低鹽脅迫下松江鱸ATP1A3和ATP2B1基因的表達(dá)變化規(guī)律*

毛非凡 鄺杰華 馬 騫 周啟苓 李 昂 劉新富 莊志猛

低鹽脅迫下松江鱸和基因的表達(dá)變化規(guī)律*

毛非凡1鄺杰華1馬 騫1①周啟苓1李 昂2劉新富2莊志猛2

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東 湛江 524025；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 山東 青島 266071)

為了探究Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在松江鱸()應(yīng)對低鹽脅迫過程中的調(diào)節(jié)作用，本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取目標(biāo)基因(Na+/K+-ATP酶α3亞基基因)和(Ca2+-ATP酶1基因)的序列信息并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了松江鱸的鰓、腸、腎臟和肝臟組織中2個基因在2種低鹽脅迫處理(鹽度漸變處理，鹽度變化速率為1.1/h；鹽度驟變處理，鹽度變化速率為27/h)下，不同時間點(0 h、12 h、24 h和48 h)的表達(dá)水平。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，和基因分別聚類形成獨立分支；在各基因分支中，松江鱸與已報道的鱸形目和鰈形目等魚類共同聚在硬骨魚類分支中。在2種低鹽脅迫處理下，2個基因在鰓、腸、腎臟和肝臟組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢。鰓組織中表達(dá)量在鹽度漸變處理下先上升后下降，表達(dá)量僅在24 h顯著升高；鹽度驟變處理下，表達(dá)量顯著下降，表達(dá)量顯著上升。2種鹽度漸變處理下，腸組織中表達(dá)量均在24 h顯著下降；表達(dá)量在鹽度漸變處理下顯著上升，鹽度驟變處理下在24 h顯著上升。在鹽度漸變處理下，腎臟組織中2個基因的表達(dá)量均在24 h顯著上升至最大值；表達(dá)量在鹽度驟變處理下顯著上升，表達(dá)量在12 h和48 h顯著上升。肝臟組織中2個基因的表達(dá)量在鹽度漸變處理下均無顯著變化；鹽度驟變處理下，表達(dá)量持續(xù)顯著上升，表達(dá)量在48 h顯著上升。結(jié)果表明，低鹽脅迫處理顯著影響了和基因的表達(dá)水平，但2個基因的表達(dá)量變化規(guī)律存在顯著性差異。上述結(jié)果為探討Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在魚類滲透壓調(diào)節(jié)過程中的作用及洄游性魚類適應(yīng)鹽度變化的分子調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

松江鱸；鹽度脅迫；；；表達(dá)變化規(guī)律

ATP酶是一類分布廣泛的膜結(jié)合蛋白酶，由基因(Na+/K+-ATP酶α3亞基基因)編碼，屬于Na+/K+-ATP酶的亞家族。Na+/K+-ATP酶對Na+、K+不對等運輸造成細(xì)胞膜內(nèi)外的電位差，維持著細(xì)胞高鉀低鈉的內(nèi)環(huán)境(Kaplan, 2002)。Na+/K+-ATP酶在虹鱒() (McCormick, 2008)、青鳉() (馮平等, 2006)、金曼龍() (Huang, 2010)、莫桑比克羅非魚() (Inokuchi, 2008)等的滲透壓平衡、鹽度調(diào)節(jié)等過程中均發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

