黑田五寸胡蘿卜中3個Orange基因的克隆與表達分析

王迎港 熊愛生 徐志勝

(南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095)

類胡蘿卜素是一類在植物質體中合成的C40類異戊二烯化合物，在自然界中分布廣泛，其作為一組種類豐富的天然色素，對植物、動物和人類都有重要的作用[1-3]。在植物中，類胡蘿卜素不僅參與光合作用中的光采集與光保護[4-5], 還參與花果顏色和氣味的形成，有助于花粉和果實的傳播[6]。在動物中，類胡蘿卜素參與了鳥類和魚類等動物鮮艷顏色物質的形成，這些顏色成為保護性色彩或參與輔助求偶，以利于動物生存和繁殖[7-8]。人體不能從頭合成類胡蘿卜素，需要通過攝入果蔬來補充[9]。已有研究表明，缺乏類胡蘿卜素會導致夜盲癥、干眼癥等眼部疾病[10]。此外，攝入適量的類胡蘿卜素可以降低癌癥以及心血管疾病等慢性疾病的發(fā)病率[11-12]。

Orange(Or)基因編碼的蛋白是一類含有類DnaJ鋅指蛋白結構域的蛋白，在多種植物中高度保守[13-14]。目前，研究者們已經從花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)[13]、甘薯(Ipomoeabatatas)[15]、甜瓜(Cucumismelo)[16]和紫花苜蓿(Medicagosativa)[17]等植物中克隆獲得了編碼Or蛋白的基因。Or蛋白可通過轉錄后調節(jié)八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase, PSY)，促進類胡蘿卜素合成[18]，還可以通過促進有色體隔膜的形成，促進類胡蘿卜素積累[19]。Or基因的過量表達能夠增加擬南芥根[18]、水稻[20]和甘薯愈傷組織[15]中類胡蘿卜素的合成。

胡蘿卜 (Daucuscarotassp.sativus; 2n=2x=18) 是二年生傘形科胡蘿卜屬植物，主要以膨大的肉質根為食用部分，因富含類胡蘿卜素而具有豐富的營養(yǎng)價值，在世界各地廣泛種植[11,21]。黑田五寸是引自日本的一個橙色胡蘿卜品種，因其早熟耐熱，產量穩(wěn)定，營養(yǎng)物質豐富，在我國大陸廣泛種植[22-23]。因此，以黑田五寸為材料研究胡蘿卜類胡蘿卜生物合成相關的Or基因，對提高胡蘿卜中的類胡蘿卜素含量，從而改善胡蘿卜品質具有重要意義。

本研究將甜瓜中的CmOr基因(登錄號：KM505046)[16]與胡蘿卜的基因組[24-25]序列比對后發(fā)現3個Or基因，以胡蘿卜品種黑田五寸為試驗材料，克隆并獲得DcOr1、DcOr2及DcOr3基因。采用生物信息學軟件分析其特征，并利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測其在不同生長階段的表達量，以期為明確胡蘿卜中這3個Or基因與類胡蘿卜素合成的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

挑選飽滿的黑田五寸種子于培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱催芽(條件：光/暗12/12 h，溫度25℃)，種子發(fā)芽后播種于南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室人工氣候室。待植株長至30、60、90 以及120 d，分別選擇長勢一致的植株取根部，將材料在液氮中速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 植物總RNA的提取及cDNA合成

使用購自天根生化科技(北京)有限公司的總RNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取胡蘿卜根部的總RNA和DNA。使用OneDrop OD-1000微量分光光度計(南京五義科技有限公司)測定總RNA濃度后，按照HiScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (南京諾唯贊生物公司)試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA。

1.3 胡蘿卜DcOr基因的克隆

用BioEdit將甜瓜中的CmOr基因(登錄號：KM505046)[16]與胡蘿卜的基因組[24-25]比對后確定胡蘿卜中的3個Or基因，使用Primer 6.0軟件設計出3對引物，提交至金斯瑞生物科技有限公司進行引物合成(表1)。

