microRNA-1診斷支氣管哮喘急性發(fā)作及預(yù)測(cè)激素治療敏感性的價(jià)值

陳迪，戴標(biāo)，陳如華

支氣管哮喘（哮喘）是一種常見(jiàn)的以反復(fù)發(fā)作性喘息、可逆的氣流受限和隨著病程延長(zhǎng)而導(dǎo)致的氣道結(jié)構(gòu)改變（即氣道重塑）為主要特征的慢性氣道炎癥性疾病。其病理特征為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及氣道黏膜下層CD4+T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的長(zhǎng)期浸潤(rùn)，其中大多數(shù)哮喘的氣道炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞增多為主［1］。此類(lèi)哮喘經(jīng)激素治療后癥狀可明顯減輕；少部分以非嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的哮喘，對(duì)激素治療不敏感。哮喘的病因復(fù)雜且發(fā)病機(jī)制不清楚。最近的研究表明，哮喘是一種多基因遺傳病，由遺傳基因與環(huán)境因素交互作用導(dǎo)致［2］。尋找有助于哮喘診斷或療效預(yù)測(cè)的相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物有利于改善患者預(yù)后。多種血清微小RNA（microRNA，miR）已作為基因靶標(biāo)或生物學(xué)標(biāo)志物用于疾病的研究與臨床診療［3-4］，而關(guān)于miR-1與支氣管哮喘關(guān)系的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，已有研究通過(guò)靶標(biāo)miR-1和miR-145抑制哮喘小鼠模型上肺部炎癥［5］。也有研究發(fā)現(xiàn)，兒童急性哮喘發(fā)作時(shí)外周血miR-1表達(dá)水平較健康兒童降低，并隨著疾病嚴(yán)重程度的加重而降低，其可以用作判斷哮喘惡化和評(píng)估疾病嚴(yán)重程度的輔助指標(biāo)［6］。但是，針對(duì)支氣管哮喘成人患者群體miR-1表達(dá)水平的相關(guān)研究尚不多見(jiàn)。本研究旨在評(píng)估血清miR-1表達(dá)水平對(duì)成人支氣管哮喘急性發(fā)作和激素治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 納入2018年6月—2019年6月宜興市人民醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科病房收住的支氣管哮喘急性發(fā)作期患者72例并作為觀察組，其中男41例，女31例，年齡15～61歲，平均（37.18±11.84）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：哮喘診斷符合2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組支氣管哮喘防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，根據(jù)2017年版全球哮喘防治創(chuàng)議（Global Initiative for AsIhma，GINA）中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行哮喘治療方案的確定和哮喘控制分級(jí)?；颊?2 h內(nèi)未吸入或服用糖皮質(zhì)激素、β-受體激動(dòng)劑、白三烯拮抗劑、茶堿類(lèi)、抗組胺及抗膽堿能類(lèi)藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有糖尿病、肝膽腎疾病、胃腸道疾病、心臟病、過(guò)敏性疾病、濕疹、血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤等疾病。（2）6個(gè)月內(nèi)曾行手術(shù)治療。（3）合并有其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病。（4）入選前4周內(nèi)使用過(guò)抗菌藥物。（5）入選前4周內(nèi)使用過(guò)免疫抑制劑。（6）配合度極差者。觀察組根據(jù)臨床診療分為無(wú)吸入性糖皮質(zhì)激素（無(wú)ICS組）患者16例、激素敏感型（SS組）患者45例和激素抵抗型（SR組）患者11例。其中SR組在排除誘發(fā)哮喘的各類(lèi)因素后經(jīng)足量規(guī)范使用激素治療（如口服潑尼松≥40 mg/d）2周后，第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）較治療前改善小于15%［8-9］。另外，收集同期門(mén)診健康體檢者30例作為對(duì)照組，其中男15例，女15例，年齡17～64歲，平均（39.53±14.20）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)過(guò)敏性疾病、哮喘家族史、哮喘史，且受試期間無(wú)呼吸道感染病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有糖尿病、肝膽腎疾病、胃腸道疾病、心臟病、過(guò)敏性疾病、血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤等疾病。（2）6個(gè)月內(nèi)行手術(shù)治療者。（3）配合度極差者。各組間年齡、性別比例、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。本研究通過(guò)了宜興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：倫審2021文050），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