Ca2+-ATP酶是ATP酶家族中的另一重要成員，通過將Ca2+主動轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，維持細(xì)胞內(nèi)低鈣水平，對神經(jīng)細(xì)胞動作電位的傳導(dǎo)、細(xì)胞分泌及繁殖均有重要影響(王珂等, 2010)?；?Ca2+-ATP酶1基因, plasma membrane calcium-transporting ATPase 1)編碼Ca2+-ATP酶。目前，關(guān)于在脊椎動物中的研究主要集中在血壓的調(diào)控機(jī)制，如Wang等(2017)采用心肌細(xì)胞特異性缺失的方法，分別在小鼠()的器官和細(xì)胞水平上研究了在心房Ca2+穩(wěn)態(tài)和電穩(wěn)定性中的作用。而關(guān)于應(yīng)對外界滲透壓變化的分子調(diào)控機(jī)理的研究主要集中在植物，例如堿茅()幼苗葉片在鹽度脅迫下，其內(nèi)源激素傳導(dǎo)信號導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度增加，質(zhì)膜Ca2+-ATP酶活性增加，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度以維持細(xì)胞正常的代謝活動(劉延吉等, 2008)。庚宸帆(2016)研究表明，低鹽度脅迫條件下，Ca2+-ATP酶在刺參()各組織器官中均呈現(xiàn)高表達(dá)，說明基因可能在刺參的鹽度適應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

鹽度作為重要的水環(huán)境因子之一，對魚類的存活、攝食生長和滲透壓調(diào)節(jié)等均有直接影響(Shi, 2008)。通常情況下，魚類可憑借高效的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制及應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制應(yīng)對鹽度變化，從而保障魚體生理生化過程的正常進(jìn)行。研究顯示，ATP酶家族在魚類的滲透壓調(diào)控及應(yīng)對鹽度脅迫過程中發(fā)揮重要作用，例如，張曉燕等(2018)通過對花鱸() Na+/K+-ATP酶活性及其基因表達(dá)的測定，探討了海水淡化條件下花鱸的生理水平變化與相應(yīng)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。胡靜等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，急性鹽度脅迫對克氏雙鋸魚()幼魚的鰓絲和肝臟中Na+/K+-ATP酶活性有顯著影響。施兆鴻等(2017)研究了鹽度脅迫對云紋石斑魚()鰓離子調(diào)節(jié)酶及滲透壓的影響，表明Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在云紋石斑魚鰓組織的滲透壓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。此外，鹽度驟降條件下，大黃魚()鰓絲中Na+/K+- ATP酶活力有顯著變化(王濤等, 2013)。近年來，關(guān)于ATP酶家族的研究主要集中在各種酶的活性水平上，但針對ATP酶家族不同成員在基因水平上應(yīng)對鹽度脅迫的分子調(diào)控機(jī)制少有報道。

松江鱸()是一種小型近岸淺海、降海洄游魚類(王金秋, 1999)。松江鱸作為洄游性魚類，對水環(huán)境中的鹽度具有極強(qiáng)的適應(yīng)性。Ma等(2018)在前期開展的松江鱸應(yīng)對鹽度變化的分子調(diào)控機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，松江鱸腎臟組織中和基因的表達(dá)量在低鹽脅迫下均存在顯著變化。為進(jìn)一步探究和基因在松江鱸應(yīng)對鹽度脅迫過程中的作用，本研究從前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取了和基因的序列信息，基于這2個基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，隨后利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了松江鱸在2種低鹽脅迫處理下，滲透壓調(diào)控相關(guān)組織(鰓、腸和腎臟)及代謝相關(guān)組織(肝臟)中2個基因的表達(dá)水平變化情況，旨在為揭示和基因在松江鱸應(yīng)對鹽度脅迫的滲透壓調(diào)節(jié)作用，探明洄游性魚類鹽度適應(yīng)性分子調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

實驗用松江鱸成魚共計216尾(1齡)，體長為(12.22±0.91) cm，體重為(19.54±5.17) g，采集于東營裕海孵化場，隨后運至青島通用水產(chǎn)養(yǎng)殖公司進(jìn)行實驗。實驗用魚平均分布于12個有效容積為100 L的平底纖維增強(qiáng)塑料(FRP)水箱中，暫養(yǎng)2周，水溫為10℃～12℃，鹽度為30，每天循環(huán)水量為600 L，光照周期為12L∶12D。

