甘肅玉米鐮孢莖腐病病原菌種群多樣性分析

郭 成 王寶寶 王春明 張小杰 陳曉霞 周天旺 李敏權(quán),2,* 段燦星

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3 石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北 石家莊 050041；4 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；5 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

玉米(ZeamaysL.)在許多國家是重要的糧、飼、經(jīng)兼用型作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著重要地位。然而病蟲害是制約玉米高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要原因，我國玉米每年都會因病蟲害導(dǎo)致減產(chǎn)大約1 000 萬噸[1]。近年來，一種世界性的土傳真菌性病害玉米莖腐病在黃淮海[2-5]、東北[6]、西南[7]和西北[8]等玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和危害。自2011年起，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所禾谷類病害研究室玉米病害課題組連續(xù)7年對甘肅玉米莖腐病進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害在甘肅四大生態(tài)區(qū)(隴東地區(qū)、隴南地區(qū)、隴中地區(qū)和河西走廊)普遍發(fā)生且呈加重態(tài)勢[8]。普通年份玉米莖腐病的田間病株率為5%～10%，嚴(yán)重發(fā)生年份為20%～30%，部分高感品種在40%以上，甚至高達(dá)100%[9]。同時，隨著機械化水平的提高，籽粒直收成為玉米新的收獲方向，莖腐病已成為嚴(yán)重阻礙玉米產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。因此，該病害在國家玉米品種審定中被列為一票否決病害，也凸顯出其重要性。

玉米莖腐病的致病菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量比較復(fù)雜，多達(dá)30余種，根據(jù)致病菌在屬一級層面上的分類地位，可歸納成8種主要類型[8]。鐮孢屬(Fusarium)和腐霉屬(Pythium)真菌為我國玉米莖腐病的兩大主要致病菌，前者以禾谷鐮孢(F.graminearum)、后者以腫囊腐霉(P.inflatum)為優(yōu)勢菌[10-11]，兩者均有占比高、分布廣的特點。生態(tài)氣候類型和耕作栽培模式不同，玉米莖腐病的病原菌種類呈現(xiàn)不同，劉樹森等[2]以河北、河南和山東玉米莖腐病為研究對象，發(fā)現(xiàn)黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)莖腐病的病原鐮孢菌高達(dá)11種，包括擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)、層出鐮孢(F.proliferatum)、禾谷鐮孢復(fù)合種(F.graminearumspecies complex, FGSC)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)、黃色鐮孢(F.culmorum)、厚垣鐮孢(F.chlamydosporum)、變紅鐮孢(F.incarnatum)、木賊鐮孢(F.equiseti)、膠孢鐮孢(F.subglutinans)、藤倉鐮孢(F.fujikuroi)和茄病鐮孢(F.solani)，其中前3個為主要鐮孢菌。許大鳳等[3]研究發(fā)現(xiàn)安徽省鳳陽縣玉米莖腐病的病原菌有禾谷鐮孢、擬輪枝鐮孢、尖孢鐮孢、層出鐮孢和木賊鐮孢。賀娟等[7]依據(jù)形態(tài)特征和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列分析得出云南玉米莖腐病的致病菌種群由禾谷鐮孢、擬輪枝鐮孢、藤倉鐮孢、變紅鐮孢、尖孢鐮孢、層出鐮孢、集群鐮孢(F.commune)、厚垣鐮孢和芳香鐮孢(F.redolens)組成。

甘肅省目前尚缺乏對玉米鐮孢莖腐病病原菌種群結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究，本研究通過采集甘肅省玉米莖腐病樣品，對病原菌進(jìn)行分離、鑒定和致病性測定，以期掌握甘肅省玉米鐮孢莖腐病致病菌的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，為該病害的綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玉米莖基腐病分布范圍調(diào)查和樣品收集

于2015年9月和2017年9月在甘肅省10市(州)26縣(區(qū))采集到有明顯發(fā)病癥狀的玉米莖腐病樣品42份，采集地點見表1。

表1 玉米莖腐病樣品采集地Table 1 Samples collection of maize stalk rot

1.2 樣品分離和純化

在樣品病健交界處，用剪刀剪取約0.2 cm×0.5 cm大小的玉米莖稈及維管束組織，參考文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行分離、培養(yǎng)和純化。

