白藜蘆醇抑制人牙齦成纖維細胞炎癥和氧化應激的機制研究

李麗華，王玉嬌，李俊雄，李思玉，唐婉容，邱亞

慢性牙周炎（chlronic periodontitis，CP）是一種破壞性的口腔疾病，是目前成人牙齒脫落的主要原因［1］。CP以與牙齦下斑塊中的致病菌如牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）相關(guān)的慢性炎癥為特征，最終導致軟組織破壞、牙槽骨吸收和牙齒脫落。牙齦卟啉單胞菌可通過脂多糖（LPS）和炎性細胞因子刺激宿主免疫反應的發(fā)生［2］。人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGF）在牙周組織的形成、再生、功能實施和修復中起重要作用［3］。HGF的活性受免疫因子調(diào)節(jié)，同時其自身也可以產(chǎn)生細胞因子，最終參與局部炎癥［4-5］。另一方面，當活性氧（ROS）的累積超過機體的補償能力時，機體就會發(fā)生氧化應激（OS）反應。OS反應引發(fā)多種抗氧化劑和破壞性酶的異常表達，最終導致牙周膜的破壞［6］。因此，減輕炎癥和OS反應是治療CP的重要途徑。白藜蘆醇（反式-3,5,4′-三羥基茋，RSV）是一種天然的多酚植物抗毒素［7-8］。RSV可以通過負調(diào)節(jié)Toll樣受體4（TLR4）信號傳導而改善糖尿病小鼠的實驗性牙周炎［9］。在體外RSV對LPS刺激的HGF的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本文評估了RSV在LPS刺激的HGF細胞中的抗炎和抗氧化作用，并通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路活性的變化探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑 RSV（美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司）；胎牛血清（FBS，素爾生物科技有限公司）；RIPA裂解緩沖液（南京?？藸柹锟萍加邢薰荆籅CA試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司）；TLR4、MyD88、p65、p-p65、βactin和LaminB1小鼠源一抗和山羊抗小鼠二抗抗體（美國Abcam公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京全式金生物技術(shù)有限公司）；ECL化學發(fā)光底物試劑盒（廣州賽國生物科技有限責任公司）；丙二醛（MDA，A003-1-2）、超氧化物歧化酶（SOD，A001-3-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，A005-1-2）、白細胞介素（IL）-1β（H002）、IL-6（H007-1-2）、IL-8（H008）及腫瘤壞死因子（TNF）-α（H052-1）含量測定酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2儀器 蛋白電泳設(shè)備（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)、細胞培養(yǎng)箱、酶標儀、臺式低溫離心機（美國Thermo Fisher公司），光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3細胞培養(yǎng)及處理 選擇因正畸治療需拔牙且牙齦健康的志愿者（知情同意，并通過倫理審查），于拔牙時收集牙齦組織；按組織塊培養(yǎng)法［10］，使用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2和95%濕度條件下培養(yǎng)HGFs。細胞傳代至3～5代時用于后續(xù)實驗，分為實驗1和實驗2。采用完全隨機對照試驗設(shè)計方案。實驗1：將細胞分為對照組、LPS組、RSV 20組、RSV 40組、RSV 80組、LPS+RSV 20組、LPS+RSV 40組和LPS+RSV 80組。對照組細胞不做處理；LPS組細胞在融合至80%時，將P.gingivalisLPS（1 mg/L）加入無血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；RSV 20、40和80組細胞分別使用20、40和80μmol/L RSV處理24 h；LPS+RSV 20、LPS+RSV 40和LPS+RSV 80組細胞分別采用1 mg/LP.gingivalisLPS和20、40、80μmol/L RSV共處理24 h。實驗2：將細胞分為對照組、LPS組、LPS+RSV 40組、LPS+RSV 40+E5564組和LPS+E5564組。對照組、LPS組和LPS+RSV 40組細胞處理方法同實驗1；LPS+RSV 40+E5564組細胞用1 mg/LP.gingivalisLPS、40μmol/L RSV和10 nmol/L TLR4抑制劑（E5564）共處理24 h；LPS+E5564組細胞用1 mg/LP.gingivalisLPS和10 nmol/L E5564共處理24 h。

1.4HGF增殖能力檢測 使用CCK-8試劑盒檢測各組HGF增殖能力。取生長至90%的各組細胞，PBS洗滌后用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度為7×104/mL，然后以100μL/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個平行孔，接種的細胞置于37℃、5%CO2條件下孵育48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，去除每個孔中原有培養(yǎng)基，用無血清新鮮培養(yǎng)基將CCK-8溶液按照10∶1的比例進行稀釋并混勻，每孔加入100μL，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。利用酶標儀檢測各組450 nm處光密度（OD）值。