本研究設(shè)置2個低鹽脅迫(鹽度由30降至3)實驗組：鹽度驟變低鹽脅迫組(sharply-reduced group, SG)，鹽度變化速率為27/h，鹽度降至3后維持不變；鹽度漸變低鹽脅迫組(gradually-reduced group, GG)，鹽度變化速率相對緩慢，為1.1/h，鹽度降至3后維持不變。2個低鹽脅迫實驗組各設(shè)置6個平行，每個平行各18尾魚。低鹽脅迫處理開始(水體鹽度30)記為0 h，分別在鹽度脅迫處理開始后0 h、12 h、24 h和48 h的4個時間點取樣，每個平行隨機(jī)選取3尾魚進(jìn)行解剖，并分別取其鰓、腸、腎臟和肝臟組織，立即將樣品投入液氮中速凍后，在低溫狀態(tài)下轉(zhuǎn)移至–80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2 ATP1A3和ATP2B1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI SRA數(shù)據(jù)庫登錄號：SRP103494)中提取和基因的序列信息，利用EditSeq軟件預(yù)測松江鱸和基因的開放閱讀框，并將其翻譯成對應(yīng)的氨基酸序列；在NCBI搜索其他魚類及高等脊椎動物的ATP1A3和ATP2B1氨基酸序列，通過DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對，利用MEGA 5.0軟件，以鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，針對進(jìn)化樹各分支結(jié)點均進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣檢驗(Schmittgen, 2008)。

1.3 引物設(shè)計

基于松江鱸和的cDNA序列，遵循引物設(shè)計原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因特異性引物ATP1A3-F/R、ATP2B1-F/R，內(nèi)參基因引物18S-F/R (表1)，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.4 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

將松江鱸各組織樣品在液氮中研磨后，采用Trizol法(Invitrogen)提取總RNA。通過核酸測定儀檢測濃度和純度后，以提取的總RNA為模板，根據(jù)PrimeScript Rtase試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。

表1 本實驗所用引物

1.5 ATP1A3和ATP2B1實時熒光定量PCR

根據(jù)松江鱸和的cDNA序列，分別設(shè)計相應(yīng)的特異性引物，以核糖體18S rRNA作為內(nèi)參基因，檢測2種低鹽脅迫處理下，鰓、腸、腎臟和肝臟組織中和基因在不同時間點的相對表達(dá)量。實時熒光定量PCR實驗流程按照SYBR?Premix ExTM試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行操作，在ABI 7500型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行，實驗中每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。所有引物均經(jīng)過擴(kuò)增效率檢測(> 90%；2>0.990)，實時熒光定量PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證。

1.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)實時熒光定量PCR測得的C值，采用2–ΔΔCt法(Schmittgen, 2008)計算和基因的相對表達(dá)量。所得數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進(jìn)行Duncan′s多重比較，分析各基因表達(dá)量在鹽度脅迫處理不同時間點的差異水平，若<0.05，為差異顯著；若<0.01，則差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 松江鱸基因序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI SRA數(shù)據(jù)庫登錄號：SRP103494)獲取松江鱸和的序列信息，其中開放閱讀框分別為3030 bp和3177 bp (圖1)，利用DNAMAN軟件對ATP1A3和ATP2B1氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，ATP1A3和ATP2B1的一致性為21.42%。種間序列比對結(jié)果表明，松江鱸ATP1A3氨基酸序列與圓鰭魚()物種間一致性最高(98.81%)，其次為狼鰻() (98.22%)、黃金鱸() (96.53%)；松江鱸ATP2B1氨基酸序列與牙鲆()物種間一致性最高(88.77%)，其次為大黃魚(83.92%)、圓鰭魚(80.94%)。

基于已報道的硬骨魚類及其他高等脊椎動物ATP1A3和ATP2B1氨基酸序列進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，和基因分別聚類形成獨立的分支(圖2)。在各基因的聚類中，硬骨魚類均聚為一支，兩棲類、鳥類和哺乳類等高等脊椎動物則聚為另一支。在基因中，松江鱸先與鲉形目的圓鰭魚聚為一支，再與鱸形目的狼鰻()聚為一支，之后與其他鱸形目物種所形成的分支聚類，最后與鯉形目的斑馬魚()聚類；在基因中，松江鱸先與鲉形目的圓鰭魚聚為一支，再與鱸形目的狼鰻聚為一支，之后與其他鱸形目及鰈形目的物種所形成的分支聚類，最后與鯉形目的斑馬魚聚為硬骨魚類。

