血清骨橋蛋白、維生素D、白三烯B4對支氣管哮喘病兒診斷及預后的應用價值

鄭華月，張云涵，鄭春陽

流行病學調查顯示，我國兒童支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）發(fā) 病 率 約 為3.00%～7.45%［1-2］，疾病反復發(fā)作所致氣道重塑是造成其病程遷延的主要原因［3］。BA主要通過臨床癥狀、體征及抗哮喘治療效果進行診斷，而對于臨床表現(xiàn)不典型的病人常通過支氣管舒張試驗、支氣管激發(fā)試驗、抗炎治療后肺功能改善情況等進行診斷。但關于臨床表現(xiàn)的內容主觀性較強，且緩解期常無癥狀，加之兒童病史采集及問診常會出現(xiàn)不準確、不完整，試驗操作不配合等情況，可能會影響診斷的準確性。報道顯示，細胞因子網絡失衡是BA發(fā)生的病理基礎［4］，而Th2細胞因子、嗜酸細胞趨化因子共同誘導嗜酸性粒細胞募集與浸潤，進而引起氣道炎癥，可能是其發(fā)病關鍵因素［5］。而骨橋蛋白（OPN）是細胞外基質中一種重要的多功能磷酸化糖蛋白，在T細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞等諸多免疫細胞中呈異常表達，參與炎癥免疫反應，已被證實在哮喘發(fā)病中具有重要作用［7］；白三烯B4（LTB4）是由響應炎癥遞質的白細胞產生，對中性粒細胞具有較強的趨化、活化作用，可刺激炎性細胞釋放，損傷機體呼吸道上皮，誘發(fā)呼吸道高反應狀態(tài)，是哮喘疾病發(fā)生發(fā)展中關鍵炎癥遞質之一［8］。另外，有研究證實，維生素D缺乏會損傷肺功能，提高哮喘急性發(fā)作頻率［6］，而臨床主要以25（OH）D作為維生素D主要評估指標。但關于血清OPN、25（OH）D、LTB4聯(lián)合對BA的診斷價值仍需進一步探究?；诖?，本研究綜合分析血清OPN、25（OH）D、LTB4水平在BA病兒診斷及預后中的應用價值。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院2017年9月至2019年9月收治的BA病兒104例作為觀察組，年齡范圍為2～9歲，體質量范圍為14.0～34.5 kg；另選取同期健康體檢兒童98例作為對照組，年齡范圍為2～8歲，體質量范圍為14.3～34.2 kg。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。兩組性別、年齡、體質量均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在過敏史、呼吸道反復感染史、母乳喂養(yǎng)等方面差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兒童支氣管哮喘104例與健康體檢兒童98例一般資料比較

納入標準：（1）觀察組均符合國內公認的、并已獲臨床肯定的兒童支氣管哮喘診斷金標準，即《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南2016年版》［9］中BA診斷標準；（2）兩組臨床資料完整，監(jiān)護人均簽署知情同意書。

排除標準：（1）先天性心肺疾病者；（2）合并鈣磷代謝性疾病者；（3）近12周內有補充維生素D者；（4）合并肝腎等重要臟器器質性病變者；（5）合并支氣管肺發(fā)育不良、支氣管異物、胃食管反流或其他疾病者；（6）存在吸入用布地奈德混懸液、孟魯司特鈉咀嚼片等藥物過敏史者；（7）中途放棄治療、臨床資料不完整者；（8）監(jiān)護人精神行為異常。

1.2 方法

1.2.1檢測方法空腹取5 mL靜脈血，離心12 min，3 000 r∕min，分離取血清。

（1）采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清OPN、LTB4水平，試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司，具體操作：取出所需板條，設置標準品孔、樣本孔，標準品孔各加不同濃度標準品50 μL，同時樣本孔中加入待測樣本50 μL，空白孔不加。除空白孔外，標準品孔、樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μL），靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。

