寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞系建立的初步研究*

代金彩 聶竹蘭 劉潔雅 洪繼彪

寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞系建立的初步研究*

代金彩 聶竹蘭①劉潔雅 洪繼彪

(塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室 塔里木珍稀魚類研究中心 新疆 阿拉爾 843300)

魚類細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行種質(zhì)保存、基因功能分析、細(xì)胞工程育種等研究的重要材料和模型。為了建立瀕危的寬口裂腹魚()中腎組織細(xì)胞系，本研究以其中腎組織為材料，以組織塊移植法啟動細(xì)胞原代培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，建立寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞系，命名為EUM10。分析寬口裂腹魚中腎細(xì)胞系凍存復(fù)蘇能力和最適生長條件，且通過PCR技術(shù)檢驗污染狀況，用線粒體基因片段分析鑒定細(xì)胞的來源。結(jié)果顯示，寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞的最佳培養(yǎng)基為DME/F-12，最適溫度為25℃，最適血清濃度為20%；細(xì)胞呈懸浮生長，生長曲線為“S”型曲線，第10代中腎組織細(xì)胞系細(xì)胞的群體倍增時間為23.26 h；第6代細(xì)胞液氮冷凍保存6個月后，復(fù)蘇存活率達(dá)91.91%；經(jīng)污染鑒定無污染現(xiàn)象；EUM10第10代細(xì)胞線粒體16S rRNA序列分析結(jié)果與寬口裂腹魚基因序列一致性為99.81%，表明細(xì)胞系來自寬口裂腹魚。本研究成功建立了寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞系，可將寬口裂腹魚中腎細(xì)胞系作為體外體系運(yùn)用于寬口裂腹魚的研究，如細(xì)胞遺傳學(xué)、基因功能分析等，可為寬口裂腹魚的基礎(chǔ)研究和育種工作提供基礎(chǔ)資料。

寬口裂腹魚；中腎組織；細(xì)胞系；細(xì)胞培養(yǎng)

寬口裂腹魚()隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothpracinae)、裂腹魚屬()，又名白條(龍見全等, 2019)，其顯著特征為下顎有角質(zhì)，手觸有較為明顯的粗糙感。國外分布于阿姆河水系、錫爾河水系，國內(nèi)分布于阿克蘇河、渭干河、葉爾羌河、克孜勒蘇河和伊犁河，是塔里木河水系的土著魚類、新疆特有經(jīng)濟(jì)魚類。由于人為和環(huán)境變化等原因，寬口裂腹魚的數(shù)量急劇減少，在自然環(huán)境中，寬口裂腹魚產(chǎn)卵的受精率和成活率不高。2019年4月在烏恰縣境內(nèi)的克孜勒河中捕撈到體長6 cm左右的寬口裂腹魚，通過按壓腹部，在泄殖孔出現(xiàn)大量的乳白色精液(圖1)，且體長6 cm以下的寬口裂腹魚也能按壓擠出精液，表現(xiàn)出不同程度的早熟現(xiàn)象。環(huán)境變化、氣候變化、棲息地的破壞加劇了裂腹魚的瀕危(魏杰等, 2020)。目前，市場上少見寬口裂腹魚，市場價在200～ 400元/kg，資源量正在減少，自治區(qū)擬將其列為保護(hù)魚類(龍見全等, 2019)。

圖1 寬口裂腹魚擠出的精液

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是在體外人工模擬體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)基中，細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞的技術(shù)。世界上第一個魚類細(xì)胞系是由Wolf等(1962)建立的虹鱒()生殖腺細(xì)胞系RTG-2。我國最早建立的細(xì)胞系是張念慈等(1981)報道的草魚()吻端組織細(xì)胞系ZC-7901和上皮樣細(xì)胞亞株ZC-7901S1。目前，關(guān)于魚類細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞系的報道有34科80種300株(Fryer, 1994)，并應(yīng)用于病毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程和環(huán)境毒理學(xué)等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2019年4月于新疆克孜勒河采集寬口裂腹魚，取其中1條健康寬口裂腹魚，體重為93.98 g，體長為15.89 cm，全長為18.66 cm。

DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640和M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；磷酸緩沖液(PBS)、青霉素–鏈霉素雙抗、二甲基亞砜(DMSO)和吉姆薩購自Solarbio公司；臺盼藍(lán)和0.25%胰酶購自Biotopped公司；MS-222購自漁夫?qū)毠荆?5 cm2和75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、15 mL和50 mL離心管、移液管、細(xì)胞凍存管、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板均為Corning公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 寬口裂腹魚的預(yù)處理 將寬口裂腹魚在實驗室暫養(yǎng)3 d后，放入20 mg/mL的KMnO4溶液中浸泡30 min，然后加入0.1 μL/g的MS-222麻醉劑麻醉，致死。將魚全身噴涂75%酒精，放入超凈臺的解剖盤中。取4個培養(yǎng)皿，其中1個培養(yǎng)皿中加75%酒精，另3個培養(yǎng)皿均加含500 IU/mL的青霉素、500 μg/mL的鏈霉素和12.5 μg/mL兩性霉素B的PBS。用解剖學(xué)方法取出寬口裂腹魚魚鰾之上、脊柱下側(cè)的中腎，將取出中腎組織放入75%的酒精浸泡30 s之后，再依次放入另外3個含有PBS的培養(yǎng)皿中浸泡。經(jīng)處理的中腎組織放入2 mL無菌離心管中，用無菌眼科剪剪至1～3 mm的大小均勻的組織碎塊。

1.2.2 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 將已剪好的中腎組織碎塊移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入25℃的CO2培養(yǎng)箱中，觀察貼壁情況，過4 h后反相放置。6 h后，加入1 mL含20% FBS、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素和500 μg/mL兩性霉素B的DME/F-12培養(yǎng)液，正相放入25℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察組織生長的情況。2～3 d后更換培養(yǎng)液，當(dāng)寬口裂腹魚中腎組織塊周圍出現(xiàn)細(xì)胞的懸浮物時，懸浮細(xì)胞，移至15 mL的離心管中，1000 r/min離心5 min，倒掉上清液后加入PBS使細(xì)胞懸浮，1000 r/min離心5 min，如此重復(fù)3次。加入DME/F-12培養(yǎng)液，按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第5代之后，將培養(yǎng)液中的鏈霉素、青霉素和FBS的濃度分別調(diào)整為200 μg/mL、200 IU/mL和15%，到第8代時，培養(yǎng)液換為含10% FBS和1% P/S的DME/F-12培養(yǎng)液。

1.2.3 最佳培養(yǎng)基的選擇 使用5種培養(yǎng)基：DME/F-12、M199、L-15、MEM和RPMI-1640。觀察細(xì)胞的生長狀況。分別向培養(yǎng)基中加入10% FBS和1% P/S，混勻。取一定量的中腎細(xì)胞，分別接種在5個培養(yǎng)基中，中腎細(xì)胞數(shù)量保持一致。在25℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，在培養(yǎng)0、24、48、72和96 h時用血球計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并繪制5種培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長曲線。

1.2.4 最適溫度的選擇 觀察不同溫度(20℃、25℃和30℃)對中腎細(xì)胞生長的影響。每種溫度下的培養(yǎng)基皆為10% FBS和1% P/S的DME/F-12培養(yǎng)基。在0、24、48、72和96 h，使用血球計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并繪制不同溫度下的生長曲線。

1.2.5 最適血清濃度的選擇 在得到最適溫度和培養(yǎng)基后，保持其他條件一致，調(diào)節(jié)FBS濃度(0%、5%、10%和20%)。將相同數(shù)量的中腎細(xì)胞接種于除血清濃度不同而其他條件均相同的培養(yǎng)基中，放在25℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)0、24、48、72和96 h時，用血球計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并繪制不同F(xiàn)BS下的生長曲線。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)生長曲線 取中腎細(xì)胞溶液，接種到24孔培養(yǎng)板上，將其分為8組，每組3個孔，放入25℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)7 d計數(shù)，使用血球計數(shù)板每天計數(shù)1次。以天數(shù)為橫坐標(biāo)()，以每天計數(shù)的平均數(shù)為縱坐標(biāo)(細(xì)胞密度×104)，計算細(xì)胞群體倍增的時間：

=?lg/lg(N/N)

式中，N為時間時的細(xì)胞數(shù)，N為起始細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 凍存：配置10%二甲基亞砜、20% FBS、70% DME/F-12的細(xì)胞凍存液，預(yù)冷，細(xì)胞濃度為2×106個/mL，倒入冷凍管，液氮中保存。

復(fù)蘇：按細(xì)胞∶培養(yǎng)液=1∶5的比例，細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，在培養(yǎng)0、24、48和72 h時，用MTT法測定細(xì)胞的OD值，繪制細(xì)胞復(fù)蘇后增殖曲線。