1.5Western blot分析蛋白表達水平 對數(shù)生長期的細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板（2.5×105個/mL），每孔2 mL，37℃、5%CO2過夜培養(yǎng)。分組處理后用RIPA裂解液處理各組細胞，提取總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后按照適當比例加入一抗（TLR4，MyD88，p65和p-p65；均1∶1 000）于4℃封閉過夜，第2天加入對應二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴入ECL進行曝光，曝光顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為細胞總蛋白內(nèi)參，LaminB1為細胞核蛋白內(nèi)參，計算各組蛋白質(zhì)的相對表達量。

1.6ELISA分析 使用ELISA試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、MDA和GSH-Px的含量。并使用酶標儀測量450 nm和570 nm處的OD值。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。各實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示。多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度RSV對LPS誘導的HGF增殖能力的影響 20、40和80μmol/L RSV處理HGF對細胞活力沒 有明 顯的 毒性 作 用（F=0.803，P＞0.05），見圖1。

2.2 不同濃度RSV處理對HGF炎癥和氧化應激反應的影響 LPS刺激導致IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平的增加，40和80μmol/L RSV顯著抑制了LPS誘導的HGF細胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的產(chǎn)生（P＜0.05），見表1。此外，LPS刺激顯著升高了MDA的含量，降低SOD和GSH-Px的含量（P＜0.05）。與LPS組相比，40和80μmol/L RSV處理可顯著降低MDA水平，升高SOD活性，80μmol/L RSV處理可顯著升高GSH-Px活性（P＜0.05），見表2。

Fig.1 The effect of resveratrol on the viability of HGFs圖1 RSV對HGF增殖能力的影響

Tab.1 Effects of RSV on inflammatory factor expression in HGFs表1 各組對HGF細胞炎性因子表達的影響（n=3，ng/L，±s）

Tab.1 Effects of RSV on inflammatory factor expression in HGFs表1 各組對HGF細胞炎性因子表達的影響（n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.05；表2、3同

組別對照組LPS組LPS+RSV 20組LPS+RSV 40組LPS+RSV 80組F IL-1β 10.548±0.490 15.001±0.600a 14.614±0.577 12.800±0.566b 11.868±0.278b 28.955＊＊IL-6 2.315±0.252 3.514±0.210a 3.230±0.194 2.983±0.214b 2.590±0.202b 15.023＊＊IL-8 9.188±0.910 14.779±0.915a 13.500±0.541 12.851±0.764b 12.174±0.570b 22.753＊＊TNF-α 4.839±0.247 6.188±0.128a 5.760±0.202b 5.409±0.222b 5.142±0.082b 23.825＊＊

Tab.2 Effects of different concentrations of RSV on oxidative stress in HGF cells表2各組對MDA、SOD和GSH-Px活性的影響（±s）

Tab.2 Effects of different concentrations of RSV on oxidative stress in HGF cells表2各組對MDA、SOD和GSH-Px活性的影響（±s）

組別對照組LPS組LPS+RSV 20組LPS+RSV 40組LPS+RSV 80組F n3 3 3 3 3 MDA（μmol/L）0.468±0.053 0.681±0.018a 0.610±0.056 0.575±0.074b 0.504±0.015b 8.433＊＊SOD（μg/L）20.217±1.819 14.393±1.024a 15.248±1.068 16.773±1.134b 18.190±0.920b 10.651＊＊GSH-Px（μg/L）21.128±0.522 16.274±0.949a 16.949±0.922 18.087±0.749 19.055±1.374b 10.750＊＊

2.3 RSV對LPS刺激的HGF中TLR4/MyD88/NF-κB信號途徑的調(diào)控作用 LPS顯著升高了HGF細胞中TLR4、MyD88和p-p65的總蛋白表達水平，且促進了p-p65的核轉(zhuǎn)位（P＜0.05）。不同濃度RSV處理明顯降低了TLR4、MyD88和p-p65的總蛋白表達水平，并降低了p-p65在細胞核中的表達（P＜0.05），見圖2、表3。

