DNMT1通過下調(diào)SOX1表達(dá)參與宮頸癌生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

智艷芳，張婷，劉慧，曾憲旭，班振英，張威

宮頸癌（cervical carcinoma，CC）是女性因惡性腫瘤死亡的主要原因之一，其發(fā)生與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染密切相關(guān)，然而僅HPV感染并不足以引起CC［1］，因此CC發(fā)生發(fā)展的有關(guān)分子機(jī)制仍有待確定。表觀遺傳學(xué)修飾在腫瘤中的作用逐漸被重視，其中DNA甲基化在包括CC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)展中起著重要作用［2-3］。位于腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島高甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響腫瘤生長或轉(zhuǎn)移［4］。CpG島甲基化需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化，主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b［5］。研究顯示，DNMT1在宮頸癌變過程中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，且其高表達(dá)與患者存活率密切相關(guān)［6-7］。性別決定區(qū)Y-框1（sex determining region Y-box 1，SOX1）為腫瘤抑制基因，在CC中SOX1呈現(xiàn)高甲基化和低表達(dá)狀態(tài)［8-9］。但是，DNMT1是否通過SOX1調(diào)節(jié)CC發(fā)展進(jìn)程尚未知。本研究旨在觀察DNMT1在CC生長和轉(zhuǎn)移中的作用并分析其對SOX1的調(diào)節(jié)作用，以期為CC的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級7周齡BALB/c Nude雄性裸小鼠18只，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華公司。CC組織及癌旁組織均來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，患者組織離體后，迅速置于液氮中冷凍，然后放入-80℃冰箱中保存待用（患者已簽署知情同意書）。HeLa229、ME-180、SiHa、SW756宮頸癌細(xì)胞和Ect1/E6E7宮頸上皮細(xì)胞均購自美國ATCC細(xì)胞資源中心。EMEM培養(yǎng)基購自南京維森特生物技術(shù)有限公司；McCoy′s 5a培養(yǎng)基、Leibovitz L-15培養(yǎng)基、Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基均購自南京信帆生物技術(shù)有限公司。DNA提取試劑盒、EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒、EpiTect MethyLight PCR試劑盒購自Qiagen公司，LipofectamineTM3000試劑盒及引物購自Invitrogen公司；DNMT1-siRNA質(zhì)粒及空質(zhì)粒由上海吉瑪公司構(gòu)建；DNMT1、Cyclin D1、β-catenin兔單抗購自CST公司；山羊抗兔IgG（HRP）、c-Myc兔單抗、β-actin兔單抗、SOX1兔單抗、Histone H3兔多抗均購自Abcam公司；電泳儀、多功能酶標(biāo)儀購自BioRad公司；Rotor-Gene Q PCR儀購自Qiagen公司；顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HeLa229、SiHa細(xì)胞采用EMEM培養(yǎng)基［含10%胎牛血清（FBS）］，ME-180細(xì)胞采用McCoy′s 5a培養(yǎng)基（含10%FBS），SW756細(xì)胞采用Leibovitz L-15培養(yǎng)基（含10%FBS），Ect1/E6E7細(xì)胞采用Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基［含0.1μg/L人重組表皮生長因子（EGF）和10%FBS］，置于5%CO2培養(yǎng)箱中（37℃）培養(yǎng)，收集對數(shù)期以上宮頸細(xì)胞，設(shè)置為HeLa229組、ME-180組、SiHa組、SW756組和Ect1/E6E7組。HeLa229、SW756細(xì)胞DNMT1蛋白表達(dá)水平較高，收集對數(shù)生長期HeLa229、SW756細(xì)胞，采用LipofectamineTM3000脂質(zhì)體將空質(zhì)粒和DNMT1-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，另設(shè)不轉(zhuǎn)染細(xì)胞的對照組，即DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組。

1.3Western blot檢測DNMT1、SOX1蛋白表達(dá) 通過蛋白裂解液裂解CC組織、癌旁組織及各組細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測定所提蛋白的濃度。分別取40μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)奶粉封閉后與一抗DNMT1（1∶1 000）、Cyclin D1（1∶500）、β-catenin（1∶1 000）、c-Myc（1∶500）、β-actin（1∶5 000）、SOX1（1∶1 000）、Histone H3（1∶2 000）4℃過夜孵育，經(jīng)TBST洗膜后與二抗羊抗兔IgG（HRP，1∶5 000）室溫孵育35 min，ECL法曝光拍照并分析各檢測蛋白條帶的灰度值。