2.2 鰓組織ATP1A3和ATP2B1的表達(dá)情況

松江鱸鰓組織和表達(dá)量的變化趨勢在2種低鹽脅迫處理下存在一定差異，同一基因表達(dá)量間均無顯著相關(guān)性(<0.80)。鹽度漸變低鹽脅迫組中，表達(dá)量在24 h顯著升至最高，為0 h的2.9倍，48 h則顯著降低；在鹽度驟變低鹽脅迫組中，表達(dá)量在24 h顯著降低，在48 h達(dá)到最小值。鹽度漸變低鹽脅迫組中，表達(dá)量在24 h顯著升高，為0 h的2.7倍；鹽度驟變低鹽脅迫組中，表達(dá)量呈顯著上升趨勢，且各時間點的表達(dá)量相比較0 h均顯著升高(圖3)。

圖1 松江鱸ATP1A3和ATP2B1基因編碼的氨基酸序列

圖2 基于ATP1A3和ATP2B1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 鹽度漸變低鹽脅迫和驟變低鹽脅迫下松江鱸鰓中ATP1A3和ATP2B1基因的相對表達(dá)量

2.3 腸組織ATP1A3和ATP2B1表達(dá)情況

松江鱸腸的表達(dá)模式在2種低鹽脅迫下基本一致，表達(dá)模式存在一定差異，同一基因表達(dá)量間呈均顯著正相關(guān)(=0.82，0.92)。鹽度漸變和驟變2種低鹽脅迫下，表達(dá)量均在24 h顯著降低，分別為0 h的42%和54%。與0 h相比較，鹽度漸變低鹽脅迫組中表達(dá)量呈顯著上升趨勢，且各時間點的表達(dá)量均顯著升高；鹽度驟變低鹽脅迫處理下，表達(dá)量在24 h顯著升高(圖4)。

圖4 鹽度漸變低鹽脅迫和驟變低鹽脅迫下松江鱸腸中ATP1A3和ATP2B1基因的相對表達(dá)量

2.4 腎臟組織ATP1A3和ATP2B1的表達(dá)情況

松江鱸腎臟組織和表達(dá)量的變化趨勢在2種低鹽脅迫處理下存在一定差異，同一基因表達(dá)量間均無顯著相關(guān)性(<0.80)。鹽度漸變低鹽脅迫組中，和的表達(dá)量均在24 h顯著升高并達(dá)到最大值，分別為0 h表達(dá)量的4.7倍和3.6倍；鹽度驟變低鹽脅迫組中，表達(dá)量在各時間點的表達(dá)量相比較0 h均顯著升高，表達(dá)量在12 h和24 h時顯著升高(圖5)。

2.5 肝臟組織ATP1A3和ATP2B1的表達(dá)情況

松江鱸肝臟組織中和表達(dá)量變化趨勢在2種低鹽脅迫處理下存在一定差異，表達(dá)量之間顯著相關(guān)(=0.98)。鹽度漸變下，2個基因的表達(dá)量均無顯著變化。鹽度驟變下，表達(dá)量呈顯著持續(xù)增長趨勢，表達(dá)量在48 h極顯著升高，2個基因的表達(dá)量均在48 h達(dá)到最大值，分別為0 h的4.1倍和7.2倍(圖6)。