2.4 RSV對LPS刺激的HGF中炎癥和OS反應的影響 TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制劑E5564可降低LPS刺激的HGF中TLR4、MyD88和p-p65的總蛋白表達水平，以及p-p65的核內(nèi)表達水平（P＜0.05），見圖3、表4。E5564進一步降低了LPS和RSV共處理的HGF細胞中TLR4、MyD88和p-p65的總蛋白表達水平，以及p-p65的核內(nèi)表達水平（P＜0.05），見圖3、表4。ELISA結(jié)果顯示，E5564可以降低LPS刺激的HGF細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA水平，并升高SOD水平（P＜0.05），見表5、6。E5564可加強40μmol/L RSV下調(diào)的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量的能力（P＜0.05），見表5。與LPS+RSV 40組相比，LPS+RSV 40+E5564組提高了GSH-Px的活性（P＜0.05），但SOD和MDA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表6。

Fig.2 Western blot detection of resveratrol on the regulation of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway圖2 Western blot檢測RSV對TLR4/MyD88/NF-κB信號途徑的調(diào)控作用結(jié)果

Tab.3 The regulation of RSV on TLR4/MyD88/NF-κB signaling表3 各組對TLR4/MyD88/NF-κB信號途徑的調(diào)控作用（±s）

Tab.3 The regulation of RSV on TLR4/MyD88/NF-κB signaling表3 各組對TLR4/MyD88/NF-κB信號途徑的調(diào)控作用（±s）

組別對照組LPS組LPS+RSV 20組LPS+RSV 40組LPS+RSV 80組F p65 1.000±0.010 0.992±0.093 0.978±0.038 0.958±0.057 0.998±0.008 0.331 p-p65 1.000±0.489 1.645±0.053a 1.459±0.028b 1.253±0.027b 1.159±0.028b 128.241＊＊細胞核p65 1.000±0.003 2.170±0.043a 1.788±0.007b 1.617±0.025b 1.137±0.037b 871.883＊＊組別對照組LPS組LPS+RSV 20組LPS+RSV 40組LPS+RSV 80組F n3 3 3 3 3 TLR4 1.000±0.032 1.855±0.150a 1.501±0.035b 1.243±0.004b 1.183±0.018b 68.637＊＊MyD88 1.000±0.015 1.827±0.154a 1.584±0.035b 1.256±0.014b 1.170±0.024b 63.549＊＊

Fig.3 The inhibitory effect of E5564 on TLR4/MyD88/NF-κB pathway detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測E5564對TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用結(jié)果

Tab.4 Inhibition of RSVon TLR4/MyD88/NF-κBpathway表4 各組對TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用（±s）

Tab.4 Inhibition of RSVon TLR4/MyD88/NF-κBpathway表4 各組對TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，c與LPS+RSV 40組比較，d與LPS+RSV 40+E5564組比較，P＜0.05；表5、6同

組別對照組LPS組LPS+RSV 40組LPS+RSV 40+E5564組LPS+E5564組F n3 3 3 3 3 TLR4 1.000±0.017 1.764±0.028a 1.510±0.048ab 1.233±0.030abc 1.491±0.030abd 247.303＊＊MyD88 1.000±0.062 2.047±0.060a 1.760±0.012ab 1.456±0.031abc 1.788±0.021abd 276.315＊＊組別對照組LPS組LPS+RSV 40組LPS+RSV 40+E5564組LPS+E5564組F p65 1.000±0.035 1.029±0.010 0.971±0.060 1.003±0.034 0.988±0.024 1.040 p-p65 1.001±0.064 7.222±0.072a 4.723±0.097ab 3.655±0.051abc 4.700±0.163abd 1 585.254＊＊細胞核p65 1.000±0.080 10.951±0.635a 8.646±0.543ab 6.500±0.371abc 8.611±0.861abd 135.153＊＊

3 討論

傳統(tǒng)的牙周炎治療主要途徑為除垢，刮除附著的斑塊細菌，并補充抗生素以抑制口腔細菌的形成。天然藥物的有效成分因其低毒并能高效抑制細菌耐藥性和感染而在CP的治療中具有廣闊的研究前景。

RSV是一種含有黃芪結(jié)構(gòu)的非類黃酮多酚化合物，為非甾體類天然抗氧化劑，其可從葡萄皮、漿果和花生中提取［11］。RSV具有多種生物學活性和藥理作用，其抗炎和抗氧化作用已得到廣泛研究。RSV預處理通過激活SIRT1因子，提高了老年牙周膜干細胞干性，提示RSV可能用于牙周缺損的修復［12］。研究表明，RSV能顯著抑制金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、恥垢分枝桿菌和牙齦假單胞菌的生長和毒力因子表達［13］。另外，RSV可通過抑制白細胞中的NF-κB活化，進而降低牙齦卟啉單胞菌LPS誘導的血管炎癥［14］，并能聯(lián)合水飛薊素增強HGF的活力，減少LPS誘導的IL-6和IL-8表達［15］。同時RSV能抑制實驗性牙周炎大鼠的牙槽骨吸收和IL-17的表達［16］。本研究結(jié)果顯示，RSV處理可抑制LPS誘導HGF中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。

