天麻遺傳多樣性研究

王彩云，侯俊，周茂嫦，李恒謙，成忠均，王永，張翔宇

（1.畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700；2.大方縣扶貧開發(fā)辦公室，貴州 畢節(jié) 551700）

天麻（Gastrodia elataBl.）為蘭科天麻屬多年生草本植物，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，含對(duì)羥基苯甲醇、多糖、腺苷、天麻素、巴利森苷等多種活性成分［1-5］，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、鎮(zhèn)靜安神、抗癲癇、健腦增智、治療老年性癡呆癥、調(diào)節(jié)腸道菌群、延緩衰老、抗氧化、抗炎、降壓、抗抑郁、調(diào)節(jié)心腦血管、神經(jīng)保護(hù)等功能［6-13］。全世界有30多種天麻屬植物，中國確認(rèn)的有13種，分別為天麻、疣天麻（Gastrodia tuberculata.F.Y.Liu et S.C.Chen）、細(xì)天麻（Gastrodia gracilisBI.）、原天麻（Gastrodia angustaS.Chow S.C.Chen）、夏天麻（Gastrodia flabilabellaS.S.Ying.）、南天麻（Gastrodia JavanicaBI.Lindi）、冬天麻（Gastrodia hiemalisT.P.Lin.）、勐海天麻（Gastrodia menghaiensisZ.H.Tsi & S.C.Chen.）、秋天麻（Gastrodia autumnalisT.P.Lin.）、春天麻（Gastrodia fontinalisT.P.Lin.）、八 代 天 麻（Gastrodia confusaHonda &Tuyama.）、無喙天麻（Gastrodia appendiculataC.S.Leou & N.J.Chung.）、北插天天麻（Gastrodia peichatienianaS.S.Ying.），其中中國主要分布的、載入中國藥典的是天麻，按照塊莖形狀、含水量的不同、花及莖桿顏色又分為黃天麻（Gastrodia elataBI.f.flavida S.Chow）、烏天麻（Gastrodia elataBI.f.glauca S.Chow）、紅天麻（Gastrodia elataBI.F.elata）、綠天麻（Gastrodia elataBI.F.viridis Mak.）、毛天麻（Gastrodia elataBI.F.Pilifera Tuyama）和松天麻（Gastrodia elataBI.F.alba S.Chow）6個(gè)變型［14］。隨著天麻被列入保健食品名錄，其需求量逐漸增大，野生天麻供不應(yīng)求，人工馴化栽培雖能緩解部分市場壓力，但長期跨地區(qū)引種、無性繁殖、有性雜交育種，造成市場上種質(zhì)資源混亂，給天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來巨大的潛在危機(jī)。不同天麻塊莖在表觀性狀上差異不大，而天麻素、天麻苷元等有效成分含量差異卻極大，且混偽品泛濫，導(dǎo)致藥材品質(zhì)良莠不齊，給天麻生產(chǎn)、臨床用藥、產(chǎn)品開發(fā)造成極大的困難。因此，亟需研究該藥材的遺傳多樣性，為天麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科技支撐。

作為藥食兩用植物，天麻一直是研究熱點(diǎn)，目前的研究主要集中于生物學(xué)特性、化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用等多個(gè)方面［15-19］。在天麻的遺傳多樣性研究中，傳統(tǒng)的研究主要基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記，20世紀(jì)90年代后主要基于DNA分子標(biāo)記，近幾年主要基于測序技術(shù)研究其親緣關(guān)系、遺傳進(jìn)化以及資源分類鑒定等［20-23］。本研究從表型性狀、細(xì)胞學(xué)水平、生化標(biāo)記以及分子標(biāo)記4個(gè)方面對(duì)天麻遺傳多樣性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為天麻的資源保護(hù)、深入研究以及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 遺傳多樣性研究的意義

了解天麻的遺傳多樣性有助于評(píng)估其資源的瀕危狀況，以便采取必要手段保護(hù)天麻資源，最終實(shí)現(xiàn)天麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。遺傳多樣性研究的方法很多，如較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析、細(xì)胞學(xué)分析以及生化標(biāo)記等，目前使用較為普遍的方法為DNA分子標(biāo)記技術(shù)，其中應(yīng)用于天麻遺傳多樣性分析的已有近10種［14，24］。天麻的遺傳多樣性較豐富，為天麻種質(zhì)資源的改良以及保護(hù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

