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    堆型艾美耳球蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的篩選及其發(fā)育研究

    2020-05-18 01:33:28王黎霞張建軍
    關(guān)鍵詞:小隱傳代原代

    王黎霞,黃 芳,張建軍,安 健

    (1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系;北京 102442;2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

    球蟲體外培養(yǎng)對(duì)于研究球蟲發(fā)育、球蟲病防治和球蟲與宿主的關(guān)系具有重大的意義和作用,首先能夠更清楚研究球蟲細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育狀況[1];其次可分離到較純凈的抗原,為疫苗的研制打下基礎(chǔ);第三選育弱毒株,為制作弱毒活疫苗提供條件;第四進(jìn)行新型抗球蟲藥或是抗球蟲藥物新劑型研究提供條件[2-3];第五能夠更直觀檢測(cè)球蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用[4]。更重要的是在科學(xué)研究中,體外培養(yǎng)可以減少動(dòng)物試驗(yàn),是動(dòng)物福利實(shí)現(xiàn)的重要途徑。

    球蟲體外培養(yǎng)中,不同細(xì)胞系對(duì)球蟲的生長和發(fā)育有很大影響。牛腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)是培養(yǎng)E.tenella的良好細(xì)胞系[5],但不適合布氏艾美耳球蟲的培養(yǎng)[6],小隱孢子蟲在其中也無法發(fā)育[7]。幼地鼠腎細(xì)胞(baby hamster kidney,BHK)被用于培養(yǎng)艾美耳屬球蟲,且認(rèn)為是優(yōu)于雞腎原代細(xì)胞和火雞腎原代細(xì)胞[8]。Tierney認(rèn)為BHK、MDBK、豬腎傳代細(xì)胞(porcine kidney,PK)-13較適宜培養(yǎng)E.tenella[9]。MDBK和肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞(hepatoblastoma,Hep)-2較適合培養(yǎng)剛地弓形蟲,非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(African green monkey kidney,VERO)、BHK、PK-13對(duì)于弓形蟲的體外培養(yǎng)不是很好[10]。人結(jié)腸癌細(xì)胞(human colon cancer cell,HCT)-8被認(rèn)為最適合體外培養(yǎng)小隱孢子蟲[11],有人比較小隱孢子蟲入侵狗腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)、小鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞(Mouse astrocytes,MA)-104、Hep-2和VERO,發(fā)現(xiàn)MDCK最易于感染,在MA-104細(xì)胞中小隱孢子蟲無法進(jìn)行有性生殖,VERO細(xì)胞入侵最少而且無法形成滋養(yǎng)體[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)兔軟骨細(xì)胞(Rabbit chondrocytes,VELI)體外培養(yǎng)小隱孢子蟲得到卵囊,再次感染小鼠時(shí)的毒力更強(qiáng),說明VELI細(xì)胞更適于體外培養(yǎng)小隱孢子蟲[13]。弓形蟲在宮頸癌細(xì)胞(Henrietta Lacks cervical cancer cell,Hela)中培養(yǎng)可以產(chǎn)生大量的速殖子[14],可見,細(xì)胞系對(duì)于體外培養(yǎng)寄生蟲的影響很大,不同的胞內(nèi)寄生蟲對(duì)不同的細(xì)胞系的入侵和發(fā)育差別很大,所以在體外培養(yǎng)寄生蟲時(shí)應(yīng)該廣泛選擇細(xì)胞系。

    E.acervulina體外培養(yǎng)過程中,有報(bào)道認(rèn)為早熟減毒株裂殖子在雞胚成纖維原代細(xì)胞(chicken embryo fibroblast,CEF)、雞腎原代細(xì)胞(chicken kidney,CK)中不能發(fā)育,而在雞胚小腸上皮原代細(xì)胞可以發(fā)育到卵囊階段[15]。有研究認(rèn)為E.acervulina入侵雞胚小腸上皮48 h形成第一代裂殖子,60 h可見大小配子體,72 h可以見到合子[16]。本試驗(yàn)比較MDBK、VERO、PK-15、CEF、CK 5種不同細(xì)胞在37 ℃和41 ℃下,子孢子的入侵和發(fā)育的情況,以期篩選出適宜E.acervulina體外培養(yǎng)的細(xì)胞。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    蟲株:E.acervulina孢子化卵囊,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)秦建華饋贈(zèng),北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室繁殖并保存。