1.3 鐮孢菌的單孢分離

參考文獻(xiàn)[12]通過稀釋法進(jìn)行單孢分離，將分離物的孢子轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基和康乃馨瓊脂(carnation leaf-piece agar，CLA)培養(yǎng)基平板上，25℃下光暗交替培養(yǎng)10～30 d。

1.4 鐮孢菌的種類鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行鐮孢菌的形態(tài)學(xué)比對和鑒定。

將所有鐮孢菌菌株歸類，利用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司一站式 DNA/RNA/蛋白提取試劑盒(B618003-0050)提取基因組DNA。鐮孢菌種類通過特異性引物EF-1α[15]進(jìn)行鑒別，TEF-F:5′-A T G G G T A A G G A R G A C A A G A C-3′；TEF-R:5′-G G A R G T A C C A G T S A T C A T G T T-3′，以25 μL反應(yīng)體系[16]進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司北京分公司進(jìn)行測序。

1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將EF-1α基因序列結(jié)果測序結(jié)果與GenBank中已登錄的鐮孢菌序列進(jìn)行Blast比對，除尖孢鐮孢僅1株外，其他種各選取2個菌株為代表，利用Megalign7.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株致病性測定

將滅菌后的蛭石裝入直徑10 cm×10 cm的花盆，每個花盆接種病原菌繁殖體10 g，病原菌的繁殖參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[17]。玉米品種選用甘宇301，為甘肅極早熟春玉米類型區(qū)的種植品種，高感莖腐病。先用75%酒精將甘宇301玉米種子表面消毒5 min，再經(jīng)過溫湯浸種處理，待出芽后播種在上述花盆，每種鐮孢菌處理重復(fù)4次。材料置于常溫條件下進(jìn)行管理，需水時定量澆滅菌水，出苗后第20天記載發(fā)病情況，玉米幼苗胚根變褐，出現(xiàn)腐爛狀或致死不發(fā)芽，即為發(fā)病株[18]，計算發(fā)病株率。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮孢菌種類及地域分布

本研究共獲得253個鐮孢菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定出共10個種(圖1)，其中禾谷鐮孢菌復(fù)合種、擬輪枝鐮孢、木賊鐮孢和膠孢鐮孢在四大生態(tài)區(qū)均有分布，分離頻率依次為59.3%、11.5%、10.3%和5.9%(圖2，表2)。層出鐮孢在隴南地區(qū)、隴東地區(qū)和河西走廊均有分布，分離頻率為4.7%；變紅鐮孢在隴東地區(qū)、隴中地區(qū)和河西走廊分布，分離頻率為4.0%；三線鐮孢(F.tricinctum)在隴東地區(qū)崆峒區(qū)和隴中地區(qū)通渭縣分離獲得，分離頻率為1.9%；溫帶鐮孢(F.temperatum)分布于隴南地區(qū)張家川縣，銳頂鐮孢(F.acuminatum)分布于隴中地區(qū)通渭縣，尖孢鐮孢分布于隴東地區(qū)華池縣，分離頻率分別為1.2%、0.8%和0.4%。

表2 鐮孢菌的地域分布Table 2 Geographical distribution of Fusarium species

注：A：禾谷鐮孢；B：擬輪枝鐮孢；C：木賊鐮孢；D：膠孢鐮孢；E：層出鐮孢；F：變紅鐮孢；G：三線鐮孢；H：溫帶鐮孢；I：銳頂鐮孢；J和K：尖孢鐮孢。標(biāo)尺表示100 μmNote:A: F. graminearum. B: F.verticillioides. C: F. equiseti. D: F. subglutinans. E: F. proliferatum. F: F. incarnatum. G: F. tricinctum. H: F. temperatum. I: F. acuminatum. J and K: F. oxysporum. The scale is 100 μm.圖1 鐮孢菌形態(tài)特征圖Fig.1 Characteristics of Fusarium species