（2）采用電化學發(fā)光分析儀（型號：Cobas e411）檢測血清25(OH)D水平，儀器購自美國羅氏公司，上述均嚴格按照儀器、試劑盒說明書操作。

1.2.2治療方法觀察組均接受規(guī)范化分級治療，并每次霧化吸入1～2 mL布地奈德混懸液（Astra-Zeneca Pty Ltd，批號H20140474）+3 mL氯化鈉溶液（0.9%），每次15～20 min，2次∕天，控制其氧流量為5 L∕min，堅持治療1周，霧化吸入完成后指導病兒清水及時漱口。同時每晚口服孟魯司特鈉咀嚼片（Merck Sharp & Dohme B.V.，批號J20130054），6～9歲兒童，每次5 mg，1次∕天，2歲以上6歲以下兒童，每次4 mg，1次∕天，均持續(xù)治療4周。

1.3 觀察指標（1）對比兩組治療前血清OPN、25（OH）D、LTB4水平。（2）分析血清OPN、25（OH）D、LTB4單一及聯(lián)合應用對兒童BA的診斷價值。（3）采用兒童哮喘控制測試（Childhood asthma control test，C-ACT）［10］評估預后，總計27分，其中C-ACT評分≤19分為未控制；20～22分為部分控制；C-ACT評分≥23分為控制。對比不同預后病兒治療前、治療第7天、第14天血清OPN、25（OH）D、LTB4水平變化趨勢。（4）治療第14天血清OPN、25（OH）D、LTB4與兒童BA預后的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法使用SPSS 23.0進行研究資料分析。觀測資料中的計量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗，以±s描述。兩組間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。兩組不同時間點比較采用兩因素重復測量數(shù)據(jù)的方差分析+兩兩組間比較LSD-t檢驗+兩兩時間比較差值t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)及率描述，兩組間比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗。通過繪制ROC曲線分析血清OPN、25（OH）D、LTB4對兒童BA的診斷效能。治療14 d后血清OPN、25（OH）D、LTB4與預后的關系采用非條件logistic回歸。

本研究統(tǒng)計推斷的檢驗水準α=0.05。重復測量分析之時間維度的多次比較按Bonferroni校正法調整檢驗水準。

2 結果

2.1 兩組血清OPN、25（OH）D、LTB4水平觀察組治療前血清OPN、LTB4高于對照組，血清25（OH）D低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兒童支氣管哮喘104例與健康體檢兒童98例血清OPN、25（OH）D、LTB4水平比較∕±s

表2 兒童支氣管哮喘104例與健康體檢兒童98例血清OPN、25（OH）D、LTB4水平比較∕±s

注：OPN為血清骨橋蛋白，25（OH）D為維生素D，LTB4為白三烯B4。

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2.2 兒童發(fā)生BA危險因素的二元logistic回歸分析以兒童是否存在BA為應變量，賦值：1=有支氣管哮喘，0=無支氣管哮喘的健康體檢者。以組間基線數(shù)據(jù)、血清OPN、25（OH）D等單因素分析中P＞0.1的指標為自變量，建立非條件logistic回歸模型。采用逐步后退法進行二元logistic回歸分析，結果顯示，有過敏史、有呼吸道反復感染史、父母有哮喘史以及治療前血清OPN、LTB4，25（OH）D均是兒童BA的獨立影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 兒童發(fā)生支氣管哮喘危險因素的二元logistic回歸分析

2.3 血清OPN、25（OH）D、LTB4對兒童BA的診斷價值進一步探討血清OPN、25（OH）D、LTB4對兒童BA的診斷價值如下：（1）各指標的單獨應用。以觀察組為陽性樣本，對照組為陰性樣本，建立ROC診斷分析模型，被分析指標按樣本總水平數(shù)值范圍劃分為若干個組段，建立ROC曲線。再以軟件擬合之ROC曲線讀取約登指數(shù)最大值點，對應計算理論閾值和敏感度、特異度。經ROC分析知，該指標具有較高的診斷價值，AUC（95%CI）分別為0.790（0.728～0.844）、0.771（0.706～0.827）、0.809（0.748～0.861）。分析結果列于表4，ROC分析曲線見圖1。