1.2.8 細(xì)胞污染與檢測鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)過程中容易被污染，為了檢查培養(yǎng)過程是否受到污染，采用通用引物，用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定(表1)。

1.2.9 細(xì)胞來源鑒定 用基因組DNA試劑盒提取中腎組織細(xì)胞DNA。根據(jù)寬口裂腹魚16S rRNA設(shè)計引物(表1)。通過PCR擴(kuò)增，50 μL反應(yīng)體系：25 μL 2×PCR MasterMix，引物各2.5 μL，5 μL模板DNA，15 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，48.9℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。PCR產(chǎn)物測序，比較并獲得與GenBank中已發(fā)表序列的一致率。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

每天觀察細(xì)胞瓶，從4 d后開始，寬口裂腹魚的中腎組織塊周圍開始遷出細(xì)胞，由組織塊向周圍溢出，形狀呈不規(guī)則團(tuán)狀連接結(jié)構(gòu)(圖2a)；第9天開始，70%的細(xì)胞瓶底面被鋪滿(圖2b)；第15天，細(xì)胞呈懸浮生長(圖2c)，按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀況，生長速度較快。

2.2 最適培養(yǎng)基

在M199、L-15、MEM、RPMI-1640和DME/F-12培養(yǎng)基中同條件培養(yǎng)4 d，在每個時間相對細(xì)胞數(shù)量為DME/F-12>L-15>RPMI-1640>M199>MEM，其中，DME/F-12增勢較大(圖3)。3 d后，除DME/F-12外，其他4種培養(yǎng)基的增長速度趨于平緩。L-15比其他3種培養(yǎng)基效果較好，在2 d后較為明顯。M199和RPMI-1640效果較為相似，RPMI-1640略高一點。相比之下，最適培養(yǎng)基為DME/F-12。

圖2 寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基

2.3 最適溫度

在3種較適宜溫度20℃、25℃和30℃下，將中腎細(xì)胞同條件培養(yǎng)4 d后，統(tǒng)計中腎細(xì)胞數(shù)量(圖4)。20℃和25℃時，效果非常相似，而這2個溫度相對于30℃，效果更明顯，在1 d后開始出現(xiàn)差別。20℃比25℃效果較好，但并不明顯，尤其在2、3 d中幾乎相似，4 d后出現(xiàn)差別，25℃細(xì)胞數(shù)量略高于20℃。因此，最適溫度為25℃。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)最適溫度

2.4 最適血清

取定量中腎細(xì)胞在0(對照組)、5%、10%和20%的濃度血清培養(yǎng)基中同條件培養(yǎng)，除在對照組血清中生長較緩，在其余濃度的血清中均生長較好。在10%和20%濃度的血清中細(xì)胞生長的數(shù)量較為接近，尤其在1、3和4 d時。而在5%濃度血清中，生長情況明顯比除對照組外的濃度組效果差。除對照組血清培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長速度均較快(圖5)。比較4組數(shù)據(jù)，最適血清的濃度為20%。

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)的最適血清

2.5 標(biāo)準(zhǔn)生長曲線

繪制生長曲線(圖6)。接種一定數(shù)量的細(xì)胞，在最適條件下生長，在1～4 d時細(xì)胞生長的速度較快，到5～6 d時生長速度放緩趨于平穩(wěn)，之后細(xì)胞數(shù)量下降。經(jīng)計算，細(xì)胞群體倍增的時間為23.26 h。

圖6 細(xì)胞生長標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計數(shù)并計算存活率，重復(fù)10組取平均值。對第6代細(xì)胞液氮冷凍保存后，復(fù)蘇經(jīng)臺盼藍(lán)染色并計數(shù)統(tǒng)計，6個月后復(fù)蘇存活率達(dá)91.91% (表2)；細(xì)胞具有活性，且復(fù)蘇后增殖速度快(圖7)，可正常傳代(圖8)。

表2 凍存后復(fù)蘇的存活率

圖7 MTT法測定復(fù)蘇細(xì)胞增殖

圖8 寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

2.7 細(xì)胞污染與檢測鑒定

經(jīng)PCR法鑒定細(xì)菌、真菌、支原體污染，樣品均無與陽性對照組一致的條帶，樣品中無細(xì)菌、真菌、支原體，寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞未被污染(圖9)。