表1 克隆胡蘿卜3個Or基因的引物Table 1 The primers for the cloning of three Or genes in carrot

使用高保真酶Prime STAR Max，以1.2節(jié)反轉錄所得cDNA為模板，選擇40 μL體系進行擴增。PCR反應程序為：98℃預變性10 s；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。擴增結束后取5 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳確定目標產物。將目標產物連接pCAMBIA 1301載體，隨后轉化至大腸桿菌DH5α中，使用南京擎科生物科技有限公司2×T5 Super PCR Mix (Colony) 酶菌液檢測鑒定后送至通用生物系統(tǒng)有限公司(安徽)進行測序。

1.4 序列分析

通過NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 進行BLAST比對得到DcOr的保守域預測，同時選取其他物種的47個Or蛋白的氨基酸序列。然后使用MEGA 5.2軟件中鄰接法 (neighbor-joining) 構建同源進化樹，使用DNAMAN 6.0軟件進行多重比較及親水性/疏水性分析。通過BioXM 2.6軟件進行氨基酸序列分析，采用ExPASy在線工具ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/) 分析理化性質。利用SignalP網站對DcOr蛋白的信號肽進行預測。采用ExPASy提供的SOPMA法 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 預測蛋白二級結構。通過WoLF PSORT在線工具 (https://wolfpsort.hgc.jp/) 預測DcOrs蛋白的亞細胞定位。

1.5 實時熒光定量PCR

使用Hieff qPCR SYBR-Green Master Mix酶(上海翊圣生物科技有限公司)按照試劑盒說明書通過IQ5實時PCR系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國)進行qRT-PCR反應。以胡蘿卜的DcActin1基因(登錄號：XM_017371101.1)作為內參基因[26]。以1.2節(jié)所得cDNA為模板，定量檢測引物列于表2。目的基因相對表達量的計算參照2-ΔΔCt法[27]。

表2 胡蘿卜中3個Or基因和3個PSY基因的qRT-PCR檢測引物Table 2 qRT-PCR detection primers for three Or genes and three PSY genes in carrot

1.6 總類胡蘿卜素的提取及測定

參照李靜文等[28]和Ma等[29]的方法，分別取30、60、90和120 d的黑田五寸胡蘿卜根凍樣于研缽中，加液氮研磨，然后在冷凍干燥機中冷凍抽干，每個時期稱取3份樣品，用丙酮提取類胡蘿卜素。使用SpectraMax iD5酶標儀(Molecular Deries,美國)測定吸光值，參照田小衛(wèi)[30]的方法計算總類胡蘿卜素含量。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜DcOr基因的克隆及序列分析

分別以胡蘿卜黑田五寸的cDNA、DNA為模板，DcOr1-F/DcOr1-R、DcOr2-F/DcOr2-R、DcOr3-F/DcOr3-R為上/下游引物進行擴增，電泳檢測分別得到一條單一的條帶(圖1)。測序結果表明，DcOr1含有一個933 bp 的開放閱讀框 (open reading frame, ORF)，編碼310個氨基酸；DcOr2的ORF長度為858 bp，編碼285個氨基酸；DcOr3的ORF長度為939 bp，編碼312個氨基酸。預測DcOr1相對分子量為33.81 kDa，理論等電點為5.51；DcOr2相對分子量為31.23 kDa，理論等電點為5.21；DcOr3相對分子量為34.44 kDa，理論等電點為7.93。序列分析發(fā)現，DcOr1和DcOr3均包含8個外顯子和7個內含子，而DcOr2包含7個外顯子和6個內含子(圖2)。其中，黑田五寸胡蘿卜中DcOr1和DcOr3的ORF序列及其預測的氨基酸序列與胡蘿卜全基因組2.0版本(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!bulk? org=Org_Dcarota)預測的DcOr1和DcOr3序列(編號：DCAR_020166和DCAR_009172)相比一致，而DcOr2的ORF序列(NCBI登錄號：MW116211)及其預測的氨基酸序列與預測的序列(編號：DCAR_009463)有一定差異(圖3)，具體功能的差異有待進一步探明。