圖5 鹽度漸變低鹽脅迫和驟變低鹽脅迫下松江鱸腎臟中ATP1A3和ATP2B1基因的相對表達(dá)量

圖6 鹽度漸變低鹽脅迫和驟變低鹽脅迫下松江鱸肝臟中ATP1A3和ATP2B1基因的相對表達(dá)量

3 討論

為了揭示Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在魚類應(yīng)對鹽度脅迫過程中的作用，本研究比較分析了2種低鹽脅迫處理下，松江鱸不同組織和表達(dá)量的變化情況。在2種低鹽脅迫處理下，鰓、腸、腎臟和肝臟組織中2個目標(biāo)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，推測其原因，可能是組織器官的功能特性導(dǎo)致應(yīng)對低鹽脅迫的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制不同。鰓作為魚類的呼吸器官，與環(huán)境介質(zhì)的接觸面積大，對水環(huán)境的變化最為敏感(Suresh, 1984)。鹽度漸變低鹽脅迫處理下，松江鱸鰓組織通過基因的表達(dá)調(diào)節(jié)滲透壓來應(yīng)對低鹽脅迫，表達(dá)量先上升后下降，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是鹽度漸變低鹽脅迫時間的延長對的表達(dá)產(chǎn)生抑制。而在鹽度驟變處理下，表達(dá)量顯著下降，表達(dá)量顯著上升。黃姑魚()在受到低鹽脅迫時，其鰓絲中Na+/K+-ATP酶活力呈先增強(qiáng)后恢復(fù)的趨勢，且短時間內(nèi)Ca2+-ATP酶活力也顯著上升(施兆鴻等, 2015)。四指馬鲅()幼魚鰓絲組織中Na+/K+-ATP酶活力亦先增強(qiáng)后逐漸趨于穩(wěn)定(羅海忠等, 2015)。這表明鹽度驟變對鰓中2個目標(biāo)基因表達(dá)水平的影響更為顯著。

腸道作為魚類滲透壓調(diào)節(jié)的另一重要場所，對水環(huán)境變化的響應(yīng)也較為靈敏，在魚體應(yīng)對外界刺激過程中起到關(guān)鍵作用(孫永旭等, 2019)。主要作為ATP酶質(zhì)膜Ca2+轉(zhuǎn)運基因，通過將胞內(nèi)高Ca2+濃度調(diào)節(jié)至靜息水平來應(yīng)對低鹽脅迫，進(jìn)而在維持腸組織細(xì)胞的正常代謝過程中發(fā)揮一定作用。庚宸帆(2016)在探討刺參應(yīng)對低鹽脅迫的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，鹽度漸變低鹽脅迫處理下，松江鱸腸中表達(dá)量顯著上升，但鹽度驟變組中表達(dá)量僅在24 h顯著上升，可能是鹽度驟變所引起的應(yīng)激反應(yīng)抑制了松江鱸腸組織中的表達(dá)。鹽度改變后，青鳉魚腸道內(nèi)Na+-K+-ATPaseβ基因表達(dá)被顯著抑制(馮平等, 2006)，低鹽脅迫處理下，松江鱸腸組織中表達(dá)量均在24 h顯著降低。出現(xiàn)這種情況的原因可能是腸與鰓組織內(nèi)Na+/K+-ATP酶基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制不同，鰓組織主要通過調(diào)節(jié)與水體中離子交換來應(yīng)對低鹽脅迫，而腸組織主要通過水的吸收以應(yīng)對低鹽脅迫(Shigehisa, 2003)。

腎臟也是魚類響應(yīng)滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官。區(qū)又君等(2014)研究表明，在低鹽度時(30以下)，卵形鯧鲹()幼魚的鰓和腎臟共同完成滲透壓調(diào)節(jié)。在本研究中，松江鱸腎臟組織2個目標(biāo)基因的表達(dá)量在2種低鹽脅迫處理下均顯著升高，其中，的表達(dá)量變化更加顯著。結(jié)果表明，低鹽脅迫更顯著促進(jìn)了松江鱸腎臟組織中的表達(dá)。

