顱腦外傷術(shù)后血清神經(jīng)生化標(biāo)志物及其腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)的意義

劉曉剛，劉寒松，王二玲，馮娟，鄭春雷，趙新玲，張寶營

目前臨床評價顱腦損傷主要通過神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查、影像學(xué)檢查等，雖能判斷病變位置、性質(zhì)等，但對病情進(jìn)展、預(yù)后評估尚有欠缺，探尋能直接、定量反映腦組織損傷程度及預(yù)后的指標(biāo)成為神經(jīng)外科研究熱點［1］。中樞神經(jīng)特異性蛋白（S100β）、人腦髓鞘堿性蛋白（MBP）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是神經(jīng)生化標(biāo)志物，測定方便，但在顱腦外傷術(shù)后應(yīng)用價值尚存在爭議［2］。腫瘤蛋白P73（P73）、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38）均為突觸素，在神經(jīng)元存活、神經(jīng)元突起生長及功能維持中起到重要作用。Deng等［3］進(jìn)行的食管癌細(xì)胞體外試驗表明，P73可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡。動物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，P38可減輕大鼠腦缺血∕再灌注損傷，促進(jìn)缺血性腦神經(jīng)的修復(fù)［4］。但現(xiàn)階段關(guān)于顱腦外傷術(shù)后腦脊液中P73、P38蛋白的報道較少。本研究選取101例顱腦外傷術(shù)病人，探討血清神經(jīng)生化標(biāo)志物及其腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)的意義，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年5月至2019年7月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院收治的101例顱腦外傷術(shù)病人作為觀察組，選取同期健康體檢者101例作為對照組，其中觀察組女46例，男55例，年齡范圍24～52歲，年齡（38.07±6.94）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）范圍20～25 kg∕m2，BMI（22.39±1.15）kg∕m2；對照組女50例，男51例，年齡范圍22～54歲，年齡（37.85±7.88）歲，BMI范圍19～24 kg∕m2，BMI（22.48±0.72）kg∕m2。兩組性別、BMI、年齡等資料均衡可比（P＞0.05）。本研究病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組均為全麻下行顱腦外傷術(shù)病人，對照組為健康者；發(fā)病前認(rèn)知功能正常；無精神疾??；未合并腦脊液漏；無顱內(nèi)感染、腦膜炎；入組前1個月無急性腦血管疾病。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：極度營養(yǎng)不良者；開放性顱腦損傷者；合并顱內(nèi)惡性腫瘤者；有吸毒史者；長期應(yīng)用腦血管、神經(jīng)營養(yǎng)藥物者。

1.3 方法

1.3.1血清神經(jīng)生化標(biāo)志物檢測（1）主要試劑：S100β試劑盒（武漢明德生物科技股份有限公司）；MBP試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）；NSE試劑盒（上?？婆d商貿(mào)有限公司）。（2）檢測方法：觀察組于術(shù)后第3天、對照組于入院時空腹?fàn)顟B(tài)下抽取5 mL靜脈血，離心，采用免疫層析法檢測血清S100β水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清MBP、NSE水平。

1.3.2免疫印跡檢測腦脊液中P73、P38蛋白術(shù)后第3天嚴(yán)格無菌操作，行腰椎穿刺留取6 mL腦脊液，軟組織勻漿器制作勻漿，加入裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑、二流蘇糖，離心，取上清，加入一抗、二抗，電泳，轉(zhuǎn)膜，ECL發(fā)光液、定影液、顯影液顯色，圖像分析系統(tǒng)掃描分析。

1.3.3預(yù)后評估方法術(shù)后1個月采用格拉斯哥預(yù)后評分（GOS）［5］評估，分值越高預(yù)后越佳，5、4分為預(yù)后良好，3分為重殘，2、1分為預(yù)后不良，Cronbach’s α為0.833，可信度良好。

1.3.4認(rèn)知功能評估術(shù)后1個月采用美國簡明精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）［6］評估，共19項，包含語言即刻記憶等多個維度，滿分30分，分值越高，認(rèn)知功能越佳，組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.99，可信度良好，認(rèn)知功能損害輕度≥21分，中度10～20分，重度≤9分，若病人仍處于昏迷狀態(tài)，視為重度認(rèn)知功能損害。

1.4 觀察指標(biāo)（1）比較兩組血清神經(jīng)生化標(biāo)志物水平。（2）比較不同預(yù)后病人血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)。（3）分析血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白與GOS評分的相關(guān)性。（4）分析血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白預(yù)測不良預(yù)后的價值。（5）比較不同認(rèn)知功能者血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)。（6）分析血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白與MMSE評分相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗。計數(shù)資料用例（%）表示，比較以χ2檢驗。此外，采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。采用接收者操作特征（ROC）曲線及ROC下面積（AUC）分析各指標(biāo)預(yù)測不良預(yù)后的價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較兩組血清神經(jīng)生化標(biāo)志物水平觀察組血 清S100β、MBP、NSE較 對 照 組 高（P＜0.05）。見表1。

