長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因7調(diào)控卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制研究

于利，張明，王迪

卵巢癌是女性惡性腫瘤，其死亡率在婦科惡性腫瘤中排名首位［1］。研究顯示，卵巢癌不僅早期發(fā)病隱匿、發(fā)展速度快，其還具有轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、惡性程度高等特點(diǎn)，積極尋找有效手段治療卵巢癌是目前亟待解決的問題［2］。隨著分子生物學(xué)及各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，生物靶向治療腫瘤逐漸成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。卵巢癌的發(fā)生與組織中基因的表達(dá)改變有關(guān)，這些基因調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，是腫瘤惡性進(jìn)展的關(guān)鍵因子。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一個(gè)非編碼RNA，其不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，在人體內(nèi)的各個(gè)組織中表達(dá)，參與調(diào)控眾多生理過程［3］。lncRNA還與人類的疾病發(fā)生有關(guān)，目前已知其參與心肌損傷、肺炎、關(guān)節(jié)炎等疾病進(jìn)程，lncRNA還有望成為疾病治療的靶點(diǎn)［4］。在人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)多種lncRNA的表達(dá)變化，這些lncRNA與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)［5］。lncRNA小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）在人類的不同組織中的表達(dá)水平不同，其是一個(gè)腫瘤調(diào)控因子，在胰腺癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)SNHG7具有促腫瘤進(jìn)展的作用，下調(diào)SNHG7可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生長和轉(zhuǎn)移［6-8］。本研究于2019年6—12月探討下調(diào)SNHG7對(duì)卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞侵襲以及遷移的影響和機(jī)制，為靶向分子治療卵巢癌提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞購自美國ATCC；波形蛋白（Vimentin）抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；實(shí)時(shí)定量PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由北京安必奇生物科技有限公司合成；上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體購自美國Proteintech。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SNHG7干擾表達(dá)質(zhì)粒（SNHG7 shRNA）和陰性對(duì)照質(zhì)粒（shRNA），將轉(zhuǎn)染以后的細(xì)胞分別命名為Sh-SNHG7和Sh-NC組，常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照（Control）組。SNHG7 shRNA、shRNA陰性對(duì)照均由和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司構(gòu)建。

1.3 SNHG7表達(dá)水平測定用實(shí)時(shí)定量PCR方法測定細(xì)胞中SNHG7表達(dá)變化，步驟如下：收集培養(yǎng)24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，包括：0.5 μL的核糖核酸酶抑制劑（RNase Inhibitor）、0.5 μL的dNTP混合物（dNTP mixture）、2 μL的5×PCR緩沖液、0.5 μL的寡核苷酸dT引物（Oligo dT Primer）、1 μL的RNA、5.5 μL的無RNA酶水（RNase free），逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保存。根據(jù)以下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，包括：0.2 μL的染料（DYE）Ⅰ、3.4 μL的熒光DNA結(jié)合染料（SYBR Green）、0.2 μL的正反向引物、1 μL的cDNA、5 μL的RNase free水，PCR反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。設(shè)置甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，按照常規(guī)2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG7表達(dá)量。GAPDH正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，，反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，；SNHG7正 向 引 物5，-CAACTGCCTGAAACCCCATCT-3，，反 向 引 物5，-CGGGTTCAAGCGATTCTCCT-3，。

1.4 細(xì)胞增殖能力測定用MTT方法測定細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞增殖能力以A值代表，A值越大，細(xì)胞增殖能力也就越強(qiáng)，MTT步驟簡述如下：在96孔板中按照每孔2×103個(gè)細(xì)胞將Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞分別接種，每孔中添加100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，添加10 μL MTT溶液，孵育4 h后添加150 μL二甲基亞砜（DMSO），酶標(biāo)儀上測定A470nm值。