注：M：DNA分子量標準；1：DcOr1基因；2：DcOr2基因；3：DcOr3基因。Note: M: DNA marker. 1: DcOr1 gene. 2: DcOr2 gene. 3: DcOr3 gene.圖1 黑田五寸胡蘿卜3個Or基因的cDNA (A)和DNA (B)擴增圖譜Fig.1 cDNA (A) and DNA (B) amplification of the three Or genes from Kurodagosun carrot

圖2 DcOr基因外顯子和內含子分布Fig.2 Schematic diagram of DcOr genes with exons and introns

注：DcOr2-Y：胡蘿卜全基因組數據預測的序列；DcOr2：黑田五寸胡蘿卜中實際測序結果。Note: DcOr2-Y: The predicted sequences from whole carrot genome. DcOr2: The sequences from Kurodagosun carrot.圖3 黑田五寸胡蘿卜中DcOr2基因的cDNA序列(A)及其預測的氨基酸序列(B)與胡蘿卜全基因組預測序列的比對分析Fig.3 Comparative analysis on the DcOr2 ORF sequence (A) and its predicted amino acid sequence (B) from Kurodagosun carrot and the predicted sequences from whole carrot genome

2.2 DcOr蛋白的系統(tǒng)進化分析

將胡蘿卜中的3個Or的氨基酸序列與其他植物的47個Or的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖4)，結果表明，這50種Or蛋白被分成兩大分支。其中，DcOr1與DcOr2處于同一個大分支上，他們的進化關系最近，與月季Or蛋白(Rosachinensis, XP_024188987.1)表現出較近的進化關系，而DcOr3則處于另一個大分支上，其與三裂葉薯Or蛋白(Ipomoeatriloba, XP_031112030.1)進化關系最近，與苦瓜Or蛋白(Momordicacharantia, XP_022132435.1)也表現出較近的進化關系。

2.3 胡蘿卜Or基因編碼的氨基酸序列分析

將胡蘿卜的Or氨基酸序列與甜瓜(Cucumismelo, A0A0D3MU35.1)、花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis, A2T1U1.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana, Q8VYD8.1)、番茄(Solanumlycopersicum, NP_001315338.1)、甘薯(Ipomoeabatatas, APG21184.1)、木槿(Hibiscussyriacus, KAE8735014.1)、毛棉(Gossypiumtomentosum, TYI35501.1)、苦瓜(Momordicacharantia, XP_022132435.1)、大豆(Glycinemax, XP_003540871.1)、絨毛煙草(Nicotianatomentosiformis, XP_009599295.1)、葡萄(Vitisvinifera, RVX11888.1)、落花生(Arachishypogaea, XP_025687179.1)和蘋果(Malusdomestica, XP_008350183.2)的Or氨基酸序列進行比對(圖5)，結果表明，DcOr基因推導的氨基酸序列包含4個高度保守的富含半胱氨酸區(qū)域(2個CxxCxGxG基序和2個CxxCxxxG基序，共包含8個半胱氨酸殘基和6個甘氨酸殘基)，16種Or蛋白總體相似性達70.42%，表明Or蛋白具有高度保守性。

2.4 胡蘿卜Or蛋白親水性/疏水性分析、信號肽分析、亞細胞定位和保守域預測

使用DNAMAN 6.0軟件及ExPASy在線分析工具ProtParam tool對本研究中的DcOr蛋白進行親/疏水性分析(圖6)。結果表明，DcOr1是親水性蛋白；DcOr2和DcOr3是疏水性蛋白。通過SignalP網站分析可知，DcOr1、DcOr2和DcOr3均無信號肽，屬于非分泌蛋白。WoLF PSORT預測的亞細胞定位結果表明，DcOr1、DcOr2和DcOr3主要定位在質體中。保守域預測結果(圖7)顯示，DcOr1、DcOr2和DcOr3均屬于DnaJ鋅指結構域超級家族。

圖6 胡蘿卜3個Or蛋白的親水性和疏水性分析Fig.6 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of the three Ors from carrot

