超聲造影定量參數(shù)聯(lián)合血清微小RNA-139-5p、微小RNA-15a檢測在卵巢漿液性囊腺癌病人中應(yīng)用價值

馬艷紅，阮青青，梁志，舒嚴(yán)蘋

卵巢癌為婦科常見惡性腫瘤，有關(guān)研究指出，因卵巢組織解剖、胚胎發(fā)育、內(nèi)分泌功能較復(fù)雜，卵巢癌發(fā)病早期并無明顯癥狀，70%左右病人在疾病確診時已進(jìn)展至晚期，腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，放化療與根治手術(shù)效果均不佳，病人5年生存率僅30%［1-3］。探尋一種卵巢癌早期鑒別診斷方法一直為臨床研究重點(diǎn)課題。超聲造影為惡性腫瘤定性診斷的重要影像學(xué)手段，經(jīng)由靜脈團(tuán)注造影劑，能加強(qiáng)靶區(qū)域血流信號，更為清晰地顯示微小血管灌注狀態(tài)，有利于病灶檢出，同時具有無創(chuàng)、操作便捷等特點(diǎn)，但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，其在疾病早期的診斷效果較差［4-5］。mi RNAs為一類內(nèi)源性小分子RNA，可阻止目標(biāo)蛋白翻譯或靶向降解目標(biāo)m RNA分子起到多種生物學(xué)作用，與腫瘤發(fā)病、進(jìn)展、預(yù)后等具有密切關(guān) 系［6-7］。微 小RNA-139-5p（miR-139-5p）、微 小RNA-15a（miR-15a）均為調(diào)節(jié)人體細(xì)胞生長、增殖的重要mi RNAs，在惡性腫瘤病人中其表達(dá)異常改變，可為疾病早期診斷提供一定參考［8-9］。本研究擬首次聯(lián)合超聲造影定量參數(shù)與血清miR-139-5p、miR-15a檢測，旨在分析兩者聯(lián)合檢測在卵巢漿液性囊腺癌病人中應(yīng)用價值及意義。詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年6月至2019年9月重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院收治的92例卵巢漿液性囊腺癌病人為腺癌組（年齡范圍為23～75歲，體質(zhì)量范圍為41～82 kg）及92例卵巢漿液性囊腺瘤病人為腺瘤組（年齡范圍為25～74歲，體質(zhì)量范圍為40～81 kg）。兩組年齡、體質(zhì)量、絕經(jīng)狀態(tài)、合并癥等基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 卵巢癌及卵巢良性腫瘤病人各92例一般資料比較

腺癌組病理分期為Ⅰ～Ⅱ期34例（36.96%）、Ⅲ～Ⅳ期58例（63.04%），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例（46.74%）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，獲得病人或其近親屬知情同意。

1.2 選例標(biāo)準(zhǔn)（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：腺癌組均符合《婦產(chǎn)科學(xué)》［10］中卵巢漿液性囊腺癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，且通過病理檢查證實(shí)；腺瘤組卵巢漿液性囊腺瘤（腺瘤組）均經(jīng)臨床與病理檢查證實(shí)；研究對象自愿納入研究。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重感染與其他類型惡性腫瘤者；合并免疫系統(tǒng)、精神系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎、肺等臟器功能嚴(yán)重異常者；存在超聲造影檢查禁忌癥或?qū)υ煊皠┻^敏者。

1.3 方法

1.3.1超聲造影檢查方法應(yīng)用彩色多普勒超聲診斷儀（Philips，iU Elite）施行檢查，探頭頻率為3.5 MHz，造影劑應(yīng)用由意大利Bracco公司生產(chǎn)的聲諾維超聲造影劑，低機(jī)械指數(shù)（MI＜0.1）實(shí)時灰階諧波超聲造影。檢查前囑咐受檢者憋尿，適度充盈膀胱；檢查時受檢者仰臥，先采取常規(guī)灰階超聲檢查子宮及卵巢大小、位置與腫瘤數(shù)目、大小、邊界、形態(tài)等情況；后選取最佳切面，切換到造影模式，使用C5-1經(jīng)腹探頭；經(jīng)肘正中靜脈團(tuán)注2 mL造影劑，從造影劑注射開始持續(xù)觀察整個造影過程，以硬盤存錄約3 min；造影結(jié)束后，觀察、記錄病灶的增強(qiáng)水平、增強(qiáng)時間、造影劑分布情況；應(yīng)用Philips QLab定量分析軟件實(shí)施定量分析，選取病灶部位感興趣區(qū)域，由軟件自動繪制出超聲造影時間-強(qiáng)度曲線，獲得始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度等超聲造影參數(shù)值。