1.4亞硫酸氫鹽定量PCR測定SOX1甲基化水平 通過DNA提取試劑盒提取CC組織、癌旁組織及各組細(xì)胞的基因組DNA，并使用EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒對其進(jìn)行修飾，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。以修飾后的基因組DNA為模板，使用EpiTect MethyLight PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，甲基化比例=［甲基化DNA的拷貝數(shù)/（甲基化+未甲基化DNA的拷貝數(shù)）］×100%。SOX1甲基化引物上游5′-GCGTTTTTTTTTTTTCGTTATTGGC-3′，下 游5′-CGC?GCTATCTCCTTCCTCCTACG-3′，產(chǎn)物大小154 bp；SOX1未甲基化引物上游5′-TGTGTTTTTTTTTTTTTGTTATTGG-3′，下游5′-TACACACTATCTCCTTCCTCCTACACTC-3′，產(chǎn)物大小156 bp。

1.5細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖 收集DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)的密度接種至6孔板，培養(yǎng)3周后，棄去培養(yǎng)基并固定細(xì)胞，用0.5%結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)可見細(xì)胞克隆。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移和侵襲 收集DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，以每孔含5×104個(gè)的密度接種至小室上層，小室下層添加500μL EMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去小室上層的細(xì)胞，固定后用0.5%結(jié)晶紫染色并拍照，計(jì)數(shù)穿過小室上層的細(xì)胞。侵襲實(shí)驗(yàn)除先在上層小室添加100μL基質(zhì)膠凝固外，其余均參考遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

1.7裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞在體內(nèi)的生長 取DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組轉(zhuǎn)染后48 h的HeLa229和SW756細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化分離后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量并制備1.0×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將上述各組細(xì)胞注射進(jìn)裸小鼠的腋窩外側(cè)皮下，裸小鼠分為DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組，每組6只。每3 d觀察1次腋窩處腫瘤大小，3周后處死小鼠并取出腫瘤稱質(zhì)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CC組織及細(xì)胞中DNMT1、SOX1蛋白表達(dá)情況 CC組織中DNMT1蛋白表達(dá)水平（3.55±0.62）高于癌旁宮頸組織（1.65±0.27），SOX1蛋白表達(dá)水平（0.25±0.06）低于癌旁宮頸組織（2.85±0.74），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=20，t分別為12.565、15.662，均P＜0.01），見圖1。宮頸癌HeLa229、ME-180、SiHa、SW756細(xì)胞中DNMT1蛋白表達(dá)水平分別為2.76±0.32、2.57±0.27、2.46±0.39、2.83±0.45，均高于宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞（1.13±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=27.480，P＜0.01），SOX1蛋白表達(dá)水平分別為0.28±0.04、0.37±0.05、0.35±0.07、0.31±0.05，均低于Ect1/E6E7細(xì)胞（2.08±0.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=387.901，P＜0.01），見圖2。選擇DNMT1蛋白表達(dá)水平較高的HeLa229、SW756細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 DNMT1 and SOX1 protein expression in CC tissues圖1 CC組織中DNMT1、SOX1蛋白表達(dá)情況

Fig.2 DNMT1 and SOX1 protein expression in CC cells圖2 CC細(xì)胞中DNMT1、SOX1蛋白表達(dá)情況

2.2 CC組織及細(xì)胞中SOX1甲基化程度 CC組織中SOX1啟動(dòng)子區(qū)甲基化比例（%）高于癌旁宮頸組織（45.37±5.12vs.26.73±4.36；n=20，t=12.396，P＜0.01）。宮頸癌HeLa229、ME-180、SiHa、SW756細(xì)胞中SOX1啟動(dòng)子區(qū)甲基化比例（%）分別為44.46±5.34、38.15±5.26、40.24±6.0、46.85±6.17，均 高 于Ect1/E6E7細(xì)胞（21.84±4.72），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=18.924，P＜0.01）。

2.3 敲低DNMT1可抑制CC細(xì)胞生長 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細(xì)胞體外克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），裸鼠內(nèi)瘤體質(zhì)量減輕（P＜0.05），見表1、圖3。

Tab.1 Comparison of the number of HeLa229 and SW756 cell clones and tumor mass between the three groups表1 各組HeLa229和SW756細(xì)胞克隆數(shù)及瘤體質(zhì)量比較（n=6，±s）