肝臟作為主要的代謝器官之一，參與魚類的應(yīng)激與免疫調(diào)節(jié)，也是魚類進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵能量來源(Tamura, 2011)。大菱鲆的肝臟細(xì)胞可通過ATP的合成，促進(jìn)細(xì)胞游離鈣的釋放，從而與細(xì)胞膜嘌呤受體相互作用來適應(yīng)低滲脅迫(Ollivier, 2006)。本研究結(jié)果顯示，松江鱸肝臟組織2個目標(biāo)基因的表達(dá)量在鹽度漸變低鹽脅迫處理下無顯著變化；鹽度驟變低鹽脅迫下，的表達(dá)量呈顯著上升趨勢，表達(dá)量在48 h極顯著升高。這表明鹽度驟變低鹽脅迫同時誘導(dǎo)肝臟組織中2個目標(biāo)基因的高表達(dá)，且其表達(dá)量在一定時間內(nèi)隨著脅迫時間的延長而升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，2種低鹽脅迫處理下，和基因在松江鱸鰓、腸、腎臟和肝臟組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，且2個基因的表達(dá)量在不同時間點的表達(dá)水平存在顯著差異。由此可見，和基因在松江鱸應(yīng)對低鹽脅迫的滲透壓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步探究魚類鹽度適應(yīng)性的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

FENG P, WANG F, FAN G L. The effect of salinity on intestine Na+-K+-ATPase genes expression of medaka (). Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica. 2006, 15(6): 24–27 [馮平, 王峰, 范光麗. 鹽度對青鳉魚腸內(nèi)Na+-K+-ATPase基因表達(dá)的影響. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006, 15(6): 24–27]

GENG C F. Analysis on salinity related genes expression and histological structure of. Master′s Thesis of Dalian Ocean University, 2016 [庚宸帆. 刺參鹽度調(diào)節(jié)相關(guān)基因的定量表達(dá)及組織學(xué)分析. 大連海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2016]

HU J, YE L, WU K C,. Effect of acute salinity stress on serum cortisol and activity of Na+-K+-ATPase of juvinile. South China Fisheries Science, 2016, 12(2): 116–120 [胡靜, 葉樂, 吳開暢, 等. 急性鹽度脅迫對克氏雙鋸魚幼魚血清皮質(zhì)醇濃度和Na+-K+-ATP酶活性的影響. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2016, 12(2): 116–120]

HUANG C Y, CHAO P L, LIN H C,. Na+-K+-ATPase and vacuolar- type H+-ATPase in the gills of the aquatic air- breathing ?shin response to salinity variation. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A Molecular and Integrative Physiology, 2010, 155: 309–318

INOKUCHI M, HIROI J, WATANABE S,. Gene expression and morphological localization of NHE3, NCC and NKCC1a in branchial mitochondria-rich cells of Mozambique tilapia () acclimated to a wide range of salinities. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A Molecular and Integrative Physiology, 2008, 151(2): 151– 158

KAPLAN J H. Biochemistry of Na+/K+ATPase. Annual Review of Biochemistry, 2002, 71: 511–535

LIU Y J, ZHANG L, TIAN X Y,. The effects of salt stress on endogenous hormones, NADKase and Ca2+-ATPase in leaves ofseedlings. Pratacultural Science, 2008, 25(4): 51–54[劉延吉, 張蕾, 田曉艷, 等. 鹽脅迫對堿茅幼苗葉片內(nèi)源激素、NAD激酶及Ca2+-ATPase的效應(yīng). 草業(yè)科學(xué), 2008, 25(4): 51–54]

LUO H Z, LI W Y, FU R B,. The effects of salinity on the growth of juvenileand Na+/K+-ATP enzyme. Progress in Fishery Science, 2015, 36(2): 94–99 [羅海忠, 李偉業(yè), 傅榮兵, 等. 鹽度對四指馬鲅()幼魚生長及其鰓絲Na+/K+-ATP酶的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(2): 94–99]

MA Q, LIU X F, FENG W R,. Analyses of the molecular mechanisms associated with salinity adaption ofthrough combined iTRAQ-based proteomics and RNA sequencing-based transcriptomics. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2018, 136: 40–53