1.3.2血清miR-139-5p、miR-15a水平檢測采集受檢者4 mL清晨空腹靜脈血樣，應(yīng)用離心機(jī)以3 000 r∕min轉(zhuǎn)速、8 cm離心半徑離心5 min，取血清，-80℃冰箱中儲存待檢；依據(jù)Qiagen公司提供的總RNA提取試劑盒miRNeasy Serum∕Plasma Kit說明書進(jìn)行總RNA的提取，應(yīng)用NANODROP 2000檢測血清RNA水平，-80℃下保存獲得的RNA。而后按Qiagen公司提供的miScriptⅡRT Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，配制20 μL反應(yīng)體系；有關(guān)引物序列：miR-139-5p正向 引 物5’-UCUACAGUGCACGUGUCUC-CAGU-3’，miR-15a正向引物5’-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3’，反向引物均為試劑盒所提供引物；內(nèi)參U6的正向引物5’-GTGCTC-CCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，反 向 引 物5’-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3’，反應(yīng)條件：95℃下10 min，95℃下10 s，60℃下60 s，72℃下延伸3 min，40個循環(huán)；以2-ΔΔCt計(jì)算血清miR-139-5p、miR-15a相對表達(dá)量。

1.4 觀察指標(biāo)（1）兩組超聲造影定量參數(shù)（始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度）、血清miR-139-5p、miR-15a水平。（2）應(yīng)用logistic回歸分析探討超聲造影定量參數(shù)（始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度）、血清miR-139-5p、miR-15a與卵巢漿液性囊腺癌的相關(guān)性。（3）受試者工作特征（ROC）曲線分析超聲造影定量參數(shù)（始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度）、血清miR-139-5p、miR-15a對卵巢漿液性囊腺癌的診斷效能。（4）淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、卵巢漿液性囊腺癌病人超聲造影定量參數(shù)（始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度）、血清miR-139-5p、miR-15a水平。（5）Pearson相關(guān)性分析探討超聲造影定量參數(shù)（始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度）、血清miR-139-5p、miR-15a水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS 22.0軟件包實(shí)施數(shù)據(jù)處理；計(jì)量資料以±s表示、兩組定量數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；logistic回歸分析觀察超聲造影定量參數(shù)、血清各指標(biāo)與卵巢漿液性囊腺癌發(fā)病的相關(guān)性；繪制ROC曲線分析超聲造影定量參數(shù)、血清各指標(biāo)對卵巢漿液性囊腺癌的診斷效能；Pearson相關(guān)性探討超聲造影定量參數(shù)、血清各指標(biāo)與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲造影定量參數(shù)、血清miR-139-5p、miR-15a水平腺癌組超聲造影定量參數(shù)的始增時間、達(dá)峰時間、血清miR-15a水平低于腺瘤組，超聲造影定量參數(shù)的增強(qiáng)強(qiáng)度、血清miR-139-5p水平高于腺瘤組（P＜0.05）。見表2。

表2 卵巢漿液性囊腺癌及卵巢漿液性囊腺瘤病人超聲造影定量參數(shù)、血清miR-139-5p、miR-15a水平比較∕±s

表2 卵巢漿液性囊腺癌及卵巢漿液性囊腺瘤病人超聲造影定量參數(shù)、血清miR-139-5p、miR-15a水平比較∕±s

注：miR-139-5p為微小RNA-139-5p，miR-15a為微小RNA-15a。

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2.2 超聲造影定量參數(shù)、血清各指標(biāo)與卵巢漿液性囊腺癌的相關(guān)性以是否發(fā)生卵巢漿液性囊腺癌為因變量，將受試者超聲造影定量參數(shù)的始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度、血清miR-139-5p、miR-15a為自變量實(shí)施logistic回歸分析，結(jié)果顯示，超聲造影定量參數(shù)的始增時間、達(dá)峰時間、增強(qiáng)強(qiáng)度、血清miR-139-5p、miR-15a均與卵巢漿液性囊腺癌具有明顯相關(guān)性（P＜0.05）。見表3。