開展植物群體遺傳結(jié)構(gòu)及影響因子的研究對(duì)植物資源的遺傳改良、保護(hù)、開發(fā)利用有重要意義［25，26］。在中國，天麻為廣域分布藥材，但受道地藥材理念的影響，以致野生天麻價(jià)格遠(yuǎn)高于栽培天麻，致使野生天麻資源遭到過度采挖，最終導(dǎo)致其淪為瀕危物種，這種狀況在一定程度上影響了天麻的遺傳多樣性。目前有關(guān)天麻遺傳多樣性研究的報(bào)道相對(duì)較少，尤其是細(xì)胞學(xué)標(biāo)記以及生化標(biāo)記方面，開展天麻的遺傳多樣性研究，有利于優(yōu)良天麻資源的選育，更有利于提高天麻產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

2 遺傳多樣性研究方法

生物進(jìn)化的基礎(chǔ)是遺傳多樣性，任意物種都有其獨(dú)特的基因庫或遺傳組織形式。遺傳多樣性有廣義與狹義之分，前者是指地球上生物體所攜帶的各種遺傳信息之和，后者指的是一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體之間或者種內(nèi)不同種群之間的遺傳變異總和［27］。遺傳多樣性可以從不同的層次來表現(xiàn)，通常表現(xiàn)在表型性狀水平、細(xì)胞學(xué)水平、生化水平及分子水平。

2.1 表型性狀多樣性分析

天麻表型性狀多樣性分析是基于天麻形態(tài)學(xué)標(biāo)記來完成的，即根據(jù)表型上的差異，如天麻塊莖形狀、長度、寬度、長寬比、箭芽顏色、肚臍眼大小、花色、莖桿顏色、點(diǎn)狀橫紋環(huán)數(shù)等性狀的不同來反映其遺傳多樣性，這些表型性狀大多肉眼可見，無需太高的技術(shù)含量，對(duì)操作者要求不高，也無需高端儀器設(shè)備，節(jié)省資金，不僅能標(biāo)記數(shù)量性狀而且還可以標(biāo)記質(zhì)量性狀，因此，形態(tài)學(xué)標(biāo)記作為傳統(tǒng)的遺傳多樣性研究方法在育種及植物分類工作中起到重要作用。

目前，很多學(xué)者將形態(tài)學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于天麻的資源鑒定以及育種等工作中。如王秋穎等［28］基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記，采用雜交育種方法選育出2個(gè)適宜大面積推廣應(yīng)用的高產(chǎn)天麻種。王麗等［29］研究了昭通烏天麻塊莖的農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)烏天麻變異較大的性狀為肚臍眼直徑、環(huán)間距、塊莖鮮重，點(diǎn)狀橫環(huán)紋環(huán)數(shù)、塊莖長、寬、厚以及長寬比為較穩(wěn)定性狀；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)烏天麻的最突出農(nóng)藝性狀指標(biāo)為塊莖長、寬、厚，生產(chǎn)上可作為高產(chǎn)品種選育的參考指標(biāo)；道地藥材質(zhì)量控制的性狀指標(biāo)為點(diǎn)狀橫紋環(huán)數(shù)和塊莖長寬比。李振斌等［30］采取生藥學(xué)常規(guī)方法，對(duì)比觀察了紅天麻、烏天麻、綠天麻的原植物形態(tài)、顯微特征、藥材性狀，同時(shí)觀察了花粉塊的掃描電鏡特征，找出了其主要鑒別特征。

2.2 細(xì)胞水平多樣性分析

基于細(xì)胞學(xué)標(biāo)記來研究的細(xì)胞水平遺傳多樣性，即根據(jù)細(xì)胞染色體核型和帶型差異分析染色體的多樣性，進(jìn)而分析物種的遺傳多樣性。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記在天麻遺傳多樣性研究中的應(yīng)用較少，主要集中于研究天麻的退化、消化、染色體變異等方面。張維經(jīng)等［31］研究了天麻消化細(xì)胞的消化行為，發(fā)現(xiàn)天麻消化細(xì)胞消化能力的衰退與天麻無性繁殖的增殖率下降一致，即隨著種植年限的延長，天麻產(chǎn)量逐漸下降，同時(shí)天麻皮層細(xì)胞中的蜜環(huán)菌［Armillaria mellea（Vahl）P.Kumm.］菌絲侵入消化細(xì)胞后釋放出大量細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致消化細(xì)胞的核畸形化并出現(xiàn)多核仁，體積增大。梁漢興［32］1984年以花粉小孢子為試驗(yàn)材料研究原天麻單倍體的染色體數(shù)目，王德信［33］2010年又以同樣的材料，研究減數(shù)分裂過程中的細(xì)胞學(xué)特性，提出天麻單倍體的染色體數(shù)目為18，但未能很好地呈現(xiàn)天麻的染色體特征，染色體倍數(shù)也未能鑒定出。