圖7 胡蘿卜Or蛋白保守結構域預測Fig.7 Prediction of conserved domain of DcOr proteins

2.5 蛋白質結構分析

使用在線分析軟件SOPMA對DcOr蛋白的二級結構進行預測，結果顯示(圖8)，DcOr1中α螺旋占32.90%，延伸鏈占15.48%，β轉角占5.81%，無規(guī)則卷曲占45.81%；DcOr2中α螺旋占27.02%，延伸鏈占17.89%，β轉角占4.91%，無規(guī)則卷曲占50.18%；DcOr3中α螺旋占31.09%，延伸鏈占20.19%，β轉角占5.77%，無規(guī)則卷曲占42.95%。

注: A (1,2)、B (1,2)、C (1,2) 分別是DcOr1、DcOr2、DcOr3蛋白的二級結構預測結果。Note: A (1,2), B (1,2) and C (1,2) are the secondary structure prediction of DcOr1, DcOr2 and DcOr3 proteins, respectively.圖8 3個DcOr蛋白的二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction of three DcOr proteins

2.6 DcOr基因和DcPSY基因在胡蘿卜不同生長階段的表達分析

前人研究表明，胡蘿卜肉質根在30 d時未積累類胡蘿卜素，而在60、90和120 d時則積累了大量的類胡蘿卜素[31]，這與本研究測定結果(圖9)一致。本研究中總類胡蘿卜素測定結果表明，在30 d時的黑田五寸胡蘿卜中未檢測到類胡蘿卜素積累，60 d時總類胡蘿卜素含量達到309.94 μg·g-1DW，隨后增長變緩，在90 d時積累至458.06 μg·g-1DW，120 d時總類胡蘿卜素積累量達到671.82 μg·g-1DW。在黑田五寸胡蘿卜定植30、60、90和120 d后, 采用qRT-PCR技術分析3個DcOr基因和3個DcPSY基因其根中的表達情況(圖10)。結果發(fā)現，DcOr基因在30、60、90和120 d時均有表達，總體上看在各個階段DcOr3表達量最高，DcOr1次之，DcOr2表達量最低(最低時為同期DcOr3表達量的0.21%，最高時為同期DcOr3表達量的11.63%)；DcOr1和DcOr2均在60 d時表達量最高，DcOr1在120 d時表達量最低，DcOr2在90 d時表達水平最低，只有DcOr2表達最高時 (60 d) 的2.24%左右；DcOr3在90 d時表達量最高，30 d時表達量最低。3個DcPSY基因中，DcPSY3基因表達量極低；DcPSY2在各個階段表達表達量都顯著高于DcPSY1和DcPSY3，從30 d到90 d呈上升趨勢并在90 d時達到峰值，然后呈下降趨勢；DcPSY1的相對表達量從30 d到90 d相對緩慢增長，隨后呈下降趨勢。

注: 不同小寫字母表示在0.05 水平上差異顯著。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖9 4個生長階段的總類胡蘿卜素含量分析Fig.9 Analysis of total carotenoids content in four growth stages

圖10 3個DcOr基因和3個DcPSY基因在不同生長階段的相對表達分析Fig.10 The relative expression analysis of the three DcOr genes and three DcPSY genes at different growth stages

3 討論

類胡蘿卜素是一些植物營養(yǎng)和外觀品質的重要組成部分[32]，在一些動植物器官中參與了黃色、橙色和紅色物質的形成[7-8]。此外，類胡蘿卜素對人類的身心健康也起到至關重要的作用[10-12]。PSY參與類胡蘿卜素生物合成的第一步，并且是一個限速酶，而Or蛋白直接與質體中的PSY發(fā)生物理相互作用，從而對PSY進行轉錄后調控[18,33]。此外，Or基因的過表達可以提高類胡蘿卜素水平進而提高植物對環(huán)境脅迫的耐受性[34]。所以，研究Or基因對研究類胡蘿卜素生物合成具有重要意義。

