南瓜栽培品種的SSR分子標(biāo)記分析及農(nóng)藝性狀多樣性研究

黃凱美 鄒宜靜 施楊琪 應(yīng)逸寧 顏韶兵 包勁松,,*

(1 杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,浙江 杭州 310017；2 浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用生物科學(xué)系,浙江 杭州 310058；3 浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,浙江 杭州 310058)

南瓜屬(Cucurbita，2n=2x=40)是葫蘆科植物中果實(shí)性狀最具多態(tài)性的屬，共包括30余種，其中中國南瓜(C.moschatoDuch)、美洲南瓜(C.pepoL.)、印度南瓜(C.maximaDuch)是主要栽培種[1-2]。目前，我國是世界上最大的南瓜消費(fèi)國和生產(chǎn)國[2]，但南瓜作為一個(gè)小種類的蔬菜，遺傳與育種研究仍較為缺乏[3]。因此，開展關(guān)于南瓜品質(zhì)和產(chǎn)量方面的研究對(duì)南瓜品種改良具有重要意義。

我國南瓜種質(zhì)資源豐富，為南瓜育種工作的開展提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。20世紀(jì)90年代后期，一些科研單位以地方品種蜜本南瓜為主要親本，開展了中國南瓜的育種工作[3]。印度南瓜的引進(jìn)也促進(jìn)了我國印度南瓜的育種研究，在新品種培育方面取得了一些重要進(jìn)展[4]。但是由于不同地區(qū)間頻繁引種及自繁自育，導(dǎo)致現(xiàn)有南瓜品種間品系交錯(cuò)、親緣關(guān)系混雜，“同名異物”與“同物異名”現(xiàn)象屢見不鮮[5-6]。隨著地方品種收集工作的有效開展，發(fā)現(xiàn)眾多地方品種與育成品種間的親緣關(guān)系尚缺乏研究[7]。

簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat,SSR)標(biāo)記，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記[8]，是一種由幾個(gè)核苷酸(一般小于6個(gè))為重復(fù)單位形成的分子標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有出現(xiàn)頻率高、多態(tài)性豐富、檢測手段簡單、檢測結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析、品種鑒定等研究領(lǐng)域[9-10]。隨著南瓜基因組信息的測定和公開，大量SSR標(biāo)記被開發(fā)并應(yīng)用于南瓜品種的遺傳多樣性研究。王洋洋等[11]對(duì)印度南瓜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，共檢測到12 557個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于131 960條基因中；隨后選取20對(duì)引物分析30份南瓜材料的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)14對(duì)引物可擴(kuò)增出產(chǎn)物，11對(duì)引物具有多態(tài)性。朱海生等對(duì)美洲南瓜[12]和中國南瓜[13]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，分別檢測到7 478和5 407個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于5 786和4 348條基因中，并選取部分引物剖析了美洲南瓜和中國南瓜的遺傳多樣性。武向斌[14]從南瓜、西瓜、黃瓜、甜瓜、苦瓜、絲瓜、冬瓜基因組中開發(fā)出種間SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)96對(duì)引物中有87對(duì)在葫蘆科的7個(gè)種中具有良好的通用性。

本研究采用SSR標(biāo)記分析35份南瓜品種的遺傳多樣性，特別是浙江地方品種十姐妹南瓜、上海地方品種黃狼南瓜、廣東地方品種密本南瓜與其他育成品種間的遺傳關(guān)系，以期揭示南瓜品種間的遺傳差異及親緣關(guān)系，為南瓜的新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的35份南瓜品種來自湖南、北京、浙江、廣東、上海、山東、安徽、河北、遼寧9個(gè)省市，包含印度南瓜、中國南瓜、美洲南瓜3個(gè)主要栽培種(表1)。所有供試材料于2020年8月10日在杭州臨安區(qū)板橋鎮(zhèn)杭州錦興農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司基地種植，常規(guī)水肥管理。于2020年秋季收獲成熟期果實(shí)。

表1 試驗(yàn)所用南瓜品種及其主要農(nóng)藝性狀Table 1 The major agronomic traits of squash accessions used in this study