Tab.5 TLR4/MyD88/NF-κB pathway mediated the regulatory effects of resveratrol on inflammation of LPS-stimulated HGFs表5 不同組別對HGF細胞炎性因子的調(diào)節(jié)作用（ng/L，±s）

Tab.5 TLR4/MyD88/NF-κB pathway mediated the regulatory effects of resveratrol on inflammation of LPS-stimulated HGFs表5 不同組別對HGF細胞炎性因子的調(diào)節(jié)作用（ng/L，±s）

組別對照組LPS組LPS+RSV 40組LPS+RSV 40+E5564組LPS+E5564組F n3 3 3 3 3 IL-1β 10.698±0.449 15.253±0.568a 12.819±0.399ab 11.782±0.751abc 13.283±0.441abd 30.422＊＊IL-6 2.251±0.342 3.509±0.072a 3.029±0.182ab 2.630±0.189bc 2.949±0.178ab 14.835＊＊組別對照組LPS組LPS+RSV 40組LPS+RSV 40+E5564組LPS+E5564組F IL-8 9.267±0.780 13.568±0.791a 12.573±0.700a 11.041±0.753abc 13.079±0.579ad 17.562＊＊TNF-α 4.660±0.273 6.100±0.367a 5.494±0.156ab 4.921±0.183bc 5.508±0.292abd 13.490＊＊

Tab.6 TLR4/MyD88/NF-κB pathway mediated the regulatory effects of resveratrol on oxidative stress of LPS-stimulated HGFs表6 不同組別對LPS刺激的HGF氧化應激的調(diào)節(jié)作用（n=3，±s）

Tab.6 TLR4/MyD88/NF-κB pathway mediated the regulatory effects of resveratrol on oxidative stress of LPS-stimulated HGFs表6 不同組別對LPS刺激的HGF氧化應激的調(diào)節(jié)作用（n=3，±s）

組別對照組LPS組LPS+RSV 40組LPS+RSV 40+E5564組LPS+E5564組F MDA（μmol/L）0.478±0.043 0.699±0.035a 0.606±0.043a 0.521±0.086b 0.583±0.047ab 7.445＊＊SOD（μg/L）19.779±0.847 13.836±0.173a 16.404±0.669ab 17.487±1.174ab 16.280±0.995ab 19.529＊＊GSH-Px（μg/L）21.894±0.685 16.985±0.690a 17.849±0.894a 19.437±0.654abc 18.012±0.820ad 19.501＊＊

氧化應激是造成細胞損傷的關(guān)鍵因素，過多的氧自由基通常會在細胞膜中引起脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化損傷，從而破壞細胞膜完整性并誘導細胞炎癥或凋亡。研究顯示，氧化應激與HGF的增殖、凋亡和遷移以及牙齦傷口愈合關(guān)系密切［17-18］。特別是當HGF暴露于細菌細胞壁成分和細胞因子時，細胞釋放O2并激活TNF-α，進而上調(diào)錳超氧化物歧化酶（MnSOD）的表達，MnSOD的產(chǎn)生對HGF細胞具有保護作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激HGF細胞后，細胞分泌的MDA水平升高，SOD水平和GSH-Px活性降低，RSV可顯著減輕LPS誘導的HGF中氧化應激的發(fā)生，表現(xiàn)為SOD和GSH-Px含量升高和MDA含量降低。

TLR4蛋白是LPS信號的感應元件，在促進炎癥和炎性細胞因子釋放中起著重要作用。MyD88蛋白是研究最為廣泛的一種TLR4配體，MyD88的激活導致NF-κB的上調(diào)，最終促使炎性細胞因子的釋放［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV抑制了TLR4/MyD88/NFκB信號通路的活化。脂蛋白可作為激動劑來促進炎癥的消退。最新研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜細胞中的TLR4/MyD88/NF-κB途徑介導了脂蛋白抑制的炎癥反應，說明TLR4/MyD88/NF-κB途徑在牙周疾病的發(fā)展進程中起著關(guān)鍵作用［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV可通過減弱TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活性來抑制LPS誘導的HGF的炎癥和氧化應激損傷。

綜上所述，RSV可以抑制LPS刺激的HGF炎癥和氧化應激的發(fā)生，其重要的作用機制之一是抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活性。