雖然細(xì)胞學(xué)標(biāo)記不易受外界環(huán)境因素的影響，但仍存在許多不足，如培育材料需花費(fèi)較長時(shí)間，染色體的制片和觀察要求操作者具備一定的理論基礎(chǔ)及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，通過細(xì)胞學(xué)標(biāo)記能獲得的標(biāo)記數(shù)量也不多，尤其是同一物種的不同個(gè)體之間染色體特征差異不大。因此，在開展天麻的遺傳多樣性研究時(shí)，不能僅依賴于細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果來判斷。

2.3 生化水平多樣性分析

生化水平多樣性分析主要基于蛋白質(zhì)多樣性分析，即從貯藏蛋白、同工酶等變異來研究作物種內(nèi)、種間的遺傳多樣性。在天麻的生化水平多樣性研究中大部分基于同工酶、等位酶分析，即在蛋白質(zhì)水平，依靠酶分子的構(gòu)象、帶電荷數(shù)、大小、在電場中的遷移速率以及形成譜帶數(shù)目等不同，直接鑒定天麻不同品種間的遺傳差異［34］。因其具有受外界環(huán)境影響較小、試驗(yàn)技術(shù)要求不高、成本低、結(jié)果易于比較、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，在植物遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用。

2.3.1 同工酶分析近年來，同工酶分析被大量應(yīng)用于天麻親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源鑒定，種類、種間遺傳多樣性分析等方面。張躍進(jìn)等［35］提出不同天麻種質(zhì)之間的過氧化物酶同工酶譜有著很高的多態(tài)性，按照1977年Garva等提出的“同工酶條帶越多的品系越進(jìn)化”的理論，卵果天麻較原始，其同工酶譜條帶最少；紅桿天麻的條帶最多，最為進(jìn)化，其結(jié)果與季景玉［36］利用同工酶研究秦巴山區(qū)天麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性時(shí)得出的結(jié)果一致。陳文強(qiáng)等［37］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳研究了綠天麻、紅天麻、烏天麻的過氧化物酶同工酶的活性差異，發(fā)現(xiàn)不同變型天麻的酶活性不同，表現(xiàn)為紅天麻和烏天麻的酶譜條帶數(shù)相同，均為7條，相似度指數(shù)為0.86，暗示他們之間的親緣關(guān)系較近；綠天麻的酶譜條數(shù)為5條，與烏天麻的相似度指數(shù)為0.71，暗示其親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。潘瑞樂等［38］研究了不同發(fā)育階段天麻的可溶性蛋白和過氧化物酶同工酶的差異性，發(fā)現(xiàn)酶譜特征與生長發(fā)育階段相關(guān)，具體表現(xiàn)：白麻和箭麻未抽苔階段酶帶數(shù)少、活性低；抽苔開花階段酶帶數(shù)多、活性高。姜玲等［39］研究了紅天麻、烏天麻及其雜交種的過氧化物酶同工酶譜帶差異，發(fā)現(xiàn)紅天麻、烏天麻正交所得的雜交種譜帶表現(xiàn)出明顯的親本互補(bǔ)關(guān)系。2.3.2等位酶分析將等位酶分析應(yīng)用于天麻遺傳多樣性研究的報(bào)道較少。目前僅發(fā)現(xiàn)李作洲等［40］利用超薄平板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳研究湖北省西部4種變型天麻的等位酶遺傳變異，結(jié)果在6個(gè)酶系共發(fā)現(xiàn)17個(gè)清晰位點(diǎn)和37個(gè)等位基因，其中多肽位點(diǎn)有11個(gè)，位點(diǎn)最大等位基因數(shù)為4，表現(xiàn)出變型特異性的是位點(diǎn)Acp-4和Prx-2的等位基因；遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，不同變型天麻的遺傳多樣性較低，平均預(yù)期雜合度He=0.146，每位點(diǎn)平均等位基因數(shù)A=1.7，平均多態(tài)位點(diǎn)比率P=42.2%，其中烏天麻遺傳多樣性最高，藥天麻最低；而在物種水平上遺傳多樣性較高（P=56.3%，A=2.1，He=0.221）。

2.4 分子水平多樣性分析

分子水平多樣性研究是基于DNA堿基序列差異分析作物的遺傳多樣性。相比細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、生化標(biāo)記，DNA分子標(biāo)記微量分析特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、直接快速、多態(tài)性高、信息量大，不受生長發(fā)育階段以及組織、環(huán)境條件的影響，不存在上位性效應(yīng)，是目前分析作物遺傳多樣性的最佳選擇。近年來，該技術(shù)被普遍應(yīng)用于天麻的遺傳多樣性分析中，應(yīng)用較多的主要為RAPD、SSR、AFLP、ISSR以及ITS序列分析技術(shù)。