Tab.1 Comparison of baseline data between the four groups表1 各組基線資料比較

1.2標(biāo)本收集 抽取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，其中SS組、SR組于激素治療2周后抽取，取血后1 h內(nèi)4℃、4 000 r/min離心5 min分離血清，取上清液置于5 mL離心管中，進(jìn)一步4℃、4 000 r/min離心10 min，吸出上清液，將其置于無(wú)酶離心管后，-80℃低溫保存。

1.3miR-1表達(dá)水平測(cè)定 使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)血清中miR-1表達(dá)水平。采用TRIzol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，按說(shuō)明操作）提取血清總RNA，采用iScript cDNA合成試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司，按說(shuō)明操作）通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在7900 HT熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）上按照操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR。miR-1引物序列：上游5′-GGGGTGGAATGTAAAGAA-3′，下游5′-TGCGTGTCGTG?GAGTC-3′。以U6小核RNA（small nuclear-RNA，snRNA）為內(nèi)參照，U6引物序列：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATAC?TAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，反應(yīng)體系為20μL（SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒），包括1μL cDNA反應(yīng)液，5μL 10×PCR緩沖液，5μL 2 mmol/L 4×dTaqDNA聚合酶，9μL水。反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，42個(gè)循環(huán)，60℃退火20 s，最后70℃延伸60 s。每份樣本均采用相同反應(yīng)體系及條件做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增3次檢測(cè)miR-1，并使用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4炎性因子水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（IL）-5、IL-6、IL-8、免疫球蛋白E（IgE）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）水平。IL-6、IL-8、IgE試劑盒購(gòu)自晶美生物科技有限公司；TNF-α試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；IFN-γ試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。檢測(cè)步驟均按試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作。

1.5呼出氣一氧化氮（FeNO）檢測(cè) 使用無(wú)錫市尚沃醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的納庫(kù)倫呼氣分析儀（Sunvou-CA2122型），由經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的技師嚴(yán)格按照操作指南測(cè)定每個(gè)研究對(duì)象的FeNO值（測(cè)定單位為ppb，1 ppb=1×10-9）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。分類(lèi)變量以例或例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)miR-1在協(xié)助診斷支氣管哮喘急性發(fā)作方面的價(jià)值，以及miR-1在預(yù)測(cè)支氣管哮喘患者激素治療敏感性方面的價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者miR-1、炎性因子的表達(dá)水平及FeNO水平比較 與對(duì)照組相比，無(wú)ICS組IL-5、IgE、TNFα及FeNO水平顯著升高（P＜0.05）；SS組IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α和FeNO水平進(jìn)一步升高（P＜0.05），而miR-1和外周血IFN-γ的表達(dá)水平顯著降低；SR組miR-1、IFN-γ水平顯著降低，IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。SR組miR-1及FeNO水平較SS組明顯下降，IgE升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.2 哮喘患者miR-1表達(dá)水平與炎性因子和FeNO的相關(guān)性 72例哮喘急性發(fā)作期患者的外周血miR-1與IFN-γ呈正相關(guān)（rs=0.867，P＜0.01），而與IL-5、IL-6、IL-8、IgE、TNF-α、FeNO呈負(fù)相關(guān)（rs分別為-0.714、-0.709、-0.761、-0.671、-0.750、-0.502，均P＜0.01）。

2.3 miR-1表達(dá)水平診斷哮喘及預(yù)測(cè)糖皮質(zhì)激素治療敏感度的價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血清miR-1用于區(qū)分哮喘患者與健康人敏感度和特異度分別為0.764和0.700，曲線下面積（AUC）為0.794，可作為診斷哮喘的潛在生物標(biāo)志物。除miR-1外，炎性因子、FeNO等也可以一定程度上區(qū)分健康狀態(tài)及急性支氣管哮喘發(fā)作，其中TNF-α診斷效能較高，略低于miR-1。miR-1與IFN-γ聯(lián)合診斷的效能較高，見(jiàn)表3。