MCCORMICK S D, REGISH A, SHRIMPTON J M. Are we missing a mineralocorticoid in teleost ?sh? Effects of cortisol, deoxycorticosterone and aldosterone on osmoregulation, gill Na+-K+-ATPase activity and isoform mRNA levels in Atlantic salmon. General and Comparative Endocrinology, 2008, 157: 35–40

OLLIVIER H, PICHAVANT-RAFINI K, PUILL-STEPHAN E,. Effects of hypo-osmotic stress on ATP release in isolated turbot () hepatocytes. Biology of the Cell, 2006, 98(7): 427–437

OU Y J, FAN C Y, LI J E,. Effects of salinity on the osmoregulation and weight loss from starvation injuvenile. Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(24): 7436–7443 [區(qū)又君, 范春燕, 李加兒, 等. 鹽度對卵形鯧鲹幼魚滲透壓調(diào)節(jié)和饑餓失重的影響. 生態(tài)學(xué)報, 2014, 34(24): 7436–7443]

SCHMITTGEN T D, LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101–1108

SHI Z H, HUANG X X, FU R B,. Salinity stress on embryos and early larval stages of the pomfret. Aquaculture, 2008, 275(1/2/3/4): 306–310

SHI Z H, LIAO Y L, WANG X S,. Impact of the abrupt salinity decrease on ion-regulation enzyme activity in the gill and serum osmolality from. Journal of Safety and Environment , 2017, 17(3): 1210–1214 [施兆鴻, 廖雅麗, 王孝杉, 等. 鹽度脅迫對云紋石斑魚鰓離子調(diào)節(jié)酶及滲透壓的影響. 安全與環(huán)境學(xué)報, 2017, 17(3): 1210–1214]

SHI Z H, ZHANG C J, PENG S M,. Effects of low-salinity stress on the ion regulation, respiratory metabolic enzymes and serum cortisol in the gill ofjuvenile. Progress in Fishery Science, 2015, 36(6): 22–28 [施兆鴻, 張晨捷, 彭士明, 等. 低鹽脅迫對黃姑魚()幼魚鰓離子調(diào)節(jié)、呼吸代謝酶和皮質(zhì)醇的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(6): 22–28]

SHIGEHISA H, TOYOJI K, NOBUKO N,. Molecular biology of major components of chloride cells. Comparative Biochemistry and Physiology Part B Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 136: 593–620

SUN Y X, DONG H B, DUAN Y F,. Progresses in stress damage and protection studies on fish intestine. Transactions of Oceanology and Limnology, 2019(3): 174–183 [孫永旭, 董宏標(biāo), 段亞飛, 等. 魚類腸道應(yīng)激及其損傷防護(hù)研究進(jìn)展. 海洋湖沼通報, 2019(3): 174–183]

SURESH N, JAYARAMANI J. The adaptation to salinity: Response of fish gill mitochondria to salinity stress. Journal of Bioenergetics, 1984, 15(6): 363–377

TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N,. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731?2739

WANG J Q. Advances in studies on the ecology and reproductive biology ofHeckel. Acta Hydrobiologica Sinica, 1999, 23(6): 729–734 [王金秋. 松江鱸的生態(tài)學(xué)和繁殖生物學(xué)的研究進(jìn)展. 水生生物學(xué)報, 1999, 23(6): 729–734]

WANG K, YANG Q, LU K J,. Effect ofon the activity of Na+, K+-ATPase and Ca2+, Mg2+-ATPase in different tissues of trained rats. Journal of Northwest University (Natural Science), 2010, 40(6): 1031–1035 [王珂, 楊茜, 蘆楷鈞, 等. 沙苑子提取物對運動訓(xùn)練大鼠不同組織Na+, K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase活性的影響. 西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 40(6): 1031–1035]