2.4.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）RAPD標(biāo)記技術(shù)于1990年由John G.K.Williams等建立，基于PCR，以人工合成的隨機(jī)短核苷酸序列（一般為10個(gè)堿基）為引物對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，判斷擴(kuò)增片段的多樣性。該方法所需引物沒有種屬限制，無需專門設(shè)計(jì)，即可以在DNA序列信息未知的情況下，對(duì)物種基因組進(jìn)行分析，具有操作簡單、檢測快速，不受環(huán)境狀況、數(shù)量遺傳性狀、發(fā)育階段的影響等優(yōu)勢，即便是親緣關(guān)系非常相近的個(gè)體間的遺傳差異也能有效區(qū)分，在植物分類及遺傳多樣性研究中具有很明顯的優(yōu)越性，目前被廣泛用于天麻遺傳多樣性研究中，但該技術(shù)擴(kuò)增得到的片段重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，特異性不強(qiáng)。

陶鈞等［41］優(yōu)化了RAPD擴(kuò)增條件和方法，獲得了天麻基因組DNA指紋圖譜。鄒佳寧等［42］利用RAPD技術(shù)分析貴州同一產(chǎn)地栽培、野生天麻的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)栽培與野生天麻之間遺傳變異明顯，而且生長環(huán)境和地理分布是造成天麻豐富遺傳多態(tài)性的重要因素。王德信［43］建立了黃、烏、綠3種變型天麻的RAPD分析圖譜，發(fā)現(xiàn)天麻變異程度較大，多態(tài)性變異率高達(dá)65.1%，其中遺傳多樣性最豐富、變異最為復(fù)雜的是烏天麻。趙熙等［44］采用RAPD技術(shù)研究天麻的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系最近的是黃天麻和烏天麻，與綠天麻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，該結(jié)果與王德信［43］的研究結(jié)果存在一定差異。李相陵［45］利用RAPD技術(shù)研究貴州省不同產(chǎn)區(qū)不同變型天麻栽培品種F1代的遺傳多樣性，共獲得138條譜帶，擴(kuò)增位點(diǎn)分子為200?2 000 bp，其中92條為多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為66.92%?85.90%，暗示不同產(chǎn)區(qū)不同變型天麻之間具有較大的遺傳差異。陶鈞［46］采取RAPD技術(shù)開展天麻基因組DNA的多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的多態(tài)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)天麻遺傳距離系數(shù)與其產(chǎn)地、莖桿顏色之間存在明顯的相關(guān)性，遺傳距離最遠(yuǎn)的為綠桿天麻與紅桿天麻。

2.4.2 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplifid fragment length polymorphism，AFLP）AFLP標(biāo) 記 是 基 于RFLP和PCR技術(shù)，通過限制性內(nèi)切酶將基因組DNA酶切成分子大小不等的片段，然后進(jìn)行擴(kuò)增、電泳，根據(jù)擴(kuò)增片段長度的不同來分析DNA多態(tài)性的一種DNA指紋分析技術(shù)。不同于其他分子標(biāo)記技術(shù)，AFLP技術(shù)用PCR擴(kuò)增取代Southern雜交來得到限制性片段，不僅分辨率、靈敏度高，檢測到的基因位點(diǎn)數(shù)量多，重復(fù)性好，多態(tài)性強(qiáng)，穩(wěn)定性高；選用不同的基因型DNA以及引物組合，獲得的酶切位點(diǎn)不同，因此出現(xiàn)擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性，而且還能檢測到親緣關(guān)系非常近的品種間的DNA差異，被稱為一種高效精準(zhǔn)檢測種間種內(nèi)遺傳差異的技術(shù)，但該方法要求內(nèi)切酶質(zhì)量和DNA純度很高，價(jià)格昂貴。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物遺傳、育種等研究領(lǐng)域，目前是國際上構(gòu)建DNA指紋圖譜的一種新方法。

