南四湖人工濕地沉積物中氨氧化細(xì)菌的篩選和鑒定

張念鑫,孔 勇,于君君,舒鳳月,周 晶*,王慶峰,于國(guó)紅

(1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,曲阜 273165;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,上海 201403;3河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所,衡水 053000)

濕地是陸生生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)的過(guò)度地帶,是具有保護(hù)生物多樣性、改善水質(zhì)等功能的重要生態(tài)系統(tǒng)。 近年來(lái)由于人們對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)的過(guò)度污染,造成了濕地面積銳減等嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[1]。 作為中國(guó)南水北調(diào)東線工程重要輸水通道的南四湖,其濕地生態(tài)系統(tǒng)的水質(zhì)良好是確保南四湖水質(zhì)安全及調(diào)水工程順利實(shí)施的重要保證。 為了提高南四湖水質(zhì)、恢復(fù)濕地生物多樣性,南四湖流域開(kāi)展了大規(guī)模的濕地修復(fù)工程,人工濕地的修建促進(jìn)了水體凈化和物質(zhì)循環(huán),其中氮元素的循環(huán)過(guò)程受到特別關(guān)注[2]。

氮素循環(huán)是生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)之一,其循環(huán)過(guò)程主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4 個(gè)過(guò)程,均由微生物驅(qū)動(dòng)[3]。 硝化作用是固氮作用和反硝化作用之間的重要環(huán)節(jié)[4],進(jìn)一步分為兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程:第一階段的氨氧化過(guò)程和第二階段的硝化過(guò)程,其中氨氧化細(xì)菌參與的氨氧化反應(yīng)是硝化反應(yīng)的限速步驟。 自1890 年,Winogradsky 首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的氨氧化作用以來(lái),研究者對(duì)氨氧化細(xì)菌的作用機(jī)理和分離純化方式十分關(guān)注。 氨氧化細(xì)菌的氨氧化作用包括2 個(gè)氧化過(guò)程[5],分別利用自身的氨單加氧酶(Ammonia Mono Oxygenase,AMO)和羥胺氧化酶(Hydroxylamine Oxidoreductase,HAO)進(jìn)行反應(yīng)[6],最終將氨氧化為亞硝酸鹽。 氨氧化細(xì)菌屬于革蘭氏陰性專性化能自養(yǎng)細(xì)菌,由于其自身的依附性以及生長(zhǎng)速率慢等特性,使得從環(huán)境中分離純化氨氧化菌成為一大難題。 如今,最常用的方法是先將樣品通過(guò)富集培養(yǎng),再利用硅膠培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基分離純化氨氧化菌。

目前,關(guān)于南四湖人工濕地微生物的研究相對(duì)較少,而對(duì)于氨氧化菌的研究更是微乎其微。 氨氧化細(xì)菌作為污水生物處理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)氨氮去除的主體,其種群結(jié)構(gòu)組成和種群數(shù)量在一定程度上決定了南四湖水體中氮素的循環(huán)速率,進(jìn)一步?jīng)Q定了南四湖水體的富營(yíng)養(yǎng)程度。 本研究通過(guò)從南四湖人工濕地沉積物中分離出具有氨氮去除能力的細(xì)菌,以了解南四湖水質(zhì)的現(xiàn)狀,并為污染水體的生物修復(fù)提供初步候選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

富集培養(yǎng)基(SM):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO40.35 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,CaCl20.18 g,蒸餾水500 mL,pH 8.0。

分離培養(yǎng)基(BTB 培養(yǎng)基):(NH4)2SO42 g,K2HPO40.75 g,NaH2PO40.25 g,MgSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.01 g,CaCO35 g,蒸餾水 1 L,pH 7.2。

營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液:(NH4)2SO45.5 g,蒸餾水100 mL。

硅膠分離培養(yǎng)基:在155 mL 蒸餾水中加入5.5 mL 相對(duì)密度為1.84 的濃硫酸,在185 mL 蒸餾水中加入22 mL 相對(duì)密度為1.19 的濃鹽酸,兩者混合即為稀酸液。 在500 mL 蒸餾水中加入82.59 g 硅酸鈉,攪拌溶解即為水玻璃。 提取12 mL 水玻璃和8 mL 稀酸液于燒杯中,快速攪拌至均勻后,倒入培養(yǎng)皿中,靜置60 min 凝固。 凝固后用蒸餾水輕輕沖洗5—8 次,每次15—25 min。 用1%的硝酸銀溶液檢查氯離子的去除效果,若呈白色則繼續(xù)沖洗。 當(dāng)氯離子除去后,用無(wú)菌水將硅膠平板沖洗1 次,倒置曬干[7]。 在硅膠平板表面加入2 mL 氨氧化菌分離培養(yǎng)液,然后放入烘箱中,35—45 ℃維持1.0—1.5 h 至表面無(wú)液體流動(dòng),然后與培養(yǎng)皿蓋一同在紫外燈下照射30 min,即為用于分離氨氧化細(xì)菌的硅膠平板。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