表1(續(xù))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 性狀調(diào)查 分別在營養(yǎng)生長期和開花期開展農(nóng)藝性狀調(diào)查，每個(gè)品種隨機(jī)取10株進(jìn)行測量，同時(shí)記錄開花較早或較遲、抗病性好的品種。成熟期每個(gè)品種隨機(jī)收取10個(gè)果實(shí)考查果實(shí)性狀。性狀調(diào)查參照《南瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[15]，數(shù)量性狀用平均值表示(表1)。

1.2.2 DNA提取 采用改良的CTAB法[16]提取南瓜葉片的基因組DNA：裁剪南瓜葉片約0.5 g，洗凈后保存在-20℃冰箱中備用。加入適量液氮將葉片研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中。離心管中加入600 μL預(yù)熱至65℃、濃度為20 g·kg-1的CTAB提取緩沖液，旋渦振蕩混勻。將離心管置于65℃水浴鍋提取30 min，期間每隔10 min輕輕搖晃離心管，使之充分混勻；取出離心管冷卻2 min后，12 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中，加入600 μL氯仿，輕輕搖勻；12 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至含有乙醇的離心管中，將離心管上下顛倒混合均勻，此時(shí)有絮狀DNA產(chǎn)生；12 000 r·min-1離心5 min，小心棄去上清液，保留底部DNA沉淀，加入無菌水使DNA溶解后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR與電泳 SSR引物序列見表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR采用10 μL反應(yīng)體系，由5 μL 2×PCR Mix、1 μL DNA模版(100 ng)、0.5 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL及3 μL雙蒸水組成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物在100 g·kg-1的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，緩沖液為0.5×TBE，恒壓120 Ⅴ，電泳時(shí)間視產(chǎn)物片段大小決定。取出凝膠后用蒸餾水清洗2遍，在1.0 g·kg-1的硝酸銀溶液中染色5～7 min，用蒸餾水再次清洗2遍，用8.0 g·kg-1甲醛-10 g·kg-1氫氧化鈉溶液顯色5～7 min，蒸餾水清洗2遍后取出，掃描結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各樣本的基因型。使用Powermarker V3.25[17]分析數(shù)據(jù)，利用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group average method with arithmetic mean，UPMGA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記檢測

利用43對(duì)SSR標(biāo)記(表2)分析35份南瓜品種材料的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，每對(duì)引物在35份樣品間都能夠擴(kuò)增出多態(tài)性條帶(表3)。43對(duì)SSR引物共檢測到155個(gè)等位基因，每個(gè)標(biāo)記所檢測到的等位基因數(shù)為2～7個(gè)，平均為3.6個(gè)；主要等位基因頻率為0.308 8～0.928 6，平均為0.550 1。檢測到177個(gè)基因型，每對(duì)引物所檢測到的基因型為2～7個(gè)，平均為4.1個(gè)。43對(duì)引物基因型雜合度在0～0.823 5之間，平均值為0.199 2。SSR標(biāo)記的多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)值在0.130 8～0.775 4之間，平均值為0.487 2?；蚨鄻有栽?.135 2～0.802 3之間，平均值為0.551 7。

表2 43對(duì)SSR引物序列Table 2 The primer sequences of 43 SSR markers

表2(續(xù))

試驗(yàn)結(jié)果表明，所有SSR標(biāo)記在35份南瓜品種間均具有較好的基因多樣性和較高的遺傳雜合性，但在區(qū)分不同類型南瓜品種間有所差別。例如，標(biāo)記S78、n15不能區(qū)分品種PM01～PM12、PM14(圖1-A、B)；標(biāo)記S78和S17不能區(qū)分品種PM15～PM17、PM19～PM29(圖1-A、D)；圖中所示4個(gè)標(biāo)記都無法將品種PM34～PM37區(qū)分開，說明所列舉的分子標(biāo)記在上述種內(nèi)品種間沒有多態(tài)性，但是在不同種間存在多態(tài)性，即存在南瓜的種間特異性。目前，在本研究中未發(fā)現(xiàn)對(duì)全部供試品種均具有多態(tài)性的通用SSR分子標(biāo)記。

注：引物分別為：A：S78；B：n15；C：S190；D：S17。Note:SSR markers:A:S78.B:n15.C:S190.D:S17.圖1 35份南瓜材料PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis images of 35 squash accessions with SSR markers