謝淵等［47，48］構(gòu)建了11份不同來源天麻資源的AFLP指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)天麻各品種之間遺傳距離為0.079 2?0.600 4，UPGMA聚類分析將11份樣品分為兩大組群，而貴州省天麻一群又被分為2個(gè)子群。關(guān)萍［49］分析了引自云南、貴州、四川、遼寧和陜西4省的27份天麻樣品的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)天麻樣品之間具有一定的遺傳多樣性，多態(tài)性比率為78%，遺傳距離為0.018 7?0.593 0；其中貴州省天麻樣品的遺傳差異大于其他省份，暗示貴州省產(chǎn)區(qū)基因資源相對(duì)豐富，是遺傳改良及良種選育的重要種質(zhì)基礎(chǔ)，施秉與大方的天麻樣品遺傳距離最大，為0.593 4，桐梓與梵凈山的遺傳距離最小，為0.000 8；AFLP分析結(jié)果表明，不同變型天麻在分子水平上差異不明顯，暗示天麻種內(nèi)的變型僅僅是表型上的變異，尚未在遺傳上固定下來。程紀(jì)倫等［50］利用AFLP技術(shù)對(duì)23份野生天麻樣品進(jìn)行遺傳差異分析，獲得約72%的多態(tài)性位點(diǎn)，表明貴州省野生天麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富，與鄒佳寧等［42］利用RAPD技術(shù)研究天麻種質(zhì)的遺傳差異得出的結(jié)果相差不大，多態(tài)性位點(diǎn)為70.97%。趙永亮等［51］用AFLP和RAPD技術(shù)研究不同主產(chǎn)區(qū)的7份栽培天麻和2份野生天麻的遺傳差異和聚類情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法得到的聚類圖相似，能明顯區(qū)分不同海拔高度和產(chǎn)區(qū)的樣品，此外，發(fā)現(xiàn)天麻、蜜環(huán)菌二者間沒有共同條帶，表明它們之間不存在DNA的相互作用。季景玉［36］運(yùn)用AFLP分子標(biāo)記對(duì)天麻不同種質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻群體內(nèi)的相似系數(shù)為0.79?0.86，遺傳距離最小的是紅桿天麻與綠桿天麻，遺傳距離最大的是紅桿天麻與卵果天麻，該結(jié)果與同工酶分析結(jié)果相符。

2.4.3 微 衛(wèi) 星DNA（Simple sequence repeat，SSR）微衛(wèi)星DNA又稱為SSR簡單重復(fù)序列，真核生物基因組中含有大量的簡單重復(fù)序列，通常由1?4個(gè)堿基組成，最常見的為（GA）n、（AC）n等雙核苷酸重復(fù)序列。SSR標(biāo)記以DNA的形式直接出現(xiàn)，不受季節(jié)、環(huán)境的影響，不存在是否表達(dá)的問題，在天麻的不同發(fā)育時(shí)期組織均能檢測到，并且結(jié)果可靠，試驗(yàn)重復(fù)性好，檢測位點(diǎn)多，供試材料需要量少，具有經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)勢，在天麻種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳差異分析等方面應(yīng)用廣泛［20］。目前，因?yàn)樘炻榈幕蚪M信息有限，SSR標(biāo)記的開發(fā)受到影響，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，越來越多的天麻基因組將被測序，更有利于遺傳多樣性的研究。

陳琦等［52］應(yīng)用SSR技術(shù)研究貴州省栽培和野生天麻的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)栽培天麻和野生天麻的遺傳相似度較接近，栽培天麻的變異度相對(duì)較大。陳祖云等［53］采用SSR技術(shù)分析貴州省4個(gè)居群的野生天麻和栽培天麻，發(fā)現(xiàn)有性繁殖天麻均擴(kuò)增出2條帶，為雜合子；無性繁殖天麻及野生天麻只能擴(kuò)增出1條帶，為純合子，表明該技術(shù)能明顯區(qū)分栽培及野生天麻、有性繁殖及無性繁殖天麻。

周天華等［14］采取SSR分子標(biāo)記方法研究烏、紅、綠3種變型天麻，12個(gè)種群的遺傳多樣性，并構(gòu)建DNA指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)天麻在種群間和變型間分化現(xiàn)象均較明顯，均存在較高的遺傳多樣性。王曉麗等［54］采用SSR技術(shù)研究天麻親本及其雜交種F1代，發(fā)現(xiàn)雜交種F1代表現(xiàn)出親本互補(bǔ)帶型，能明顯區(qū)分于其親本材料。吳會(huì)芳［55］運(yùn)用SSR標(biāo)記檢測6個(gè)人工居群和8個(gè)自然居群共483份天麻樣品，共擴(kuò)增出77條清晰、重復(fù)性高的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶64條，多態(tài)位點(diǎn)百分比為83.12%；遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，天麻自然居群（Ho=0.06，He=0.53）與栽培居群（Ho=0.16，He=0.47）均表現(xiàn)為雜合子的嚴(yán)重缺乏，栽培居群的平均有效等位基因（Ae=2.59）和平均等位基因（A=4.20）均低于自然居群（Ae=2.62，A=5.05），檢測到栽培居群中的特有等位基因比自然居群少27個(gè)，表明栽培居群的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，遺傳均質(zhì)性問題明顯。Xu等［21］設(shè)計(jì)了32對(duì)引物，并對(duì)8個(gè)野生種群的32個(gè)個(gè)體進(jìn)行了SSR分析，共發(fā)現(xiàn)13個(gè)微衛(wèi)星座高度多態(tài)性，每個(gè)座3?10個(gè)等位基因，基因多樣性0.400?0.841。Chen等［20］采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)天麻居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)天麻居群內(nèi)的多樣性明顯低于其他蘭科植物，在總的遺傳多樣性中天麻居群間的貢獻(xiàn)率達(dá)20%。