南四湖是微山湖、昭陽(yáng)湖、獨(dú)山湖、南陽(yáng)湖的總稱,為淮河流域第二大淡水湖。 其中微山湖面積最大,故又統(tǒng)稱為微山湖。 湖泊北高南低,南北長(zhǎng)約125 km,東西寬5.6—30 km,湖區(qū)面積1 225 km2,儲(chǔ)水量19.3 億m3。 隨著人為活動(dòng)的影響,導(dǎo)致南四湖生態(tài)環(huán)境惡化,富營(yíng)養(yǎng)化和沼澤化狀況嚴(yán)重。 2005 年3 月,位于南四湖新薛河的人工濕地示范區(qū)建設(shè)工程正式啟動(dòng),使得南四湖的水質(zhì)得到很大程度的改善。本研究采樣地點(diǎn)位于山東省南四湖新薛河人工濕地,該地為暖溫帶、半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,年平均氣溫14.2 ℃,年降水量700 mm。 于2015 年9 月底采集薛河濕地滯留塘底泥,釆用“之”字形布點(diǎn)取樣(圖1),取樣深度均為0—20 cm。 使用取泥器取同樣深度的土樣9 份,充分混合均勻后放入無(wú)菌袋中,每處理取4 個(gè)重復(fù),封裝后帶回實(shí)驗(yàn)室,4 ℃冰箱保存。

圖1 采樣點(diǎn)Fig.1 Schematic diagram of sampling points

1.2.2 好氧氨氧化菌的分離篩選

將采集的底泥以每10 mL 添加1 g 底泥的比例加入富集培養(yǎng)基中,置28 ℃恒溫室中培養(yǎng)10—15 d。用格利斯試劑在白瓷板上檢測(cè)亞硝酸的生成情況[8]。 格利斯試劑檢驗(yàn)為紅色的富集液中加入1 mL 營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液,繼續(xù)恒溫培養(yǎng)。 再次檢驗(yàn),當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)深紅色時(shí),吸取1 mL 富集液移至新鮮培養(yǎng)液中恒溫培養(yǎng)。 連續(xù)2 次營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和移液富集后,吸取0.05 mL 富集液于硅膠平板上28 ℃培養(yǎng)2—4 周,挑取針尖大小的單菌落于瓊脂平板上劃線分離,在28 ℃恒溫室中培養(yǎng)。 重復(fù)劃線分離,純化細(xì)菌。

1.2.3 16S rDNA 序列擴(kuò)增

采用愛(ài)思進(jìn)生物科技有限公司AxyPrep 細(xì)菌基因組DNA 小量制備試劑盒抽提細(xì)菌基因組DNA,并用DNA 純化試劑盒純化DNA 樣品。 以純化后的DNA 為模板進(jìn)行16S rDNA 靶標(biāo)基因的擴(kuò)增,引物采用通用引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Escherichia coli對(duì)應(yīng)位置為 8—27) 和 1541R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。 PCR 擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 40 s,33 個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。 PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物,電泳檢測(cè)片段大小合格后,進(jìn)行切膠回收,用天根生化公司的DNA 純化回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。 將純化產(chǎn)物送上海生工生物科技有限公司測(cè)序。 將測(cè)序后的序列導(dǎo)入NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行比對(duì),尋找親緣關(guān)系相近的菌種,并用MEGA 6.1 軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

對(duì)底泥經(jīng)過(guò)2 次的富集培養(yǎng)后,通過(guò)純化分離獲得5 株氨氧化細(xì)菌。 在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌能在氨氧化菌富集培養(yǎng)基和瓊脂平板上生長(zhǎng),表明菌株的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源方式多樣,適應(yīng)能力強(qiáng)。 在瓊脂平板上,菌落呈半透明淺灰白色,表面濕潤(rùn)光滑,微隆起,邊緣整齊(圖2)。 經(jīng)革蘭氏染色后,置油鏡下觀察,5 株菌均呈現(xiàn)出紅色,均為革蘭氏陰性菌。

圖2 各菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology pictures of each strain