2.8 細(xì)胞來源鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得1077 bp的基因片段，在瓊脂糖凝膠中電泳檢測，大小符合(圖10)。測序序列片段，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對。結(jié)果顯示，與GenBank中發(fā)布的來源于寬口裂腹魚線粒體基因(NC0369331)的序列同源性為99.81%。證明細(xì)胞系來自寬口裂腹魚。

圖9 細(xì)菌、真菌、支原體PCR鑒定結(jié)果

圖10 寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 分析與討論

寬口裂腹魚是新疆的土著魚類，在20世紀(jì)60年代數(shù)量仍然可觀，但由于人為因素和環(huán)境變化，現(xiàn)已成為瀕危物種。隨著寬口裂腹魚的數(shù)量急劇下降，保護(hù)寬口裂腹魚已刻不容緩。建立寬口裂腹魚的細(xì)胞系，可以有效保護(hù)寬口裂腹魚的種質(zhì)資源，為細(xì)胞生物學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)和基因工程的研究奠定基礎(chǔ)。如王京真等(2010)對長江江豚()的靜脈細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，嘗試轉(zhuǎn)染SV40大T抗原，得到永久細(xì)胞系。

關(guān)于魚類細(xì)胞培養(yǎng)生長特性的研究主要集中在培養(yǎng)基、溫度、血清、凍存復(fù)蘇等方面。本研究采用DME/F-12、L-15、RPMI-1640、M-199和MEM培養(yǎng)基，應(yīng)用于寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)，DME/F-12培養(yǎng)基的效果最好，而在前人研究的魚類細(xì)胞培養(yǎng)中大部分采用的是L-15 (Wang, 2003; Leibovitz, 1977; Fryer, 1994)，其有效的緩沖系統(tǒng)可防止pH的過大波動，可保證細(xì)胞的長時間培養(yǎng)，符合魚類細(xì)胞的生長特征，如云紋石斑魚()腎組織細(xì)胞系(EMK) (Liu, 2018)最佳培養(yǎng)基為L-15，但不適宜本研究中的寬口裂腹魚的細(xì)胞培養(yǎng)。本研究使用DME/F-12培養(yǎng)基時，寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞生長更好，可能由于不同種魚類生長環(huán)境不同，且所需營養(yǎng)不同。除了L-15培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)液也逐漸應(yīng)用于魚類細(xì)胞培養(yǎng)，如RPMI-1640和M199等。大多數(shù)細(xì)胞的生長與溫度密切相關(guān)，魚類是變溫動物，其細(xì)胞培養(yǎng)的溫度范圍比哺乳動物廣。寬口裂腹魚在20℃～30℃條件下均能生長，最佳溫度為25℃，此時的細(xì)胞生長良好、穩(wěn)定，過高或過低的溫度均對細(xì)胞的生長有影響。樊廷俊等(2007)研究表明，大菱鲆()鰭細(xì)胞體外培養(yǎng)在16℃～20℃均能生長，最適溫度為20℃～24℃；張念偉等(2017)對大菱鲆腦細(xì)胞體外培養(yǎng)， 18℃～30℃均能生長，最適溫度為24℃；Wang等(2014)對大黃魚腎組織細(xì)胞均能生長，在28℃時生長最好。魚類細(xì)胞的生長溫度范圍比較廣，寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞體外培養(yǎng)在20℃～30℃均能生長，這與本研究一致。不同種和同一種不同部位的細(xì)胞來源，生長溫度也不盡相同，因此，魚類細(xì)胞培養(yǎng)確定培養(yǎng)溫度至關(guān)重要。在同一條件下，用不同濃度的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞時，胎牛血清組比無血清組的細(xì)胞生長好。在5%、10%和20%血清中生長時，10%和20%濃度的血清比5%血清組生長差別明顯，說明牛血清濃度對細(xì)胞的生長有明顯影響(李自良等, 2020)。當(dāng)血清濃度為10%和20%時，細(xì)胞的生長不是特別明顯，但相對10%濃度的血清，20%濃度的血清效果最好，與相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果相似(Li, 2017; 譚鳳霞, 2008)。

本研究中，寬口裂腹魚中腎細(xì)胞呈現(xiàn)懸浮生長，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般為淋巴細(xì)胞等血液系統(tǒng)來源的細(xì)胞，這種細(xì)胞體積小，缺乏粘附分子的表達(dá)，Ribas等(2014)研究抗炎藥物對淡水魚虎利齒脂鯉()的原代腎細(xì)胞培養(yǎng)的影響時應(yīng)用的腎細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。寬口裂腹魚中腎細(xì)胞呈懸浮生長可能與其體積和粘附分子的表達(dá)有關(guān)系，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