2.2 聚類分析

利用UPGMA聚類方法將43對(duì)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，以確定35份供試南瓜品種間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，35份品種可以分為三大類，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(圖2)。與表1中各樣品對(duì)應(yīng)的南瓜品種對(duì)應(yīng)，第Ⅰ類包含13個(gè)品種(PM01～PM12、PM14)，均為中國南瓜；第Ⅲ類包含5個(gè)品種(PM29～PM33)，為美洲南瓜；第Ⅱ類包含17個(gè)品種(PM15～PM17、PM19～PM28、PM34～PM37)，為印度南瓜。第Ⅰ類中，PM10與其他幾個(gè)品種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，SSR標(biāo)記無法區(qū)分PM01和PM02。第Ⅱ類分為3個(gè)亞群，其中PM34～PM37與其他品種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，PM26～PM28與其他品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。第Ⅲ類中PM31與PM33親緣關(guān)系較近，PM29、PM30、PM32親緣關(guān)系較近，為2個(gè)亞群。浙江省著名地方品種十姐妹南瓜(PM08)為中國南瓜，與PM04、PM06、PM07和PM11親緣關(guān)系較近。上海著名地方品種黃狼南瓜(PM12)為中國南瓜，與PM03親緣關(guān)系較近，與PM08親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。廣東省著名地方品種密本南瓜PM09是南瓜育種的重要材料，與廣東的香芋南瓜PM14親緣關(guān)系最近。

圖2 基于SSR標(biāo)記的35份南瓜品種聚類分析Fig.2 Cluster tree of 35 squash accessions based on SSR markers

2.3 南瓜農(nóng)藝性狀及果實(shí)性狀

第Ⅰ類(中國南瓜，PM01～PM12、PM14)都為蔓生，多在主蔓結(jié)瓜，PM09、PM12和PM14在側(cè)蔓結(jié)瓜。葉片多為掌狀，PM06、PM09和PM11為心臟五角狀，PM14為近圓形。莖都為五棱形。雌花萼片上部擴(kuò)大成葉狀。果實(shí)形狀多樣，以梨形略多。果皮為深綠色或墨綠色，PM03、PM09、PM14披有不規(guī)則花紋。瓜面平滑，瓜肉色淡黃。果肉厚0.70～1.75 cm。以嫩果或老熟果供食用，嫩果采收時(shí)果重差異明顯，果重為393.5(PM07)～783.0 g(PM10)。品質(zhì)性狀中口感大多為脆，肉質(zhì)松軟和致密都較為常見。

第Ⅱ類南瓜(印度南瓜，PM15～PM17、PM19～PM28、PM34～PM37)包含的品種較多，整體性狀多樣，形態(tài)豐富，異質(zhì)化程度高。所有品種都為蔓生，始花節(jié)位最高為34節(jié)，最低為13節(jié)。大多為主蔓結(jié)瓜，PM15～PM17為側(cè)蔓結(jié)瓜。葉形以掌狀為主，莖為近圓形。果實(shí)形狀多樣，其中扁圓形較為常見。瓜皮底色有灰綠色、綠色、深綠色、黑綠色、白色等，明顯或隱約有深綠色、淺綠色、灰綠色等斑紋。瓜面平滑，瓜肉色淡黃到黃色。果實(shí)體積不等，單果重203.5～1 306.0 g。質(zhì)地以致密較多，口感多樣，以粉、面為主。

第Ⅲ類南瓜(美洲南瓜，PM29～PM33)為蔓生或矮生，始花節(jié)位多在12節(jié)或13節(jié)，且多在主蔓結(jié)瓜。葉形為近三角形，莖有棱或溝，瓜形大多為扁圓形。瓜皮顏色多樣性豐富，有白色、淡黃白色、淺綠、淺黃色或黃橙色帶縱條紋。瓜面平滑或多棱，果肉較厚，色白至淡黃。果實(shí)體積不等，PM29～PM31呈扁圓型果型小，單果重270.0～353.0 g，PM32、PM33分別呈橢圓形和圓筒形，單果重505.5～791.0 g。肉質(zhì)致密、松軟，口感面、脆、粉均有。另外，PM29～PM31兼有觀賞價(jià)值。