（2）各指標的聯(lián)合應用.采用SPSS軟件的聯(lián)合應用ROC理論模式（LogP模式：對各單獨應用指標進行綜合回歸，建立logistic預測∕診斷評估模型，并將三指標轉化得到的聯(lián)合應用預測概率的預測變量，并據(jù)此進行聯(lián)合應用的ROC分析）。結果顯示，聯(lián)合應用對兒童BA的診斷的AUC（95%CI）為0.892（0.841～0.931）。提示其診斷效能均較單一指標均有明顯提高。亦見表4和圖1。

表4 治療前血清OPN、25（OH）D、LTB4單獨及聯(lián)合應用對兒童支氣管哮喘104例的診斷效能

圖1 治療前血清骨橋蛋白（OPN），維生素D［25（OH）D］，白三烯B4（LTB4）單獨及聯(lián)合應用對兒童支氣管哮喘104例診斷的ROC曲線

2.4 不同預后病兒治療前后血清OPN、25（OH）D、LTB4水平變化趨勢經有效治療后，104例BA病兒中48例控制，36例部分控制，20例未控制。

對比不同預后病兒治療前、治療第7天、第14天血清OPN、25(OH)D、LTB4水平變化趨勢，組間和時間對各指標的影響均存在交互作用（P＜0.05）。進一步對內因素單獨效應進行分析，組間單獨效應：三組間治療第7天、第14天各指標水平均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；時間因素單獨效應：時間因素對三組各指標的影響均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩精細比較，治療第7天、第14天控制者、部分控制者血清OPN低于治療前，25(OH)D高于治療前（P＜0.017）；控制者治療第7天、第14天血清OPN、LTB4低于部分控制者、未控制者，25(OH)D高于部分控制者、控制者（P＜0.05）。見表5。

表5 不同預后支氣管哮喘病兒治療前后血清OPN、25（OH）D、LTB4水平變化趨勢∕±s

表5 不同預后支氣管哮喘病兒治療前后血清OPN、25（OH）D、LTB4水平變化趨勢∕±s

注：OPN為血清骨橋蛋白，25（OH）D為維生素D，LTB4為白三烯B4。①與組內治療前比較，P＜α'，α'為Bonferroni校正后的檢驗水準=0.05∕3=0.017。②與控制者同時點比較，P＜0.05。③與部分控制者比較，P＜0.05。

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2.5影響兒童BA預后的單因素分析將兒童BA治療后預后情況分為預后不良（未能控制）和控制良好（控制和部分控制），并進行單因素分析，結果顯示，預后不良的BA病兒治療第14天OPN、LTB4明顯高于控制良好病兒，而治療第14天25（OH）D明顯低于控制良好病兒（P＜0.05）。見表6。

表6 影響兒童支氣管哮喘預后的單因素分析

2.6 兒童BA預后影響因素的二元logistic回歸分析以兒童BA預后為應變量，賦值：1=預后不良（未能控制），0=控制良好（控制和部分控制）。以單因素分析中P＞0.1的指標為自變量，建立非條件logistic回歸模型。采用逐步后退法進行二元logistic回歸分析，結果顯示，治療第14天血清OPN、LTB4，25（OH）D均是預后不良的獨立影響因素（P＜0.05），見表7。

表7 兒童支氣管哮喘預后影響因素的二元logistic逐步回歸分析

3 討論

目前臨床尚未完全明確BA發(fā)病機制，大量研究認為，Th1∕Th2失衡可能是BA發(fā)病的主要免疫學基礎，能在一定程度上促進炎性細胞因子及IgE大量釋放，誘發(fā)變態(tài)反應［11］。因此，積極探索BA發(fā)病機制，對BA診斷及預后評估均具有重要指導意義。