1.5 細(xì)胞克隆形成能力測定用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力，步驟簡述如下：將Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞分別接種到6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿中加200 μL的濃度為1×103個(gè)細(xì)胞∕mL的細(xì)胞懸浮液，然后添加細(xì)胞培養(yǎng)液至5 mL，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，此時(shí)肉眼可見明顯的細(xì)胞集落。將細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，加磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次細(xì)胞，以4%的多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，干燥以后，顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.6 細(xì)胞侵襲和遷移能力測定將Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，侵襲實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠將Transwell小室包被，遷移實(shí)驗(yàn)則不加基質(zhì)膠。取200 μL上述細(xì)胞懸浮液接種到Transwell上室，培養(yǎng)24 h，用棉簽擦除沒有穿膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平測定用Western blotting方法檢測Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)，步驟簡述如下：收集培養(yǎng)24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞，將上清溶液棄掉，添加含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的放射免疫沉淀分析裂解液（RIAP），放在冰上充分裂解，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在4℃條件下以12 000g離心20 min，吸取上清，用二辛可寧酸（BCA）方法測定濃度。按照常規(guī)方法分別制備實(shí)驗(yàn)用分離膠以及濃縮膠，設(shè)置分離膠中電泳電壓為100 V，濃縮膠中電泳電壓為80 V。染料進(jìn)入到分離膠的底部以后將電源關(guān)閉。取出凝膠，在4℃轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為60 V，轉(zhuǎn)膜持續(xù)40 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF），經(jīng)過5%牛血清白蛋白封閉以后，分別與一抗、二抗依次結(jié)合后，用電化學(xué)發(fā)光液（ECL）方法顯色，設(shè)置GAPDH作為內(nèi)參，分析Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)量。

1.8 SNHG7靶向關(guān)系預(yù)測和鑒定用starbase生物信息軟件發(fā)現(xiàn)SNHG7和miR-34a有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，二者可能互為靶向關(guān)系。以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系，分別將SNHG7野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（SNHG7-WT）、突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（SNHG7-MUT）同miR-34a模擬物（miR-34a mimics）及陰性對(duì)照（mimics control）共轉(zhuǎn)染到SK-OV-3細(xì)胞中，24 h后檢測熒光素酶活性變化，步驟同熒光素酶活性檢測試劑盒。SNHG7-WT、MUT分別為含有SNHG7的結(jié)合序列和含有突變以后的SNHG7結(jié)合序列的熒光素酶報(bào)告載體，載體由中洪博元生物集團(tuán)有限公司構(gòu)建。miR-34a mimics、mimics control購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。收集培養(yǎng)24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量PCR方法測定細(xì)胞中miR-34a表達(dá)變化，步驟同1.3，內(nèi)參為核小分子RNA（U6）。

1.9 miR-34a inhibitor對(duì)下調(diào)SNHG7影響卵巢癌細(xì)胞的作用檢測卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染SNHG7 shRNA+miR-34a抑制劑（miR-34a inhibitor）和SNHG7 shRNA+miR-34a抑制劑陰性對(duì)照（inhibitor control），依次命名為Sh-SNHG7+anti-miR-34a和Sh-SNHG7+anti-miR-NC組，按照1.4（MTT）、1.5（克隆形成實(shí)驗(yàn)）、1.6（Transwell小室）、1.7（Western blotting）中方法測定細(xì)胞增殖、克隆、侵襲遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 21.0軟件分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較經(jīng)成組t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)的方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG7 shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)影響與Sh-NC組比較，Sh-SNHG7組卵巢癌細(xì)胞中SNHG7表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖（A值）降低，克隆數(shù)目減少，侵襲和遷移數(shù)目減少，Vimentin蛋白表達(dá)量減少，E-cadherin蛋白表達(dá)量升高，見圖1和表1。SNHG7 shRNA下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中SNHG7表達(dá)水平，降低卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆、遷移以及侵襲能力。

表1 SNHG7 shRNA轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞中SNHG7水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較∕±s

表1 SNHG7 shRNA轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞中SNHG7水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較∕±s

注：SNHG7為小核仁RNA宿主基因7，Control為對(duì)照組，Sh-NC為轉(zhuǎn)染SNHG7陰性對(duì)照質(zhì)粒組，Sh-SNHG7為轉(zhuǎn)染SNHG7干擾表達(dá)質(zhì)粒組，A值為吸光度值，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白。①與Sh-NC比較，P＜0.05。

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圖1 Western blotting檢測SNHG7 shRNA轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)

2.2 SNHG7靶向調(diào)控miR-34aSNHG7和miR-34a有堿基互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miR-34a mimics和SNHG7-WT共轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞熒光素酶活性下降（0.48±0.05）比（1.00±0.11），t=12.91，P＜0.001。SNHG7靶向調(diào)控miR-34a。見圖2。

圖2 SNHG7和miR-34a堿基互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

2.3 下調(diào)SNHG7促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中miR-34a表達(dá)Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細(xì)胞中miR-34a水平分別為（1.00±0.11）、（0.98±0.10）、（2.64±0.21）。與Sh-NC組比較，Sh-SNHG7組卵巢癌細(xì)胞中miR-34a水平升高（P＜0.05）。下調(diào)SNHG7促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中miR-34a表達(dá)。