3 討論

南瓜表型的多樣性使其能適應(yīng)各種各樣的自然環(huán)境，從而在不同條件下進(jìn)行種植，滿足食用、藥用、籽用、觀賞等栽培目的，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3,15]。因此，了解南瓜表型多樣性的遺傳信息對(duì)推進(jìn)南瓜育種工作具有重要的意義。本試驗(yàn)詳細(xì)調(diào)查了不同南瓜栽培品種間農(nóng)藝性狀的差異，發(fā)現(xiàn)不同類群間在葉形、果形及果實(shí)質(zhì)地等方面具有共同特點(diǎn)，為今后的育種工作提供了良好的研究基礎(chǔ)。在三大類中，每一類型都分別含有大果品種和小果品種，說明不同種之間及種內(nèi)的不同品種之間都表現(xiàn)出了果實(shí)形狀及大小的多樣性。第Ⅰ類南瓜中，PM02、PM05、PM09長勢較好，PM03、PM07、PM10和PM11是早熟品種，PM02和PM05抗白粉病較強(qiáng)，可作為選育高產(chǎn)早熟高抗品種的親本。第Ⅱ類南瓜中，PM27和PM28結(jié)瓜較多，PM21、PM24和PM25綜合性狀優(yōu)良，可以作為群體品種參與育種。第Ⅲ類南瓜中，PM32、PM33和PM37節(jié)間短，可以作為親本育成矮化、耐肥品種。不同類型農(nóng)藝性狀的多樣性有助于開展種間雜交，從而可以將不同種的優(yōu)異性狀結(jié)合起來，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的南瓜新品種。如，將第Ⅰ類中的著名地方品種密本南瓜(PM09)與第Ⅲ類中節(jié)間短的品種PM32或PM33雜交，有望選育出矮化高產(chǎn)的新品種。

除了表型遺傳多樣性，DNA分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性和植物親緣關(guān)系鑒別研究。簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記自1994年[8]建立以來，因其多態(tài)性良好、分辨率高、遺傳信息量豐富、數(shù)量多、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛利用，目前已經(jīng)成為應(yīng)用最廣泛且最重要的遺傳標(biāo)記之一，應(yīng)用于指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、分子輔助選擇育種、遺傳多樣性分析和品種純度鑒定等相關(guān)研究。本研究利用43對(duì)SSR引物，對(duì)35份樣品進(jìn)行PCR檢測，共檢測到155個(gè)等位基因，平均每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)能檢測到3.6個(gè)等位基因，每個(gè)標(biāo)記所檢測到的等位基因數(shù)為2～7個(gè)，PIC為0.130 8～0.775 4，平均值0.487 2。武向斌[14]利用66對(duì)SSR引物對(duì)61份美洲南瓜樣本DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)平均每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)能檢測4.2個(gè)等位基因，PIC平均值為0.43。朱海生等[13]利用30對(duì)SSR引物對(duì)30份中國南瓜樣本開展遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物檢測到的等位基因?yàn)?～5個(gè)，平均值為2.11個(gè)。周秦等[18]利用26對(duì)SSR引物對(duì)26份南瓜核心種質(zhì)資源進(jìn)行了擴(kuò)增及多態(tài)性評(píng)價(jià)，每對(duì)引物檢測到的等位基因數(shù)目為1～12個(gè)，平均值為4.5個(gè)，PIC平均值為0.460。王迎兒等[22]利用26對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)41份均來源于浙江省內(nèi)的南瓜種質(zhì)資源材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，平均每對(duì)引物檢測到5.4個(gè)等位基因，PIC平均值為0.58。王瑞等[20]利用150對(duì)引物對(duì)24份由廣東省農(nóng)科院采集的南瓜種質(zhì)資源樣本進(jìn)行擴(kuò)增，平均每對(duì)引物檢測到4.8個(gè)等位基因。與之前的試驗(yàn)相比，本試驗(yàn)所選用的SSR標(biāo)記具有良好的多態(tài)性，標(biāo)記的平均等位基因數(shù)比王迎兒等[22]的研究結(jié)果稍少；與武向斌[14]的研究類似，本研究在一定程度上展示了南瓜種質(zhì)資源的豐富性和差異性。結(jié)合基因型和表型的數(shù)據(jù)，可以通過關(guān)聯(lián)分析找到與這些農(nóng)藝與果實(shí)性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記[23]。但是，開展關(guān)聯(lián)分析相關(guān)研究需要更多的南瓜品種并發(fā)掘更多的分子標(biāo)記。