Tab.1 Comparison of the number of HeLa229 and SW756 cell clones and tumor mass between the three groups表1 各組HeLa229和SW756細(xì)胞克隆數(shù)及瘤體質(zhì)量比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與DNMT1-NC組比較，P＜0.05；表2～4同

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229克隆數(shù)（個(gè)/視野）87.46±9.25 92.37±10.16 46.95±8.31ab 43.346＊＊瘤體質(zhì)量（g）1.58±0.37 1.62±0.41 0.27±0.08ab 34.106＊＊SW756克隆數(shù)（個(gè)/視野）117.42±13.06 124.76±12.51 61.83±11.49ab 46.425＊＊瘤體質(zhì)量（g）2.05±0.54 2.11±0.63 0.65±0.07ab 17.718＊＊

2.4 敲低DNMT1可抑制CC細(xì)胞遷移和侵襲 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少（P＜0.05），見表2、圖4。

Tab.2 Comparison of the migration and invasion numbers of HeLa229 and SW756 cells between the three groups表2 各組HeLa229和SW756細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量比較（n=6，個(gè)/視野，±s）

Tab.2 Comparison of the migration and invasion numbers of HeLa229 and SW756 cells between the three groups表2 各組HeLa229和SW756細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量比較（n=6，個(gè)/視野，±s）

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229遷移數(shù)量157.43±11.08 148.96±12.34 73.72±8.65ab 109.244＊＊侵襲數(shù)量108.46±7.79 105.29±8.26 46.82±6.59ab 128.712＊＊SW756遷移數(shù)量176.57±14.36 185.62±13.25 91.35±10.47ab 99.093＊＊侵襲數(shù)量115.33±7.65 109.81±9.07 58.73±7.16ab 91.275＊＊

Fig.3 The cell growth detected by cell cloning and nude mouse tumor formation experiments in the six groups圖3 細(xì)胞克隆和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞生長情況

2.5 敲低DNMT1對DNMT1、SOX1蛋白表達(dá)及SOX1甲基化的影響 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細(xì)胞DNMT1蛋白表達(dá)及SOX1啟動(dòng)子區(qū)甲基化比例降低，SOX1蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.4 The cell migration and invasion detected byTranswell experiment in the three groups(crystal violet staining,×200)圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.5 SOX1 and DNMT1 protein expression in each group of cells圖5 各組細(xì)胞中SOX1、DNMT1蛋白表達(dá)情況

Tab.3 Comparison of SOX1 methylation and DNMT1 and SOX1 protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表3 各組HeLa229和SW756細(xì)胞SOX1甲基化和DNMT1、SOX1蛋白表達(dá)的比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of SOX1 methylation and DNMT1 and SOX1 protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表3 各組HeLa229和SW756細(xì)胞SOX1甲基化和DNMT1、SOX1蛋白表達(dá)的比較（n=6，±s）

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F SW756 DNMT1 2.84±0.31 2.91±0.26 1.05±0.19ab 100.129＊＊甲基化（%）47.54±6.27 46.93±7.16 9.35±2.83ab 87.367＊＊SOX1 0.33±0.04 0.38±0.07 3.27±0.65ab 118.869＊＊組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229 DNMT1 2.71±0.27 2.69±0.32 0.84±0.15ab 104.951＊＊甲基化（%）45.18±5.16 43.36±4.27 10.72±2.48ab 132.693＊＊SOX1 0.26±0.05 0.31±0.06 2.84±0.52ab 141.698＊＊

2.6 敲低DNMT1可抑制Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá) 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細(xì)胞c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)減少，核/質(zhì)β-catenin下降（P＜0.05），見圖6、表4。

Fig.6 Expression of c-Myc,Cyclin D1 andβ-catenin protein in each group of cells圖6 各組細(xì)胞中c-Myc、Cyclin D1、β-catenin蛋白表達(dá)情況