WANG T, MIAO L, LI M Y,. Effects of abrupt salinity decrease on serum physiology, biochemistry and gill Na+/K+- ATPase activity of the large yellow croaker. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2013, 44(2): 421–426 [王濤, 苗亮, 李明云, 等. 突降鹽度脅迫對大黃魚()血清生理生化及鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的影響. 海洋與湖沼, 2013, 44(2): 421–426]

WANG Y W, WILSON C, CARTWRIGHT E J,. Plasma membrance Ca2+-ATPase 1 is required for maintaining atrial Ca2+homeostasis and electorphysiological stability in the mouse. Journal of Physiology, 2017, 595(24): 7383–7389

ZHANG X Y, WEN H S, ZHANG K Q,. Analysis of the isotonic point and effects of seawater desalination on the Na+/K+/Cl–concentration, Na+-K+-ATPase activity and relative gene expressions in. Journal of Fisheries of China, 2018, 42(8): 1199–1208 [張曉燕, 溫海深, 張凱強(qiáng), 等. 花鱸等滲點分析及海水淡化對Na+/K+/Cl–濃度、Na+-K+-ATP酶活性及基因表達(dá)的影響. 水產(chǎn)學(xué)報, 2018, 42(8): 1199–1208]

Effects of Low Salinity Stress on the Expression Profiling ofandin the Roughskin Sculpin ()

MAO Feifan1, KUANG Jiehua1, MA Qian1①, ZHOU Qiling1, LI Ang2, LIU Xinfu2, ZHUANG Zhimeng2

(1. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524025, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao, Shandong 266071, China)

This study explored the roles of ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 3 () and ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+transporting 1 () in the low-salinity stress response of(roughskin sculpin).andgene sequences were obtained from thetranscriptome data, and a phylogenetic analysis was performed. Roughskin sculpins were subjected to two acute osmotic salt treatments (salinity change rates of 27/h and 1.1/h) to induce stress, and the expression patterns of the target genes in four tissues (gill, intestine, kidney, and liver) were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The phylogenetic analysis showed that theandgenes formed an independent cluster, and theandproteins shared a high identity with those of Perciformes and Pleuronectiformes species. The teleost ATP1A3 and ATP2B1 proteins formed a single distinct lineage from other vertebrates. For both genes, each tissue had its own gene expression pattern in response to salinity. In the gills,expression increased and then decreased under chronic salinity stress, butexpression significantly decreased under acute stress.expression increased under chronic and acute stress (with a significant increase after 24 h of chronic stress). In the intestines,expression significantly decreased after 24h in both treatments, but theexpression significantly increased under chronic stress and increased after 24 h of acute stress. In the kidneys, the expression levels of both genes peaked after 24 h of chronic stress and increased significantly under acute stress.andexpression was undetected in the liver under chronic stress, but under acute stress, incremental expression was detected for both genes. These results demonstrate that theandgene expression profiles are affected by salinity stress but not in the same way. These findings provide a foundation for future investigations into the role ofandin fish osmotic pressure regulation and the molecular mechanisms underlying migratory fish salinity adaptation.

; Salinity stress;;; Gene expression patterns

MA Qian, E-mail: maq@gdou.edu.cn

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0033-09

10.19663/j.issn2095-9869.20200726001

http://www.yykxjz.cn/

毛非凡, 鄺杰華, 馬騫, 周啟苓, 李昂, 劉新富, 莊志猛. 低鹽脅迫下松江鱸和基因的表達(dá)變化規(guī)律. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 33–41

MAO F F, KUANG J H, MA Q, ZHOU Q L, LI A, LIU X F, ZHUANG Z M. Effects of low salinity stress on the expression profiling ofandin the roughskin sculpin (). Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 33–41

馬 騫，副研究員，E-mail: maq@gdou.edu.cn

2020-07-26,

2020-08-19

*國家自然科學(xué)基金項目(31772828)和青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(14-2-4-15-jch)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31772828), and Qingdao Applied Basic Research Project (14-2-4-15-jch)]. 毛非凡，E-mail: 435230060@qq.com

(編輯 馮小花)