2.4 miR-34a inhibitor對(duì)下調(diào)SNHG7的卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆、遷移、侵襲以及Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)影響與Sh-SNHG7+anti-miR-NC組比較，Sh-SNHG7+anti-miR-34a組卵巢癌細(xì)胞中miR-34a水平降低，SK-OV-3細(xì)胞增殖能力升高，SK-OV-3細(xì)胞克隆形成數(shù)、侵襲以及遷移數(shù)增多，Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降，見圖3，表2。

表2 miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中miR-34a水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較∕±s

表2 miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中miR-34a水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較∕±s

注：miR-34a為微小RNA-34a，SNHG7為小核仁RNA宿主基因7，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白，Sh-SNHG7+anti-miR-NC為共轉(zhuǎn)染SNHG7 shRNA和miR-34a抑制劑陰性對(duì)照，Sh-SNHG7+anti-miR-34a為共轉(zhuǎn)染SNHG7 shRNA和miR-34a抑制劑，A值為吸光度值。①與Sh-SNHG7+anti-miR-NC比較，P＜0.05。

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圖3 Western blotting檢測miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin水平

3 討論

lncRNA是不能編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，其長度大于200 bp，在細(xì)胞增殖、個(gè)體發(fā)育等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用［9］。lncRNA參與腫瘤進(jìn)展，可能是腫瘤分子靶向治療的生物靶標(biāo)［10］。SNHG7是在人體組織中發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在不同組織中的表達(dá)不同，并且參與人體多種腫瘤的進(jìn)展，目前在膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等組織中發(fā)現(xiàn)SNHG7異常表達(dá)，SNHG7表達(dá)改變影響細(xì)胞的生長以及轉(zhuǎn)移過程，SNHG7可能是腫瘤治療的有效靶點(diǎn)［6，11］。本研究結(jié)果表明，下調(diào)SNHG7后的卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆能力下降，提示下調(diào)SNHG7具有抗卵巢癌細(xì)胞生長的作用，這與上述研究結(jié)果相符合，進(jìn)一步說明了SNHG7在癌癥中可能發(fā)揮類似癌基因的作用。

卵巢癌轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)，其細(xì)胞轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的重要原因［12］。研究顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，發(fā)生EMT后的轉(zhuǎn)移能力大大增加［13］。Vimentin、E-cadherin表達(dá)變化是EMT能力改變的可靠指標(biāo)［14］。Vimentin還可以作為一種癌基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。E-cadherin在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)上調(diào)后可以抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)移［15］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SNHG7后卵巢癌細(xì)胞侵襲以及遷移能力降低，Vimentin表達(dá)水平減少，E-cadherin表達(dá)水平升高，提示上調(diào)SNHG7抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。

lncRNA廣泛參與人體生理以及病理進(jìn)程，并且在不同的組織及生理過程中的作用不同。lncRNA的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，這也是其功能多樣的重要原因［16］。lncRNA可以通過不同靶向調(diào)控機(jī)制影響細(xì)胞的生長、組織分化，目前其調(diào)控機(jī)制還未完全闡明［17］。lncRNA可以通過堿基互補(bǔ)的方式影響miRNA的表達(dá)，從而通過多個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響細(xì)胞生物學(xué)行為［18］。本次實(shí)驗(yàn)表明，SNHG7和miR-34a互為靶向關(guān)系，并且下調(diào)SNHG7可以靶向促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)。miR-34a是一個(gè)腫瘤關(guān)系密切的miRNA，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程［19］。研究顯示，miR-34a在骨肉瘤、肺癌、卵巢癌等中下調(diào)表達(dá)，影響細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［20-24］。本實(shí)驗(yàn)顯示，抑制miR-34a逆轉(zhuǎn)下調(diào)SNHG7對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移潛能的抑制作用，提示下調(diào)SNHG7可以靶向促進(jìn)miR-34a的表達(dá)阻礙卵巢癌進(jìn)展。

綜上，下調(diào)SNHG7表達(dá)可以在體外阻礙卵巢癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，作用機(jī)制與靶向促進(jìn)miR-34a的表達(dá)有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究SNHG7在卵巢癌中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用提供了資料，為尋找有效的卵巢癌治療生物靶標(biāo)提供可思路。