表3 超聲造影定量參數(shù)、血清各指標(biāo)與卵巢漿液性囊腺癌的相關(guān)性

2.3 各指標(biāo)診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線聯(lián)合診斷卵巢漿液性囊腺癌的AUC為0.896，均高于單一指標(biāo)，兩者聯(lián)合診斷卵巢漿液性囊腺癌的敏感度為90.22%，特異度為78.26%。見表4。

表4 各指標(biāo)診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線

2.4 淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移卵巢漿液性囊腺癌病人各指標(biāo)水平有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢漿液性囊腺癌病人超聲造影定量參數(shù)的始增時間、達(dá)峰時間與血清miR-15a水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人，超聲造影定量參數(shù)的增強(qiáng)強(qiáng)度與血清miR-139-5p水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人（P＜0.05）。見表5。

表5 卵巢漿液性囊腺癌病人92例有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)水平比較∕±s

表5 卵巢漿液性囊腺癌病人92例有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)水平比較∕±s

注：miR-139-5p為微小RNA-139-5p，miR-15a為微小RNA-15a。

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2.5 各指標(biāo)水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系Pearson相關(guān)性分析可知，超聲造影定量參數(shù)的始增時間（r＝-4.872、P＜0.001）、達(dá)峰時間（r＝-4.694、P＜0.001）及血清miR-15a（r＝-5.129、P＜0.001）水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著負(fù)相關(guān)，超聲造影定量參數(shù)的增強(qiáng)強(qiáng)度（r＝4.796、P＜0.001）及 血 清miR-139-5p（r＝4.235、P＜0.001）水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)。

3 討論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，其中以卵巢漿液性囊腺癌最為常見，卵巢漿液性囊腺癌發(fā)病早期缺少典型癥狀，易造成漏診及誤診，延誤最佳治療時機(jī)，影響病人預(yù)后，探尋靈敏的早期診斷方法一直為臨床關(guān)注重點(diǎn)［11-12］。相關(guān)研究報(bào)道，卵巢腫瘤發(fā)病、進(jìn)展均和腫瘤病灶中新生血管生成具有密切關(guān)系，且良惡性卵巢腫瘤血管解剖學(xué)與血流動力學(xué)存在明顯差異，有效鑒別此特征可為腫瘤定性診斷提供有力參考［13］。

常規(guī)彩超為卵巢腫瘤常用診斷方法，雖可為腫瘤定性診斷提供一定參考信息，但對腫瘤內(nèi)微小血管、低速血流及位置較深腫瘤內(nèi)血流顯示效果欠佳，診斷準(zhǔn)確性較差。超聲造影在揭示腫瘤血流灌注情況方面具有更高敏感性，可顯示出直徑200 μm以下微小血管，完整地顯示病灶附近及內(nèi)部血液供應(yīng)，特別是低速微小血管，且能顯示病灶內(nèi)不同區(qū)域灌注強(qiáng)度及灌注、消退順序；同時，超聲造影劑于血流中有著較強(qiáng)散射作用，能強(qiáng)化二維超聲影像與血流多普勒信號，清晰顯示病灶內(nèi)血流信號，更準(zhǔn)確評估腫瘤中包含血管狀況，克服腫瘤深度、血管直徑等對血流顯示率的影響，提升腫瘤定性診斷敏感性［14］。楊阿芳［15］研究指出，卵巢漿液性囊腺癌病人的超聲造影增強(qiáng)強(qiáng)度高于良性卵巢腫瘤病人，達(dá)峰時間低于良性卵巢腫瘤病人。本研究中對卵巢漿液性囊腺癌及漿液性囊腺瘤進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢漿液性囊腺癌的增強(qiáng)超聲參數(shù)與漿液性囊腺瘤存在明顯的差別，增強(qiáng)強(qiáng)度較高，而超聲造影的始增時間、達(dá)峰時間短，超聲造影定量參數(shù)中始增時間能反映造影劑在瘤體內(nèi)出現(xiàn)時間，達(dá)峰時間能反映病灶血管床內(nèi)造影劑至最大劑量所需時間，增強(qiáng)強(qiáng)度能反映血管生成密度。相較于良性腫瘤，惡性腫瘤血管密度更高，管徑更粗，易形成血管袢或血管網(wǎng)，且血管通透性高，血管壁較薄，注入造影劑之后，腫瘤病灶血管中微泡流速更快，導(dǎo)致其始增時間、達(dá)峰時間短，增強(qiáng)強(qiáng)度高［16］。結(jié)果說明卵巢漿液性囊腺癌的血流特性在超聲造影上能夠表現(xiàn)出特征性的表現(xiàn)，在進(jìn)一步的多因素回歸分析也顯示，超聲造影的各個參數(shù)均與卵巢漿液性囊腺癌具有明顯相關(guān)性。證實(shí)超聲造影可為卵巢漿液性囊腺癌診斷提供有力參考。