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要形式，全基因組低甲基化和局部基因尤其是腫瘤抑制基因高甲基化在癌癥組織中較為常見，在癌癥進(jìn)展過程中，啟動(dòng)子的高甲基化會引起不同的腫瘤抑制基因失活，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)［10］。DNMT1為維持甲基化的重要酶，目前已在多種腫瘤中檢測到DNMT1的高表達(dá)，發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用，其中DNMT1在腫瘤前病變到胰腺癌進(jìn)展過程中表達(dá)逐漸增加，可通過維持腫瘤抑制基因啟動(dòng)子高甲基化抑制其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)胰腺癌干細(xì)胞的自我更新，有望成為胰腺癌的治療靶標(biāo)［11］。在由良性胃炎到早期的癌前病變，再到胃腸道癌的過程中，DNMT1也顯示表達(dá)逐漸增強(qiáng)的趨勢［12］。Tzelepi等［13］在前列腺癌中亦發(fā)現(xiàn)，DNMT1高表達(dá)，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中表達(dá)更高，參與腫瘤進(jìn)展過程的調(diào)控。另有研究顯示，DNMT1在大腸癌中高表達(dá)，敲除DNMT1可通過提高抑癌基因DYRK2的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［14］，也可通過降低miR-152-3p的甲基化抑制TMSB10表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌生長［15］。與Cao等［6］研究一致，本研究也在CC組織和細(xì)胞系中檢測到DNMT1高表達(dá)，敲低DNMT1可抑制HeLa229和SW756細(xì)胞的遷移、侵襲，并在體外和體內(nèi)均可抑制兩者的增殖，表明在CC進(jìn)展中DNMT1發(fā)揮促進(jìn)腫瘤作用，但其機(jī)制尚需研究。

Tab.4 Comparison of c-Myc,Cyclin D1 andβ-catenin protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表4 各組HeLa229和SW756細(xì)胞c-Myc、Cyclin D1、β-catenin蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of c-Myc,Cyclin D1 andβ-catenin protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表4 各組HeLa229和SW756細(xì)胞c-Myc、Cyclin D1、β-catenin蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229 c-Myc 2.53±0.16 2.46±0.23 1.02±0.09ab 150.991＊＊Cyclin D1 2.16±0.15 2.21±0.18 0.84±0.05ab 189.293＊＊核/質(zhì)β-catenin 1.36±0.14 1.29±0.18 0.54±0.05ab 68.246＊＊組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F SW756 c-Myc 2.82±0.24 2.93±0.18 1.25±0.12ab 152.232＊＊Cyclin D1 2.31±0.15 2.37±0.17 1.16±0.11ab 131.820＊＊核/質(zhì)β-catenin 1.57±0.16 1.46±0.21 0.73±0.15ab 40.692＊＊

SOX蛋白為一類由SOX基因編碼的調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子，可在致癌過程中充當(dāng)腫瘤抑制因子［16］。SOX1在肝癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，其低表達(dá)與患者預(yù)后不良和腫瘤進(jìn)展相關(guān)［17］。SOX1在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中均表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)SOX1可以減弱細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞分化和衰老［18］。本研究中，SOX1啟動(dòng)子區(qū)甲基化比例在CC組織和細(xì)胞系中均較高，SOX1蛋白表達(dá)均下調(diào)，與Huang等［9］報(bào)道一致。敲低DNMT1后發(fā)現(xiàn)，HeLa229和SW756細(xì)胞中SOX1啟動(dòng)子區(qū)甲基化比例降低，SOX1蛋白表達(dá)增加，推測SOX1可能是DNMT1的作用靶點(diǎn)。SOX1在乳腺癌［19］、鼻咽癌［18］、CC［20］中可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲，過表達(dá)SOX1可抑制上述腫瘤發(fā)展。Lin等［20］認(rèn)為，SOX1在CC中通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮腫瘤抑制作用；而本研究顯示，敲低DNMT1可使得HeLa229和SW756細(xì)胞中c-Myc、Cyclin D1及核/質(zhì)β-catenin蛋白表達(dá)減少，提示敲低DNMT1可能抑制Wnt/β-catenin信號通路，推測下調(diào)DNMT1表達(dá)可能通過降低SOX1啟動(dòng)區(qū)甲基化程度并上調(diào)其蛋白表達(dá)，從而抑制Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)的CC生長和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，DNMT1在CC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，可能通過維持SOX1啟動(dòng)區(qū)高甲基化并抑制其蛋白表達(dá)，促進(jìn)CC生長和轉(zhuǎn)移。然而，DNMT1不只調(diào)控單一基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，CC生長和轉(zhuǎn)移也不只通過SOX1調(diào)節(jié)。本研究僅揭示了DNMT1可能通過調(diào)節(jié)SOX1對CC生長和轉(zhuǎn)移的作用，后續(xù)還需重復(fù)驗(yàn)證，同時(shí)繼續(xù)研究DNMT1對其他抑癌基因的作用。