2.4.4 簡單重復(fù)序列間區(qū)（Inter simple sequence repeat，ISSR）ISSR標(biāo)記技術(shù)是1994年由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz在SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)上提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)分析的是一段短的位于2個(gè)簡單重復(fù)序列之間的DNA序列多態(tài)性［56］。該技術(shù)以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的兩端加錨隨機(jī)核苷酸，PCR反應(yīng)過程中，錨定引物引起特異位點(diǎn)退火，造成不太大的與錨定引物互補(bǔ)的SSR序列之間的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的條帶經(jīng)電泳能展現(xiàn)基因組內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)的序列多樣性［57］。ISSR標(biāo)記具有SSR和RAPD的優(yōu)勢，即具有多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性較高，通用性強(qiáng)，樣品用量少，不需要試劑盒，試驗(yàn)成本低，操作簡單，結(jié)果便于記錄等優(yōu)點(diǎn)［58］，在天麻種質(zhì)資源鑒定以及遺傳多樣性研究中應(yīng)用廣泛。

關(guān)萍等［59］采取ISSR分子標(biāo)記方法分析貴州省產(chǎn)區(qū)9個(gè)種群天麻的遺傳多樣性，共擴(kuò)增出清晰的、大小為200?1 600 bp的譜帶120條，其中具有多態(tài)性的為97條，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)80.83%，揭示天麻在物種水平上的遺傳多樣性較高，種群間則較低，多態(tài)百分率為17.50%?40.83%，平均值為25.56%；經(jīng)測算，物種水平上的Nei’s遺傳多樣性（He）為0.042? 0.153，平均為0.073；Nei’s基因分 化系數(shù)（G）為0.637 7，表明天麻種群間的遺傳變異占總變異的63.77%，而種群內(nèi)的遺傳變異占總變異的36.23%。吳會(huì)芳［55］運(yùn)用ISSR標(biāo)記檢測6個(gè)人工居群和8個(gè)自然居群共483份天麻樣品，共檢測出77條重復(fù)性好、清晰穩(wěn)定的DNA帶譜，其中有64條多態(tài)性帶譜，總的多態(tài)性率為83.12%，遺傳多樣性分析結(jié)果顯示人工栽培天麻居群的遺傳多樣性參數(shù)明顯低于自然居群，暗示栽培居群遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳均質(zhì)性現(xiàn)象明顯；聚類分析將栽培居群與自然居群聚為兩大類群，說明二者之間存在明顯的分化。李相陵［45］通過試驗(yàn)構(gòu)建了ISSR-PCR反應(yīng)體系，篩選出2個(gè)擴(kuò)增效果好的ISSR引物，在對(duì)12份天麻樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增時(shí)得到大小為200?2 000 bp的條帶128條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為66.7%?88.9%；聚類圖將紅天麻與烏天麻各聚為一類，與RAPD結(jié)果基本相符。陳祖云等［60］采用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析貴州省產(chǎn)區(qū)野生、栽培天麻之間的遺傳關(guān)系，構(gòu)建指紋圖譜，共篩選出有效引物4個(gè)，于23份供試天麻中檢測到32個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)29個(gè)，多態(tài)率為90.63%；聚類分析結(jié)果表明，23個(gè)居群的相似性系數(shù)為0.13?1.00，不同產(chǎn)區(qū)綠天麻、烏天麻的變異程度較高，紅天麻、黃天麻的變異程度較低，野生綠天麻與栽培天麻的遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.4.5 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）SRAP標(biāo)記基于PCR擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)啟動(dòng)子和內(nèi)含子AT含量豐富而外顯子GC含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)基因開放閱讀框區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，因不同物種或者個(gè)體內(nèi)含子和間隔區(qū)域長度的不同而呈現(xiàn)多態(tài)性。SRAP技術(shù)提出于2001年，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、在基因中分布均勻、可兩兩組合提高引物效率、引物通用等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的重要性狀基因標(biāo)記、遺傳圖譜的構(gòu)建、評(píng)價(jià)鑒定等方面，但在天麻中的應(yīng)用還比較局限。