OPN是臨床公認的Thl型免疫反應的關鍵細胞因子，在Thl細胞及Th2細胞介導的Ⅳ型、Ⅰ型變態(tài)反應中發(fā)揮重要作用［12-13］。王仁忠等［14］研究發(fā)現(xiàn)，BA病兒血清OPN水平呈上升趨勢，支持本研究結果。推測OPN可能參與BA發(fā)生、發(fā)展。OPN通過與多種炎癥遞質、細胞因子相互作用，間接參與中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞趨化、浸潤過程，進而增殖支氣管平滑肌細胞，上調基質金屬蛋白酶-9、白細胞介素13等表達，參與氣道組織重塑，誘導氣道炎癥持續(xù)存在，從而促進BA病情進展。通過繪制ROC曲線進一步證明，血清OPN診斷BA的AUC較大，具有較好的診斷效能。另外，治療第7天、第14天血清OPN水平在控制者、部分控制者中呈低表達，與蘭芙蓉等［15］研究結論相似，且治療第14天OPN也是影響兒童BA預后的獨立危險因素，有力佐證了OPN水平下調會發(fā)揮抗炎作用，抑制氣道炎癥反應，防止肺組織及氣道組織重塑，提高支氣管平滑肌肌動蛋白表達，減小基底膜厚度，預防氣道纖維化，從而BA病兒臨床預后。

LTB4可活化白細胞，對中性粒細胞產生強效化學誘導反應，介導相關黏附蛋白表達，從而增加血管通透性，促進黏液分泌［16-17］。本研究結果顯示，血清LTB4水平在BA病兒中呈異常高表達，與熊瓔珞［18］結果基本一致，證實了LTB4在BA發(fā)作中具有重要作用。血清LTB4水平高表達，可能通過與其主要功能受體BLT1相互作用，促進中性粒細胞、效應T細胞等細胞因子趨化與活化，參與細胞因子網絡調節(jié)，刺激白細胞介素1、腫瘤壞死因子-α等炎性遞質釋放，從而加重氣道嗜酸性粒細胞炎癥，引發(fā)BA。ROC曲線表明，血清LTB4診斷BA的AUC也很大，可見早期檢測血清LTB4濃度，對BA病兒具有一定診斷價值。而治療第14天血清LTB4是BA病兒預后不良的獨立影響因素提示通過抑制血清LTB4產生，控制以嗜酸性粒細胞增多及浸潤為主的慢性氣道炎癥，有望成為治療BA研究新的方向。

Man等［19］研究證實，維生素D在非特異性免疫及特異性免疫中發(fā)揮重要作用，可調節(jié)輔助性T細胞Th1、Th2活性。通過電化學發(fā)光分析儀檢測可知，BA病兒血清25（OH）D水平明顯低于健康體檢兒童，與Prasad等［20］研究相符，充分說明BA病兒存在維生素D缺乏現(xiàn)象。BA發(fā)生會增強氣道局部炎性反應，抑制血清25（OH）D水平釋放，進而降低白細胞介素10水平，破壞Thl∕Th2平衡，提高Th2分泌細胞活性，增加小氣道阻塞程度，提高氣道高反應性，增加BA急性發(fā)作風險［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療第14天血清25（OH）D是BA病兒預后不良的獨立影響因素。分析原因可能與維生素D水平升高，一方面可調節(jié)Th1、Th2細胞亞群，控制促炎因子的釋放，改善炎癥反應，進而減輕慢性氣道炎癥；另一方面可調控支氣管平滑肌組織基因轉錄，促進其相關蛋白表達，減少氣道重塑，增強糖皮質激素作用，從而緩解哮喘癥狀有關。而血清25（OH）D對兒童BA同樣具有較高的診斷效能（AUC＞0.7）。本研究進一步采用聯(lián)合診斷模式，結果表明，血清OPN、25（OH）D、LTB4聯(lián)合診斷BA的AUC和敏感度最高，提示三指標聯(lián)合應用對兒童BA具有更高的診斷價值。綜上所述，血清OPN、25（OH）D、LTB4水平在BA病兒中呈異常表達，三者聯(lián)合應用有望成為BA的更有效的早期診斷手段，并為臨床選擇針對性治療方案及預后評估提供參考。