Tab.2 Comparison of levels of miR-1,inflammatory factors and FeNO between the four groups表2 各組miR-1、炎性因子及FeNO等指標(biāo)水平比較 ［M（P25，P75）］

Tab.3 The predictive values of miR-1,inflammatory factors and FeNO in the diagnosis of asthma表3 miR-1、炎性因子及FeNO對(duì)哮喘的診斷價(jià)值（n=102）

對(duì)使用糖皮質(zhì)激素治療患者的ROC曲線分析顯示，miR-1預(yù)測(cè)激素治療敏感性的AUC為0.797，敏感度稍差，但特異度較高；而FeNO的預(yù)測(cè)價(jià)值稍高于miR-1，但特異度稍弱于前者。其他炎癥指標(biāo)對(duì)激素敏感度無(wú)預(yù)測(cè)價(jià)值。聯(lián)合預(yù)測(cè)時(shí)，雖然miR-1聯(lián)合IFN-γ的診斷價(jià)值最高，但鑒于炎性因子的單因素分析結(jié)果均無(wú)意義（無(wú)預(yù)測(cè)價(jià)值），因此認(rèn)為miR-1聯(lián)合FeNO的預(yù)測(cè)價(jià)值更高，優(yōu)于單指標(biāo)的預(yù)測(cè)效能，見(jiàn)表4。

Tab.4 The predictive values of miR-1,inflammatory factors and FeNO on the sensitivity of asthma patients with glucocorticoid therapy表4 miR-1、炎性因子及FeNO對(duì)哮喘患者使用激素治療敏感性的預(yù)測(cè)價(jià)值 （n=56）

3 討論

3.1 miR表達(dá)在哮喘發(fā)病中的可能作用機(jī)制 哮喘是一種源于多基因與環(huán)境相互作用的異質(zhì)性和復(fù)雜性疾病，盡管其具體機(jī)制尚未完全闡明，但有研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制以非特異性的支氣管超反應(yīng)性增加為基礎(chǔ)，且與異常的免疫應(yīng)答有密切聯(lián)系［10］。目前已有研究證明，miRNA在哮喘的診斷及治療中發(fā)揮著重要作用［11］。miR是一種非編碼的單鏈小RNA，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，由內(nèi)源基因編碼，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR在人類(lèi)的各種生理過(guò)程以及多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括癌癥、內(nèi)分泌和自身免疫性疾病等［12-13］。因此，多種miR已作為基因靶標(biāo)或生物學(xué)標(biāo)志物用于臨床診斷和治療。目前已知miR可通過(guò)調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞中基因的表達(dá)，從而影響哮喘的特征性炎性因子分泌［14-16］。目前miR的具體分子生物學(xué)功能尚不清楚，但外周循環(huán)中的miRs是有價(jià)值的診斷標(biāo)志，如果可以控制其在外周血中水平，則可能為控制哮喘提供一種新方法。

近年來(lái)針對(duì)引起哮喘患者激素抵抗的相關(guān)研究逐漸增多，其中比較常見(jiàn)的機(jī)制研究包括基因易感性、慢性精神應(yīng)激、激素的受體前代謝、糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的改變、糖皮質(zhì)激素受體β（GRβ）表達(dá)增多以及激活蛋白（AP）1增多等［17-18］。miR-1最初被認(rèn)為在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)［5］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1、miR-126、miR-155等miRs可以通過(guò)調(diào)控輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2（Th1/Th2）細(xì)胞亞群分化來(lái)參與哮喘發(fā)病的全過(guò)程［5，19-20］。Th2細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)病與進(jìn)展，其細(xì)胞功能亢進(jìn)與哮喘患者的通氣受限、氣管炎癥和氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)，同時(shí)Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)也是哮喘患者激素抵抗的機(jī)制之一［21］。