表1 顱腦外傷術(shù)病人及健康體檢者各101例血清神經(jīng)生化標(biāo)志物水平比較/±s

表1 顱腦外傷術(shù)病人及健康體檢者各101例血清神經(jīng)生化標(biāo)志物水平比較/±s

注：S100β為中樞神經(jīng)特異性蛋白，MBP為人腦髓鞘堿性蛋白，NSE為神經(jīng)元特異性烯醇化酶。

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2.2 比較不同預(yù)后病人血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)101例病人手術(shù)方式為全麻下標(biāo)準(zhǔn)大骨瓣開顱術(shù)或改良標(biāo)準(zhǔn)大骨瓣開顱術(shù)。不同預(yù)后病人一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同預(yù)后病人間血清S100β、MBP、NSE及腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；預(yù)后良好、重殘、不良病人血清S100β、MBP、NSE表達(dá)依次遞增，腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)依次遞減（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 101例顱腦外傷術(shù)病人一般資料比較

圖1 各組腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)

2.3 分析血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白與GOS評分的相關(guān)性101例病人GOS評分范圍為1～5分，GOS評分（3.75±1.02）分。術(shù)后第3天血清S100β、NSE與術(shù)后1個月GOS評分呈負(fù)相關(guān)（r1=-0.644，P1＜0.001；r2=-0.522，P2＜0.001），腦脊液中P73、P38蛋白與GOS評分呈正相關(guān)（r1=0.604，P1＜0.001；r2=0.529，P2＜0.001）；血清MBP與GOS評分無相關(guān)性（r=0.067，P=0.509）。

2.4 分析血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白預(yù)測不良預(yù)后的價值經(jīng)ROC分析發(fā)現(xiàn)，S100β預(yù)測不良預(yù)后AUC最大，為0.902，截斷值為1.48 μg∕L，敏感度為75.00%，特異度為94.12%，見圖2、表3。

表3 ROC分析結(jié)果

圖2 ROC曲線分析

2.5 比較不同認(rèn)知功能者血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)不同認(rèn)知功能者血清S100β、NSE、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；認(rèn)知功能損害輕度、中度、重度血清S100β、NSE依次升高，腦脊液中P73、P38蛋白依次降低（P＜0.05）；不同認(rèn)知功能者血清MBP比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

表4 不同認(rèn)知功能者血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)比較∕±s

表4 不同認(rèn)知功能者血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)比較∕±s

注：S100β為中樞神經(jīng)特異性蛋白，MBP為人腦髓鞘堿性蛋白，NSE為神經(jīng)元特異性烯醇化酶，P73為腫瘤蛋白，P38為P38絲裂原活化蛋白激酶。①與輕度組比較，P＜0.05。②與中度組比較，P＜0.05。

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圖3 腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)

2.6 分析血清神經(jīng)生化標(biāo)志物、腦脊液中P73、P38蛋白與MMSE評分相關(guān)性101例病人MMSE評分范圍為8～22分，MMSE評分（17.75±2.03）分。術(shù)后第3天血清S100β、NSE與術(shù)后1個月MMSE評分呈負(fù)相關(guān)（r1=-0.677，P1＜0.001；r2=-0.575，P2＜0.001），腦脊液中P73、P38蛋白與MMSE評分呈正相關(guān)（r1=0.570，P1＜0.001；r2=0.548，P2＜0.001）；血 清MBP與MMSE評分無相關(guān)性（r=-0.025，P=0.807）。

3 討論

目前尚缺乏早期預(yù)測顱腦外傷術(shù)后病人預(yù)后有效指標(biāo)，不利于疾病的治療與臨床結(jié)局的改善，因此研究具有高靈敏度、特異度指標(biāo)至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血清S100β、MBP、NSE較對照組高，且預(yù)后良好、重殘、不良病人血清S100β、MBP、NSE表達(dá)依次遞增，腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)依次遞減（P＜0.05），提示血清S100β、MBP、NSE及腦脊液中P73、P38蛋白可能與顱腦損傷病人預(yù)后有關(guān)。S100β主要生理功能是參考信息傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和可塑性、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度等，正常狀態(tài)下位于神經(jīng)膠質(zhì)中，發(fā)生腦損傷后，可通過受損血腦屏障進(jìn)入外周血，故檢測其水平可評估腦損傷程度［7］。宋健楠等［8］通過雙側(cè)頸總動脈夾閉＋基底動脈絲線提拉法制備全腦缺血∕再灌注損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，模型大鼠S100β表達(dá)明顯升高，且電鏡下觀察可見神經(jīng)元線粒體的超微結(jié)構(gòu)損傷，指出S100β可評價腦損傷情況。Zhou等［9］研究指出，S100β高表達(dá)于腦出血病人外周血中，且功能預(yù)后較差病人血清S100β濃度高于功能預(yù)后良好病人，支持本研究結(jié)論。