鄧薇等［61］采用SRAP技術(shù)研究3個(gè)不同變型天麻的遺傳關(guān)系，結(jié)果篩選出SRAP引物7對(duì)，通過PCR擴(kuò)增11批天麻樣品，得到清晰條帶145條，其中具有多態(tài)性的為110條，多態(tài)百分率達(dá)75.86%；UPGMA聚類分析將紅天麻與綠天麻聚為一類，烏天麻聚為一類，表明3個(gè)不同變型的天麻中，烏天麻與綠天麻、紅天麻的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而紅、綠天麻之間具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系。黃萬兵等［62］利用cDNA-SRAP技術(shù)研究蜜環(huán)菌與紅天麻共生前后的差異表達(dá)基因情況，發(fā)現(xiàn)未被侵染白麻在轉(zhuǎn)錄水平獲得64條特異的差異條帶，被侵染的白麻為53條，從被侵染白麻的差異表達(dá)基因片段STDFs中選取31個(gè)穩(wěn)定片段進(jìn)行TA克隆以及序列比對(duì)分析，根據(jù)功能預(yù)測可分為7類，即未知功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞膜通透性、染色質(zhì)重塑、能量與代謝、自交不親和性及抗性相關(guān)基因，部分cDNA-SRAP表達(dá)譜結(jié)果也與S-TDFs熒光定量（qPCR）結(jié)果一致，表明該技術(shù)能有效分析蜜環(huán)菌與天麻共培養(yǎng)時(shí)差異表達(dá)基因，可作為一種有效手段分析二者的共生分子調(diào)控機(jī)制。柴錕等［63］通過SRAP技術(shù)研究天麻的遺傳多樣性，提出天麻生態(tài)型間的變異要小于生態(tài)型內(nèi)，而同一生態(tài)型天麻之間，烏天麻和綠天麻的遺傳性變異高于紅天麻。

2.4.6 內(nèi) 轉(zhuǎn) 錄 區(qū) 間（Internal transcribed spacer，ITS）ITS標(biāo)記常用于研究藥用植物系統(tǒng)發(fā)育、種間和種內(nèi)、近緣屬的遺傳多樣性，具有快速、準(zhǔn)確、擴(kuò)增成功率高、標(biāo)準(zhǔn)化、便于高通量測序與分析、引物通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

謝淵等［64］利用ITS技術(shù)研究天麻的遺傳差異性，發(fā)現(xiàn)天麻地域分布與其遺傳變異特征相關(guān)，暗示ITS序列可為天麻野生資源道地性鑒別以及品種鑒定提供依據(jù)，在后來的研究［65，66］中證實(shí)了此觀點(diǎn)。王德信［65，66］利用ITS標(biāo)記鑒定黃、綠、烏3種變型天麻并分析其遺傳關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠天麻和黃天麻的遺傳距離約為25，構(gòu)成2個(gè)姊妹群，與烏天麻的遺傳距離約為50，且不同變型間的遺傳距離均達(dá)100%的置信度；在ITS1的209個(gè)堿基中僅發(fā)現(xiàn)15個(gè)變異位點(diǎn)，相同堿基數(shù)目為92.8%，表明這15個(gè)變異位點(diǎn)可用于鑒定不同變異類型天麻；在對(duì)不同變異類型天麻的親緣關(guān)系進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，烏天麻較為古老，綠天麻較為進(jìn)化，黃、綠天麻均由烏天麻進(jìn)化而來。唐科民［67］研究發(fā)現(xiàn)ITS標(biāo)記可用于鑒別不同居群天麻，ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，天麻ITS序列在變型內(nèi)和變型間僅有少部分個(gè)體變異較大，大部分個(gè)體變異較穩(wěn)定，變異大多發(fā)生在ITS1區(qū)；不同變型內(nèi)，烏天麻和黃天麻具有較穩(wěn)定的遺傳變異，方便開展天麻的良種選育，綠天麻的遺傳變異最大；貴州省大方天麻與昭通天麻的親緣關(guān)系較近，與陜西省漢中市天麻的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，同一產(chǎn)區(qū)不同變型間的ITS序列具有較高的同源性，不同產(chǎn)區(qū)相同變型的ITS序列差異相對(duì)明顯。

2.4.7 單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）SNP多態(tài)性主要是指生物基因組中因單個(gè)核苷酸的突變所導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性，是基因組中最常見的變異類型，能有效揭示種群的進(jìn)化進(jìn)程，是一種用于單體型推斷與統(tǒng)計(jì)分析、種群遺傳多樣性、自動(dòng)化篩選、物種鑒定的新型標(biāo)記方法。與其他標(biāo)記相比，該技術(shù)不僅能分析單個(gè)堿基的突變，而且具有結(jié)果準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化、客觀、位點(diǎn)豐富、便于高通量測序與分析、遺傳穩(wěn)定性較高、快速、擴(kuò)增成功率高、變異容易解釋、引物通用性強(qiáng)、容易與線粒體DNA區(qū)別等顯著優(yōu)點(diǎn)，因此可用于分析近緣種或者不同基因型品種之間的遺傳多樣性［68］，被稱為第三代遺傳標(biāo)志。