本研究對第10代中腎組織細(xì)胞進(jìn)行生長曲線測定，細(xì)胞的生長曲線為“S”型。在第4天時，細(xì)胞生長達(dá)到峰值，由于空間和營養(yǎng)不足等原因，細(xì)胞生長開始減弱。將細(xì)胞放入液氮中冷凍后，6個月后復(fù)蘇，復(fù)蘇存活率達(dá)到91.91%，細(xì)胞生長正常，可以傳代，生長很旺盛。

細(xì)胞是實驗的重要模型，污染卻是實驗中最大的阻礙，對實驗結(jié)果造成嚴(yán)重影響。比較常見的污染有細(xì)菌、真菌、支原體等。在細(xì)胞污染鑒定過程中，通過PCR技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行檢測，操作簡單。結(jié)果證明，培養(yǎng)過程中未受到污染。

采用進(jìn)化緩慢的保守序列16S rRNA，進(jìn)一步對細(xì)胞來源鑒定，經(jīng)分析，與寬口裂腹魚序列一致性為99.81%，表明其來源于寬口裂腹魚。

4 結(jié)論

本研究以寬口裂腹魚中腎組織為材料進(jìn)行體外培養(yǎng)，建立了寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞系。寬口裂腹魚作為新疆特色經(jīng)濟(jì)魚類，細(xì)胞系的建立對寬口裂腹魚的生物學(xué)、細(xì)胞工程、基因工程和種質(zhì)資源保護(hù)等都有重要意義，可為新疆特色漁業(yè)建設(shè)提供支持。

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Preliminary Study on the Establishment of Kidney Tissue Cell Lines in

DAI Jincai, NIE Zhulan①, LIU Jieya, HONG Jibiao

(College of Animal Science, Tarim University; Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production and Construction,Alar, Xinjiang 843300, China)

Fish cell culture is an important model for germplasm preservation, gene function analysis, and cell engineering breeding. Therefore, it is of great significance to establish cell lines for the endangeredThe aim of this study was to establish a kidney tissue cell line forfor which mesonephric tissue was used. The primary cell culture was initiated by tissue block transplantation and the subculture was carried out after the cells were stabilized. A kidney cell line (EUM10) was established. To analyze the cryopreservation and resuscitation ability of renal cell lines and the optimal growth conditions for, PCR was used to detect contamination and mitochondrial gene fragment analysis was used to identify the source of the cell. The results showed that the optimal medium forkidney tissue cells was DME/F-12, the optimal temperature was 25℃, and the optimal serum concentration was 20%. The cells grew in suspension and the growth curve was S-shaped. The growth curve shows that the population doubling time of the kidney tissue cell line cells in the 10th generation was 23.26 h. After 6 months of cryopreservation with liquid nitrogen, the recovery/survival rate was 91.91% (6th generation).shares 99.81% of the gene sequence identity with a split-bellied fish from Tarim, which proves that the cell line originates from a wide-mouthed split-bellied fish. In this study, a kidney cell line forwas successfully established. Kidney cell lines can be used as in vitro systems to study various aspects of fish, such as cytogenetics and gene function analysis. This study provides the basic data for the initial research into and breeding of.

; Kidney tissue; Cell line; Cell culture

NIE Zhulan, E-mail: niezhl2004@163.com

Q952

A

2095-9869(2021)06-0061-08

10.19663/j.issn2095-9869.20200512001

http://www.yykxjz.cn/

代金彩, 聶竹蘭, 劉潔雅, 洪繼彪. 寬口裂腹魚中腎組織細(xì)胞系建立的初步研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 61–68

DAI J C, NIE Z L, LIU J Y, HONG J B. Preliminary study on the establishment of kidney tissue cell lines in. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 61–68

聶竹蘭，教授，E-mail: niezhl2004@163.com

2020-05-12,

2020-05-31

*國家自然科學(xué)基金(31560721; 31860729)、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃項目(2018CB033)和兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201804)共同資助 [This work was funded by National Natural Science Foundation of China (31560721; 31860729), the Scientific and Technological Innovation Commanding Troops Talented Person Project financially supported by Xinjiang Production and Construction Corps for Young and Middle-Aged (2018CB033), and the Key Laboratory of Animal Science and Technology of Xinjiang Production and Construction Corps (HS201804)]. 代金彩，E-mail: 1477496028@qq.com

(編輯 馮小花)