本研究從胡蘿卜品種黑田五寸中克隆得到3個編碼Or蛋白的基因，由其推導的氨基酸序列都包含4個高度保守的區(qū)域(2個CxxCxGxG基序和2個CxxCxxxxG基序，共包含8個半胱氨酸殘基和6個甘氨酸殘基)，與花椰菜[13]、甘薯[15]、甜瓜[16]、紫花苜蓿[17]中的研究結果一致?；ㄒ酥械腛r蛋白預測分子量為33.5 kDa，在進化上與擬南芥最接近[13]；甘薯(Ipomoeabatatas)IbOr蛋白預測分子量為34.3 kDa，系統(tǒng)進化樹顯示其與牽?；ǖ挠H緣關系最近[15]；甜瓜(Cucumismelo)CmOr蛋白預測分子量為36.3 kDa，在進化上與黃瓜最接近[16]；紫花苜蓿(Medicagosativa)MsOr蛋白預測分子量為78.4 kDa，系統(tǒng)進化分析表明與蒺藜苜蓿親緣關系最近[17]。而胡蘿卜中DcOr1、DcOr2、DcOr3蛋白預測分子量為33.81、31.23和34.44 kDa，分別與月季和三裂葉薯最近。由此發(fā)現，Or蛋白雖然在不同植物中高度保守，但蛋白大小、親緣關系都有一定差異。

已有研究表明，Or蛋白在花椰菜中被定位于質體和細胞核[13,35]；在甘薯中定位于細胞核和葉綠體中，且可能在熱脅迫時從細胞核轉移到葉綠體[15,36]；在擬南芥黃化子葉中被定位于細胞核中[37]，這與黃化子葉沒有葉綠體有關。有證據表明，Or基因能促進前質體或無色質體分化為有色體，通過庫的增加來促進類胡蘿卜素的積累[13,38]。本研究中亞細胞定位預測結果顯示DcOr1、DcOr2和 DcOr3蛋白主要存在于質體中，與前人研究結果一致。

本研究發(fā)現，隨著類胡蘿卜素的積累，DcOr3的相對表達量不斷升高，90 d時達到峰值，而且其表達量趨勢與DcPSY1、DcPSY2的相對表達量趨勢相近。由此推測DcOr3表達可能與類胡蘿卜素的合成最相關，后續(xù)可通過過表達及敲除基因以進一步驗證DcOr3與總類胡蘿卜素的積累的相關性。

值得一提的是，花椰菜中除了分離出與類胡蘿卜素合成相關的Or基因外，還分離出了一個與Or基因有55%的核苷酸序列同源性的類似基因Or-like，這2個基因在功能上可能不是冗余的[13]，但具體功能未做驗證。而Zhou等[18]在擬南芥的研究中發(fā)現，AtOr被敲除后AtOr-like的表達量是野生型的4.6倍，AtOr-like被敲除后AtOr的表達量是野生型的1.8倍，說明AtOr被敲除后需要更多的AtOr-like補償；AtOr和AtOr-like在其中一個被敲除時另一個的表達量會顯著提升，植株生長無明顯異常，只有都被敲除時才會影響植株的正常生長。敲除結果說明AtOr和AtOr-like的功能是冗余的，正常情況下可能協(xié)同發(fā)揮作用。從圖4進化樹可以看出DcOr3與擬南芥AtOr-like(Arabidopsisthaliana, Q8VYD8.1)更近一些，推測胡蘿卜中與類胡蘿卜素合成最相關的DcOr3與AtOr-like最相似，DcOr1和DcOr2可能有功能但有待研究。這3個DcOr基因具體的作用機制有待后續(xù)試驗探明。

4 結論

本研究以黑田五寸為試驗材料，克隆得到了編碼胡蘿卜Or蛋白的DcOr1、DcOr2和DcOr3基因。進化樹分析顯示，在3個DcOr蛋白中，DcOr1和DcOr2在進化上更近，他們與DcOr3進化關系較遠，而DcOr3同三裂葉薯Or蛋白(XP_031112030.1)進化關系較近。3個DcOr基因在胡蘿卜生長的各個階段均有表達，其中DcOr2相對表達量最低，DcOr3在各個階段的相對表達量均最高，在90 d時達到峰值，且相對表達量趨勢與DcPSY1、DcPSY2最接近，推測DcOr3與胡蘿卜中類胡蘿卜素的積累最相關。但3個DcOr基因具體的作用機制還有待進一步研究。