NSE受外界環(huán)境影響較小，是一種較為穩(wěn)定指標(biāo)，正常狀態(tài)下極低表達(dá)于血清中，當(dāng)神經(jīng)元受損、血腦屏障通透性增加時可大量釋放入血［10］。根據(jù)Choi等［11］報道，NSE與神經(jīng)元損傷程度密切相關(guān)。MBP位于髓鞘漿膜面，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的主要蛋白質(zhì)，具有神經(jīng)系統(tǒng)特異性［12］。動物學(xué)研究顯示，顱腦損傷大鼠血清MBP水平高于假手術(shù)對照大鼠［13］?，F(xiàn)階段雖然GOS評分是評估顱腦外傷病人預(yù)后可靠方法，但多在顱腦損傷術(shù)后較長時期應(yīng)用，不利于早期評估。本研究采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第3天血清S100β、NSE與術(shù)后1個月GOS評分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），提示通過檢測外周血S100β、NSE可在術(shù)后早期預(yù)測病人預(yù)后，從而為臨床治療提供重要參考。進(jìn)一步進(jìn)行ROC分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測不良預(yù)后的AUC S100β＞P38蛋白＞P73蛋白＞NSE＞MBP，最佳截斷值分別為1.48 μg∕L、0.25、0.21、14.18 μg∕L、7.72 mg∕L，可為臨床預(yù)測預(yù)后提供量化參考。

顱腦外傷術(shù)后病人常伴有不同程度認(rèn)知功能障礙，并與后續(xù)生活質(zhì)量密切相關(guān)，故術(shù)后早期準(zhǔn)確評估病人認(rèn)知功能意義重大［14］。以往多通過MMSE量表評估認(rèn)知功能，其可信度已被以往研究證實，但其適用于意識清醒病人，而顱腦損傷術(shù)后早期病人可能處于昏迷狀態(tài)，故應(yīng)用受限［15］。P73、P38為存在于突觸囊泡的蛋白，參與多種突觸相關(guān)活動，可反映突觸數(shù)量、分布，在突觸重建、認(rèn)知功能中起到重要作用［16］。何陽［17］的報道顯示，P38是認(rèn)知功能維持重要因子，與腦積水病人手術(shù)認(rèn)知功能變化息息相關(guān)。馮輝等［18］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)針對性治療干預(yù)，外傷后腦積水病人腦脊液P73、P38表達(dá)升高，認(rèn)知功能得到改善，間接說明P73、P38蛋白與外傷后腦損傷及認(rèn)知功能有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能損害輕度、中度、重度血清S100β、NSE依次升高，腦脊液中P73、P38蛋白依次降低，且術(shù)后第3天血清S100β、NSE與術(shù)后1個月MMSE評分呈負(fù)相關(guān)，腦脊液中P73、P38蛋白與MMSE評分呈正相關(guān)（P＜0.001），佐證了各指標(biāo)可用于術(shù)后早期病人認(rèn)知功能的評估。Baptista等［19］指出，較高水平S100β與認(rèn)知功能受損有關(guān)。劉森等［20］研究發(fā)現(xiàn)，重度血管性癡呆病人血清S100β水平均高于輕度、中度癡呆病人，并與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)，從側(cè)面論證了本研究結(jié)論。郭曉光［21］的報道采用模擬物上調(diào)阿爾茨海默病模型大鼠P73的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其海馬區(qū)組織細(xì)胞凋亡率降低，認(rèn)知功能改善，而采用小RNA技術(shù)沉默P73的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)促凋亡因子被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，證實P73可對認(rèn)知功能產(chǎn)生影響。有研究建立了創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，通過莫里斯水迷宮分析法評估認(rèn)知缺陷，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠認(rèn)知功能受損，P38表達(dá)降低，而給予白藜蘆醇干預(yù)后，P38表達(dá)增加，并伴有認(rèn)知功能的改善，提示P38與認(rèn)知功能有關(guān)，支持本研究結(jié)論［22-23］。值得注意的是，檢測P73、P38蛋白需采集腦脊液，具有一定風(fēng)險，臨床應(yīng)根據(jù)實際情況選取合適的指標(biāo)。

綜上所述，檢測顱腦外傷病人血清S100β、NSE及腦脊液中P73、P38蛋白表達(dá)可在術(shù)后早期預(yù)測病人預(yù)后與認(rèn)知功能，為臨床干預(yù)提供重要參考。