利用UPGMA方法對(duì)35份材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示南瓜材料可明顯分為三大類，對(duì)應(yīng)中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜3個(gè)種。與周秦等[18]、王迎兒等[22]發(fā)現(xiàn)利用SSR標(biāo)記可以區(qū)分不同種南瓜的研究結(jié)果一致。從聚類圖可以看出，印度南瓜與美洲南瓜親緣關(guān)系較近，這與盧麗芳等[24]、李俊麗等[25]、李海真等[26]、張?zhí)烀鞯萚27]利用其他分子標(biāo)記的研究結(jié)果不一致，即上述研究中認(rèn)為中國南瓜與美洲南瓜親緣關(guān)系較近。這種差異可能是由于本研究供試品種中的美洲南瓜數(shù)量較少，代表性差，美洲南瓜根據(jù)表型可分為很多類型[28]，而本研究只收集到以觀賞類型為主的5個(gè)品種。分析研究所用的分子標(biāo)記系統(tǒng)可以發(fā)現(xiàn)，前人分析中都使用了顯性標(biāo)記[24-27]，而本研究中的SSR為共顯性標(biāo)記，即因分子標(biāo)記類型不同，可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果。以往研究還發(fā)現(xiàn)在相同栽培種的不同品種間，可進(jìn)一步分為不同的類群，例如朱海生等[13]將30份中國南瓜樣本分為兩類：第一類包括22份材料，瓜形多為盤形、近圓形、橢圓形和扁圓形；第二類包括8份材料，瓜形多為長筒形或長頸圓筒形，其分類主要與果實(shí)的性狀相關(guān)。王瑞等[20]也發(fā)現(xiàn)可將中國南瓜分為兩類，第一類果實(shí)形狀多為棒槌形，第二類多為扁圓形。武向斌[14]將61份美洲南瓜種質(zhì)分為含有5份野生種質(zhì)的類別Ⅰ和含有56份栽培種質(zhì)的類別Ⅱ，其分類主要與是否為栽培種相關(guān)。本研究的品種聚類分析也表明，在第Ⅰ類和第Ⅱ類南瓜中，還可繼續(xù)分為三類。綜上可知，利用SSR標(biāo)記可以區(qū)分不同種的南瓜，而且同一種內(nèi)中，可以進(jìn)一步區(qū)分出不同類群。

需要指出的是，雖然利用SSR標(biāo)記很容易將不同南瓜類型區(qū)分開，但同一類型的不同南瓜品種很難相互區(qū)分，例如PM01和PM02的品種聚類分析。SSR標(biāo)記檢測的電泳結(jié)果同時(shí)體現(xiàn)了SSR存在種間的特異性，即同種內(nèi)多態(tài)性小，不同種間多態(tài)性大，說明本研究采用的SSR標(biāo)記在不同種間的通用性差。但這有利于不同類型南瓜間開展種間的雜交育種、標(biāo)記輔助育種以及遺傳圖譜的構(gòu)建。因此，為了更好地從分子水平區(qū)分同一種內(nèi)的南瓜品種，需要采用通用性更好的SSR標(biāo)記。為了南瓜種質(zhì)資源的保護(hù)和分子育種的開展，后續(xù)研究可以利用通用性好的SSR標(biāo)記建立南瓜品種的指紋圖譜，以便開展特定南瓜品種的鑒定工作。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用43個(gè)簡單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記，將35份南瓜栽培品種進(jìn)行了分子層面的遺傳多樣性分析，通過聚類分析將其劃分為中國南瓜(13份)、印度南瓜(17份)和美洲南瓜(5份)共3種栽培類型，與實(shí)際栽培種的劃分相符。同時(shí)，本試驗(yàn)調(diào)查了不同南瓜品種的農(nóng)藝性狀和果實(shí)性狀，發(fā)現(xiàn)不同種品種的農(nóng)藝性狀與果實(shí)性狀差別明顯，每個(gè)種內(nèi)部分品種農(nóng)藝性狀較好，可以作為雜交育種的親本。由于許多SSR標(biāo)記具有種間特異性，開展南瓜種間雜交育種時(shí)，這些標(biāo)記適合應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇。本研究結(jié)果為國內(nèi)南瓜栽培品種遺傳結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究，以及開展種間雜交分子育種的研究提供了理論依據(jù)。