3.2 miR-1以及炎性因子對(duì)哮喘急性發(fā)作的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘急性發(fā)作患者中SS型和SR型患者外周血miR-1的表達(dá)水平和Th1表達(dá)的細(xì)胞因子IFN-γ水平顯著降低，而Th2表達(dá)的細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-8以及TNF-α水平均高于對(duì)照組，這些變化提示SS型和SR型患者的Th1/Th2細(xì)胞功能可能失衡。相關(guān)性分析顯示，miR-1與IFN-γ呈正相關(guān)，與IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α、IgE呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR-1的下調(diào)可能通過(guò)影響Th1/Th2平衡，導(dǎo)致Th1細(xì)胞功能異常，引起Th1釋放的IFN-γ水平降低以及TNF-α水平異常增高；同時(shí)，Th2細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)表達(dá)使TNF-α、IL-5、IL-6以及IL-8等Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平升高，并使B淋巴細(xì)胞激活分泌IgE，進(jìn)一步引起IL-6增多。IgE及IL等細(xì)胞因子作用于肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等，使這些細(xì)胞分泌多種活性介質(zhì)及炎性因子，導(dǎo)致氣道慢性炎癥并引起哮喘。炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子可損傷氣道上皮，造成神經(jīng)末梢裸露，最終引起氣道的高反應(yīng)性。Takyar等［22］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予卵清蛋白（ova）誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠miR-1的類(lèi)似物后，氣管炎癥較前減輕，并且支氣管灌洗液中Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13的水平下降，miR-1的類(lèi)似物可能通過(guò)血漿血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-血清微小RNA-1-血小板生成素受體-P選擇素（vegf-miR-1-Mpl-P-selectin）效應(yīng)器通路來(lái)降低氣道炎癥。

3.3 miR-1表達(dá)水平對(duì)糖皮質(zhì)激素治療敏感度的預(yù)測(cè)價(jià)值 本研究顯示，SR組miR-1的表達(dá)水平較SS組及無(wú)ICS組下調(diào)更明顯，ROC分析提示檢測(cè)外周血miR-1或可以成為預(yù)測(cè)糖皮質(zhì)激素治療敏感性的新指標(biāo)，且本研究中哮喘急性期患者外周血miR-1水平與FeNO水平呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果還表明，miR-1預(yù)測(cè)糖皮質(zhì)激素治療具有較高的特異度，而FeNO的診斷價(jià)值稍高于miR-1，但特異度稍弱，其他炎癥指標(biāo)對(duì)激素敏感度的預(yù)測(cè)價(jià)值較低。而在進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)時(shí)，miR-1聯(lián)合IFN-γ的預(yù)測(cè)價(jià)值最高。鑒于炎性因子的單因素分析結(jié)果均無(wú)意義，可認(rèn)為miR-1聯(lián)合FeNO的預(yù)測(cè)價(jià)值更高，且聯(lián)合診斷的效能優(yōu)于單指標(biāo)診斷效能。FeNO能夠一定程度上反映氣道的炎癥程度。有研究認(rèn)為，炎性因子IL-13等可上調(diào)上皮細(xì)胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）基因和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致FeNO水平升高［23］。目前，臨床上一般通過(guò)檢測(cè)FeNO來(lái)預(yù)測(cè)哮喘患者的激素治療敏感性［24］。目前激素抵抗型哮喘的具體機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為可能與糖皮質(zhì)激素受體（hGR）以及多種抗炎機(jī)制的異常等相關(guān)，其中炎性因子IL-2、IL-4等在T細(xì)胞hGR的抵抗中起重要作用，miR-1可能通過(guò)調(diào)控Th細(xì)胞表達(dá)，繼而引起炎性因子的異常表達(dá)等機(jī)制參與哮喘的激素抵抗［25］。由于本研究樣本量較小，可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，今后尚需進(jìn)一步開(kāi)展多中心、大樣本的相關(guān)研究予以證實(shí)。

綜上所述，支氣管哮喘患者血清中miR-1表達(dá)降低，其有望成為診斷哮喘急性發(fā)作的潛在生物標(biāo)志物；糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘患者外周血中的miR-1含量進(jìn)一步降低，提示其可作為預(yù)測(cè)激素治療敏感度的檢測(cè)指標(biāo)之一。然而，由于本研究樣本量偏小，尤其是納入的激素抵抗型組病例僅11例，可能影響結(jié)論的準(zhǔn)確性。另外，由于本研究的檢測(cè)方法、分析方法所限，檢測(cè)結(jié)果的精確性可能欠佳。今后需要開(kāi)展更進(jìn)一步的研究，以期明確miR-1具體作用機(jī)制。