2.2 16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)NCBI 的Bastln 檢索系統(tǒng)進(jìn)行基因序列同源性分析,16S rDNA 序列同源性比對(duì)結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),篩選分離出的5 株菌中,分別與異氧硝化菌(3 號(hào)和11 號(hào))、嗜酸菌(5 號(hào))、酯香微桿菌(4 號(hào)和12 號(hào))親緣關(guān)系較近。 進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),分離篩選出的異氧硝化菌(3 號(hào)和 11 號(hào)) 與亞硝基滯氮桿菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羥基丁酸正交桿菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)和風(fēng)濕桿菌(Diaphorobacter oryzae)聚為一簇,進(jìn)一步與亞硝基滯氮桿菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羥基丁酸正交桿菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)聚為一小簇。 說(shuō)明3 號(hào)和11 號(hào)菌株都與Diaphorobacter屬細(xì)菌的親緣關(guān)系最近。 該屬的細(xì)菌對(duì)含苯環(huán)的物質(zhì)具有一定的降解作用,且具有一定的絮凝作用,有較強(qiáng)的環(huán)境和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用是Diaphorobacter 屬的主要脫氮形式,將硝氮、亞硝氮、氨氮轉(zhuǎn)化并加以利用進(jìn)行菌體生長(zhǎng),可促進(jìn)污染水體的氮循環(huán)[9]。 酯香微桿菌(4 號(hào)和11 號(hào))與蘇氏微桿菌(Microbacterium suwonense)、酮側(cè)體微桿菌(Microbacterium ketosireducens)、解阿拉伯半乳聚糖微桿菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)聚為一簇,其中與解阿拉伯半乳聚糖微桿菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)的進(jìn)化關(guān)系最為接近。 說(shuō)明4 號(hào)和12 號(hào)與Microbacterium屬具有高度相似性,此屬細(xì)菌常發(fā)現(xiàn)于乳制品、污水和昆蟲(chóng)等。Microbacterium在自然界中廣泛存在,具有極強(qiáng)抗逆性,是修復(fù)環(huán)境污染的理想微生物。 可修復(fù)受油污染的地表水、脫除有機(jī)硫,以及降解有機(jī)污染物[10]。 嗜酸菌(5 號(hào))與纈草酸卵菌(Acidovorax valerianellae)、西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli) 和沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)聚為一簇,說(shuō)明5 號(hào)與Acidovorax 屬細(xì)菌具有高度的相似性,該屬細(xì)菌屬于好氧或兼性厭氧非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌。 嗜酸菌是極端環(huán)境微生物的主要類群之一,生長(zhǎng)在酸性環(huán)境,這是由于硫或硫化物的存在及氧化,嗜酸菌在地球物質(zhì)循環(huán)方面做出了重要貢獻(xiàn)[11]。 可以看出,整個(gè)進(jìn)化樹(shù)將嗜酸菌屬(Acidovoraxsp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、Diaphorobacter 屬分為 3 簇。

圖3 16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences

3 結(jié)論與討論

近幾十年來(lái),以無(wú)機(jī)或有機(jī)物作為氮源的異養(yǎng)硝化微生物(包括細(xì)菌、放線菌、真菌)相繼在土壤、污泥、湖水、深?；鹕娇诘忍幈话l(fā)現(xiàn)和分離[9]。 和大多數(shù)自養(yǎng)硝化細(xì)菌相比,異養(yǎng)型硝化菌生長(zhǎng)速率快、細(xì)胞產(chǎn)量高并且能忍受酸性較強(qiáng)的環(huán)境,雖然至今對(duì)異氧硝化菌的代謝途徑不甚了解,但其仍具有一定的硝化性能。 異氧硝化菌能夠利用有機(jī)碳生長(zhǎng),并將含氮化合物硝化成亞硝酸鹽、硝酸鹽等產(chǎn)物[10],在人工濕地的氮循環(huán)過(guò)程中十分重要。

通過(guò)對(duì)5 株菌的16S rDNA 序列和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),3 號(hào)與11 號(hào)屬于Diaphorobacter屬,該菌屬在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體增長(zhǎng)迅速的同時(shí)去除氨氮的效率增高。 在氨氮濃度較低時(shí)菌體生長(zhǎng)會(huì)進(jìn)入穩(wěn)定期,在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)檢測(cè)到少量的硝氮和亞硝氮這是由于菌體發(fā)生了異養(yǎng)硝化,但在氨氮濃度偏低時(shí)會(huì)將這些副產(chǎn)物消耗掉。 而且Diaphorobacter屬細(xì)菌在脫氮促進(jìn)氮素循環(huán)的同時(shí),還可降解苯酚類有機(jī)物,苯酚對(duì)人體和動(dòng)植物均有毒害作用。 因此,3 號(hào)和11 號(hào)可作為較好的候選生物修復(fù)菌株。

本研究主要是為了篩選具有氨氮去除能力的細(xì)菌,用于促進(jìn)人工濕地污水凈化中的氮素循環(huán)。 人工濕地是指將污水有控制的投配到經(jīng)人工建造的濕地上,污水在沿一定方向流動(dòng)的過(guò)程中,通過(guò)土壤、植物、微生物、人工基質(zhì)等作用,對(duì)其自身進(jìn)行一定程度的凈化技術(shù)[12]。 在污水被凈化的過(guò)程中,氮元素的去除主要通過(guò)氨化、硝化、反硝化、植物吸收和基質(zhì)吸附等途徑[13]。 南四湖在南水北調(diào)東線建設(shè)中具有重要地位,其水質(zhì)對(duì)南水北調(diào)的整體質(zhì)量影響較大[14]。 在5 株氨氧化菌的篩選培養(yǎng)過(guò)程中,本研究選用氨氧化菌富集培養(yǎng)基和瓊脂平板對(duì)其進(jìn)行分離純化,結(jié)果表明5 株氨氧化菌均能夠利用無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮進(jìn)行生長(zhǎng),其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源多樣,能夠適應(yīng)南四湖人工濕地的復(fù)雜環(huán)境,促進(jìn)氮素循環(huán)凈化水質(zhì)。