叢琨等［69］基于SLAF測序創(chuàng)始性地在天麻種質(zhì)資源中獲得SLAF標(biāo)簽并開發(fā)SNP標(biāo)記，共獲得高質(zhì)量的SLAF標(biāo)簽471 001個(gè)，reads數(shù)據(jù)75.95 M，其中19 675個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，并開發(fā)出群體SNP 60 238個(gè)，對(duì)SNP標(biāo)記進(jìn)行分析，結(jié)果顯示人工培育天麻的遺傳進(jìn)化體系與其他天麻資源差異較大；所有天麻資源的SNP標(biāo)記雜合率均高于20%，暗示天麻資源具有廣泛的雜合性。

3 展望

目前，國內(nèi)從細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、生化水平以及DNA分子水平上均涉及了對(duì)天麻遺傳多樣性的研究，揭示了天麻的遺傳多樣性較豐富，為今后天麻種質(zhì)資源的基因改良、遷地保護(hù)、育種選優(yōu)、開發(fā)及利用等方面的研究提供重要的理論依據(jù)，但在天麻的遺傳多樣性研究中仍存在一些不足。

3.1 綜合多種分子標(biāo)記手段分析天麻遺傳多樣性

中國天麻種質(zhì)資源豐富，通過表型性狀、細(xì)胞、生化以及分子標(biāo)記均能在一定程度上分析其遺傳多樣性，但各有千秋。形態(tài)學(xué)標(biāo)記作為傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記方法之一，在植物分類及遺傳多樣性研究中起著不可替代的作用，在天麻遺傳分析研究中主要涉及產(chǎn)量分析以及相關(guān)性研究、資源分類以及鑒定等方面。在細(xì)胞水平上，僅涉及與天麻的共生關(guān)系、減數(shù)分裂、染色體數(shù)目等，有關(guān)不同產(chǎn)地、不同天麻變型資源之間的差異未見報(bào)道。采用生化標(biāo)記方法進(jìn)行生物遺傳多樣性研究時(shí)，供試材料需要量少，能有效避免表型分析和細(xì)胞學(xué)研究受材料影響的不足，但其分辨率、準(zhǔn)確性低于分子標(biāo)記。分子標(biāo)記作為研究遺傳多樣性的一種新型方法，在天麻的遺傳多樣性分析中應(yīng)用廣泛，但使用最為頻繁的是AFLP、ISSR、RAPD、RFLP、SSR幾種方法，具有一定的局限性，且大部分僅采用1種分子標(biāo)記方法進(jìn)行研究，于研究結(jié)果而言，具有不穩(wěn)定性、片面性。王德信［43，66］曾利用多種DNA分子標(biāo)記方法研究綠、黃、烏3種變型天麻的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性變異位點(diǎn)數(shù)最少的為烏天麻，最多的為綠天麻；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示遺傳關(guān)系較近的是黃、綠天麻，這與形態(tài)學(xué)標(biāo)記得出的綠、烏天麻遺傳關(guān)系較近的結(jié)論有差異。

目前結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)和常規(guī)方法對(duì)天麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性方面的研究仍較為鮮見。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)能鑒別部分不同分型天麻，并能得到不同分型天麻的親緣關(guān)系和遺傳差異，遺傳變異豐富的生態(tài)型可作為遺傳改良的基礎(chǔ)。然而通過分子標(biāo)記方法仍無法檢測全部生態(tài)型，且費(fèi)用昂貴，因此，需聯(lián)合多種遺傳多樣性分析方法開展天麻輔助育種及遺傳多樣性研究。

3.2 建立天麻多樣性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

天麻具有重要的食用價(jià)值、藥用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究其遺傳多樣性不僅有利于分析天麻的遺傳關(guān)系，了解物種的瀕危情況，還有利于良種選育、資源保護(hù)和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。天麻的遺傳多樣性評(píng)價(jià)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，研究方法以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)各不相同，很難全面、精確地評(píng)價(jià)各資源的遺傳多樣性，若要將遺傳多樣性評(píng)估結(jié)論運(yùn)用到天麻資源保護(hù)及開發(fā)利用中，還需要建立多樣性評(píng)價(jià)體系。將來的研究中，遺傳標(biāo)記方法的綜合利用將在天麻的溯源體系建立、地理起源推斷、物種進(jìn)化及適應(yīng)性研究、新種發(fā)現(xiàn)與鑒定等方面發(fā)揮重要作用。同時(shí)，應(yīng)提倡保護(hù)性采集，提高仿野生種植技術(shù)，強(qiáng)化生物發(fā)酵物、蜜環(huán)菌等替代產(chǎn)品開發(fā)，從源頭上保護(hù)天麻野生資源的遺傳多樣性。