開始降低，且愈傷組織質(zhì)地致密；當(dāng)在培養(yǎng)基中添加相同濃度的6-BA 時(shí)，隨著2,4-D 濃度增大，愈傷組織誘導(dǎo)率會(huì)提高，但增加到0.5 mg·L-1時(shí)又呈下降趨勢(shì)，而且部分愈傷組織出現(xiàn)褐化。從表2 中可以看出，培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為65.9%，誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、色澤鮮艷，增殖能力強(qiáng)。

表2 不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同激素濃度配比對(duì)芽分化率的影響

初代培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，之后將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)入添加了不同濃度的6-BA 和NAA 的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行分化誘導(dǎo)，統(tǒng)計(jì)不定芽分化率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可以看出，不同濃度6-BA 與NAA 組合，對(duì)無(wú)刺花椒愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽有顯著的影響，隨著6-BA 濃度的提高，芽分化率有所提高，但濃度過(guò)高會(huì)反而會(huì)抑制芽的分化，且隨著6-BA 濃度的提高芽分化的數(shù)量增加，但由于芽的密度過(guò)大導(dǎo)致芽生長(zhǎng)細(xì)弱、顏色發(fā)黃。因此適宜的濃度配比才能同時(shí)保證較高的芽分化率和芽質(zhì)量。在9 個(gè)濃度配比中，當(dāng)6-BA 濃度為 1.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.3 mg·L-1時(shí)，芽分化率最高，為82.6%，并且不定芽粗壯顏色深，生長(zhǎng)良好，其次是6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，芽分化率較高，為80.7%。因此篩選出誘導(dǎo)無(wú)刺花椒不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。

表3 不同激素配比對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

在離體培養(yǎng)過(guò)程中，外植體的消毒是影響培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子之一，而消毒劑的選擇和消毒時(shí)間的把控是外植體消毒的關(guān)鍵。通過(guò)2 種不同的消毒劑對(duì)無(wú)刺花椒嫩葉進(jìn)行消毒處理，發(fā)現(xiàn)用70%酒精處理30 s 后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，和 用2% NaClO 消毒15 min 均能達(dá)到較好的消毒效果且能保證較高的外植體成活率。HgCl2是消毒作用強(qiáng)且常用的一種消毒劑，但其對(duì)人體有一定危害，且容易殘留在外植體材料中不容易清除［7］，對(duì)外植體材料的生活力損害較大，試驗(yàn)結(jié)果也表明隨著HgCl2消毒時(shí)間增加，外植體的成活率會(huì)下降。而2% NaClO 隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)外植體成活率無(wú)明顯下降，且對(duì)人體安全無(wú)毒，因此在生產(chǎn)和科研中可以利用NaClO替代HgCl2作為常用的消毒劑。

誘導(dǎo)外植體材料產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的愈傷組織是無(wú)刺花椒離體培養(yǎng)建立再生體系、進(jìn)而產(chǎn)生完整試管苗的基礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)的重要階段。選用MS 基本培養(yǎng)基加入1.0 mg·L-16-BA 和0.3 mg·L-12,4-D，對(duì)隴南無(wú)刺花椒愈傷組織誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、色澤鮮艷，增殖能力強(qiáng)。初代培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生的愈傷組織，選擇生長(zhǎng)良好的將其轉(zhuǎn)入添加不同濃度的6-BA 和NAA 的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽的分化，結(jié)果表明，誘導(dǎo)無(wú)刺花椒不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1，試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)刺花椒試管苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

目前有關(guān)無(wú)刺花椒組織培養(yǎng)的研究較少。以隴南無(wú)刺花椒嫩葉作為外植體，獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化率，篩選出無(wú)刺花椒初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，建立了無(wú)菌再生體系。未來(lái)在初代培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上，還要進(jìn)一步研究繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)技術(shù)，建立穩(wěn)定的離體快繁技術(shù)體系，擴(kuò)大規(guī)模，形成生產(chǎn)化模式，為無(wú)刺花椒良種繁育提供技術(shù)支撐。