miRNAs可廣泛參與體內(nèi)細(xì)胞生長、分化、衰亡等生命活動調(diào)節(jié)過程，近期研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)內(nèi)miRNAs可為多種腫瘤早期診斷與預(yù)后評價提供有力依據(jù)［17-18］。相關(guān)研究報(bào)道，miR-15、miR-139等均與惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展具有密切關(guān)系［19-20］。本研究中，卵巢漿液性囊腺癌病人血清miR-15a水平降低，血清miR-139-5p水平增高，且其與卵巢漿液性囊腺癌發(fā)病具有明顯相關(guān)性。miR-15家族于腫瘤發(fā)病、進(jìn)展中可起到抑癌基因作用，經(jīng)由靶向調(diào)節(jié)Bcl-2凋亡抑制基因表達(dá)，促使細(xì)胞衰亡；且可經(jīng)調(diào)節(jié)E2F1表達(dá)，阻止細(xì)胞增殖；同時，有研究指出，miR-15a還可調(diào)節(jié)BMI1表達(dá)影響惡性腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移［21］。miR-139-5p的表達(dá)與腫瘤的侵襲性有關(guān)，劉換新等［22］研究指出，在胃癌病人中miR-139-5p表達(dá)可降低，起到抑癌作用。王秀新等［23］研究報(bào)道，在前列腺癌病人中miR-139-5p表達(dá)可增高，起到促癌作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢漿液性囊腺癌病人中miR-139-5p表達(dá)可增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病人預(yù)后具有密切關(guān)系［24-25］。而在本研究資料中發(fā)現(xiàn)，卵巢漿液性囊腺癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人，miR-15的表達(dá)下調(diào)，而miR-139的表達(dá)水平明顯升高，提示其表達(dá)的變化參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，而在超聲造影的參數(shù)也表現(xiàn)出明顯的差異，提示miR-15、miR-139也可能在卵巢漿液性囊腺瘤血管生成中具有調(diào)節(jié)作用。

在進(jìn)一步的研究中的ROC曲線顯示，超聲造影定量參數(shù)與血清指標(biāo)聯(lián)合診斷卵巢漿液性囊腺癌的AUC為0.896，具均高于單一指標(biāo)，具有較好的診斷效能。提示采用超聲造影定量參數(shù)聯(lián)合血清miR-139-5p、miR-15a檢測可顯著提升卵巢漿液性囊腺癌早期診斷效能?？赡芘c超聲造影定量參數(shù)、血清miR-139-5p、miR-15a診斷卵巢漿液性囊腺癌的途徑不同，結(jié)合使用可為疾病診斷提供更多參考信息有關(guān)。

綜上所述，卵巢漿液性囊腺癌超聲增強(qiáng)掃描參數(shù)具有特征性的改變，同時血清miR-139-5p表達(dá)上調(diào)、miR-15a表達(dá)下降，并且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合應(yīng)用超聲造影定量參數(shù)與血清miR-139-5p、miR-15a檢測能增強(qiáng)卵巢漿液性囊腺癌早期診斷效能，可為臨床診治提供一定參考。