圖2 鐮孢菌種類和分離頻率Fig.2 Fusarium species and separation frequency

2.2 EF1-α 序列分析

經(jīng)對選取的19個菌株的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫與EF1-a序列相似度達(dá)99%以上的鐮孢菌序列進(jìn)行下載，采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，以匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)為外類群，茄病鐮孢(Fusariumsolani)為內(nèi)類群，發(fā)現(xiàn)TW30(登錄號：MT827971)和ZY13-2(登錄號：MT879692)與變紅鐮孢(登錄號：JF270223、JF270200和GU116584)聚為一支；YJ8-1(登錄號：MT879693)和ZY7-1(登錄號：MT879694)與木賊鐮孢(KT213320、KT213319和KT213315)聚為一支；HHXHZ15-7(登錄號：MT879684)與布氏鐮孢(MK896870、MH582231和KX269078)聚為一支；HCSZ4-9(登錄號：MT879699)與禾谷鐮孢(KY472207、KY472214和MG231090)聚為一支；KTQ16(登錄號：MT879689)和KTQ19(登錄號：MT879688)與三線鐮孢(MG704914、MH093671和MG990939)聚為一支；TW26(登錄號：MT879682)和TW40(登錄號：MT879683)與銳頂鐮孢(登錄號：JX534391、KC175291和KC175292)聚為一支；HA-26(登錄號：MT879697)和ZQDC13-3(登錄號：MT879696)與層出鐮孢(登錄號：KM462980、KX681484和KM462938)聚為一支；HCSZ4-19(登錄號：MT879698)與尖孢鐮孢(JQ965444、JQ965441和MH341212)聚為一支；PC-14-1(登錄號：MT879687)和ZY-2-2(登錄號：MT879686)與擬輪枝鐮孢(登錄號：MG428708、MG734599和MG734598)聚為一支；ZJCZZC14-2(登錄號：MT879691)和ZJCZZC14-5(登錄號：MT879690)與溫帶鐮孢(JX987072)聚為一支；ZY11-1(登錄號：MT879695)和KTQ3-1(登錄號：MT879685)與膠孢鐮孢(JF270300、JF270234和KM462951)聚為一支。

圖3 基于EF-1α建立的鐮孢菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Fusarium species based on EF-1α

2.3 禾谷鐮孢復(fù)合種種間鑒定結(jié)果及地域分布

對分離得到的150株禾谷鐮孢復(fù)合種通過鐮孢菌特異性引物EF-1α擴(kuò)增后進(jìn)行測序和Blast比對，共獲得2個種群，即布氏鐮孢和禾谷鐮孢，前者110株占73.3%，后者40株占24.7%，比例為2.75∶1，由此可見，布氏鐮孢為FGSC的優(yōu)勢種群。分析發(fā)現(xiàn)，布氏鐮孢在隴南山區(qū)、隴中地區(qū)、河西地區(qū)和隴東地區(qū)均有分布，分離頻率分別占FGSC的100.0%、92.1%、89.5%和60.5%，禾谷鐮孢除在隴南地區(qū)未見分布外，其在隴東地區(qū)、河西地區(qū)和隴中地區(qū)均有分布，分離頻率分別占FGSC的39.5%、10.5%和8.9%。

2.4 致病性測定結(jié)果

致病性測定結(jié)果表明，11個菌株均能致病，發(fā)病株率為46.7%～100.0%，其中布氏鐮孢和禾谷鐮孢發(fā)病株率分別為93.3%和100.0%；擬輪枝鐮孢、銳頂鐮孢、木賊鐮孢、三線鐮孢、層出鐮孢、變紅鐮孢、尖孢鐮孢、膠孢鐮孢的發(fā)病株率依次為66.7%、66.7%、73.3%、73.3%、80.0%、80.0%、80.0%和86.7%；溫帶鐮孢的發(fā)病株率為46.7%。

3 討論

玉米莖腐病也稱青枯病，作為玉米生長后期發(fā)生的病害，其發(fā)生侵染和擴(kuò)展過程都在植株體內(nèi)進(jìn)行，因而癥狀擴(kuò)展較為隱蔽，一旦顯癥就無法進(jìn)行防治，目前對該病害的主要防治措施以種植抗病品種和種子包衣處理為主，因此，開展病原學(xué)研究顯得尤為重要。本研究將形態(tài)學(xué)鑒定和EF1-α序列分析進(jìn)行聯(lián)合比對，共獲得10種鐮孢菌，與郭滿庫等[19]研究發(fā)現(xiàn)甘肅玉米鐮孢莖腐病病原種群為禾谷鐮孢、黃色鐮孢和擬輪枝鐮孢相比較，本研究豐富了甘肅玉米莖腐病致病菌的種群和結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果同時表明FGSC和擬輪枝鐮孢的分離頻率相對較高，這與袁虹霞等[20]、賀娟等[7]和許大鳳等[3]的研究結(jié)果相似，但與劉樹森等[2]、孫靜等[4]、范志業(yè)等[5]和劉可杰等[6]的研究結(jié)果存在差異。不同地區(qū)或同一地區(qū)玉米莖腐病病原菌的種群結(jié)構(gòu)存在差異，這可能與主栽玉米品種、耕作模式及氣候條件等諸多因素有關(guān)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，三線鐮孢、銳頂鐮孢、木賊鐮孢、膠孢鐮孢、層出鐮孢、變紅鐮孢、尖孢鐮孢和溫帶鐮孢為甘肅玉米莖腐病的新病原。其中，三線鐮孢和銳頂鐮孢為溫帶地區(qū)土壤習(xí)居菌，前者寄主主要為禾本科植物，如小麥[14]、大麥[14,21-22]和禾本科牧草[23]等。后者寄主范圍較廣，主要分布在加拿大和歐洲的禾本類植物上，也可引起豆科植物穗腐病和根腐病[14]。二者作為玉米莖腐病新病原，鮮見相關(guān)報道。

FGSC因地域分布不同，對不同寄主造成病害的能力也不完全相同[24]。該復(fù)合種包括F.graminearum、F.gerlachii、F.louisianense、F.asiaticum、F.ussurianum、F.nepalense、F.vorosii、F.acaciae-mearnsii、F.aethiopicum、F.boothii、F.mesoamericanum、F.austroamericanum、F.cortaderiae、F.brasilicum和F.meridionale共15個種[25]。有研究表明，亞洲地區(qū)中，在年平均溫度<15℃的北方地區(qū)，優(yōu)勢種群為F.graminearum；在年平均溫度>15℃的南方地區(qū)，以F.asiaticum為優(yōu)勢種群[26-28]。甘肅氣候類型多樣，隴東地區(qū)、隴南地區(qū)、隴中地區(qū)和河西走廊年平均溫度分別為7～10℃、9～15℃、5～9℃和4～9℃。四大生態(tài)區(qū)中年平均溫度≤15℃，優(yōu)勢鐮孢為布氏鐮孢。該研究初步摸清了FGSC的種群結(jié)構(gòu)和地理分布，這對該病害的田間預(yù)警體系構(gòu)建、分區(qū)治理和抗病育種提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究分析了甘肅玉米鐮孢莖腐病致病菌的種群多樣性，以及優(yōu)勢病原菌FGSC的種群結(jié)構(gòu)和地域分布，為甘肅地區(qū)該病害的綜合防控和抗病育種提供了科學(xué)依據(jù)。本研究隨機選取不同種的代表性菌株進(jìn)行了盆栽致病性測定，僅能說明10種鐮孢菌均能引起玉米莖腐病，但鐮孢種間菌株的致病力差異及禾谷鐮孢復(fù)合種是否存在致病性分化等問題仍有待研究。另外，本研究僅針對鐮孢莖腐病進(jìn)行了病原菌的種群多樣性研究，但腐霉莖腐病也不容忽視，其病原菌的種類和數(shù)量需要開展相關(guān)試驗進(jìn)行研究。