    細(xì)胞系:MDBK,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛饋贈(zèng);VERO、PK-15,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民饋贈(zèng)。

    重要試劑: 改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)、新生牛血清為Gibico公司產(chǎn)品,青霉素、1∶250胰酶為Orien公司產(chǎn)品,硫酸鏈霉素為Topbio公司產(chǎn)品,蘇木精、伊紅為Amersco公司產(chǎn)品。

    1.2 方 法

    1.2.1 試驗(yàn)材料的純化和培養(yǎng)E.acervulina子孢子的純化參考黃芳[17],CEF培養(yǎng)參考陳淑亞[18]、CK培養(yǎng)參考姜逸[19]、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)參考曾華書[20]。

    1.2.2 不同細(xì)胞系、不同溫度下的E.acervulina子孢子入侵率的比較 用胰酶37 ℃,5%CO2消化3 min,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。將蓋玻片加入6孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液2 mL,在37 ℃、5%CO2和41 ℃、5%CO2分別培養(yǎng)2 h,顯微鏡下觀察細(xì)胞達(dá)到融合。將純化好的子孢子計(jì)數(shù),每孔接入105個(gè),再培養(yǎng)24 h,HE染色觀察,每個(gè)樣品觀察3個(gè)視野,算出平均數(shù),計(jì)算入侵率。入侵率=一個(gè)視野下被子孢子侵入細(xì)胞數(shù)/一個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.2.3 不同細(xì)胞系、不同溫度對(duì)入侵時(shí)間的影響 按1.2.2方法在37 ℃,5%CO2和41 ℃,5%CO2培養(yǎng),每隔0.5 h進(jìn)行HE染色,共觀察3 h,觀察入侵時(shí)間。

    1.2.4E.acervulina在MDBK中的發(fā)育 按1.2.2方法37 ℃,5%CO2培養(yǎng),每隔12 h更換1次無血清培養(yǎng)基,每隔2 h進(jìn)行高碘酸-shiff染色,觀察球蟲發(fā)育情況。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同細(xì)胞系、不同溫度對(duì)E. acervulina入侵時(shí)間的影響

    溫度明顯可以影響子孢子的入侵時(shí)間,子孢子在41 ℃比37 ℃能夠較快入侵細(xì)胞,37 ℃時(shí)子孢子入侵不同細(xì)胞系的時(shí)間一致,41 ℃時(shí)PK-15細(xì)胞入侵所需時(shí)間較長(表1)。

    表1 不同細(xì)胞、不同溫度下E. acervulina子孢子入侵時(shí)間Tab.1 The time of E. acervulina sporozoite invasion five cell at 37 ℃ and 41 ℃

    2.2 不同細(xì)胞系和溫度對(duì)E. acervulina入侵率的影響

    在37 ℃時(shí),MDBK和PK-15的入侵率顯著高于VERO、CEF、CK(P<0.05),MDBK的入侵率高于PK-15,但二者差異不顯著(P>0.05),VERO、CEF、CK的入侵率差異不顯著(P>0.05),見圖1。

    41 ℃時(shí),MDBK入侵率最高,但MDBK、PK-15、VERO、CEF的入侵率差異不顯著(P>0.05),CK的入侵率顯著低于其他4種細(xì)胞(P<0.05),見圖1。

    注:A、B、a、b字母不同表示差異顯著(P<0.05),字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。Note: Different letter is significant difference(P<0.05),same letter is not significant difference(P>0.05).圖1 不同溫度、不同細(xì)胞系E. acervulina入侵率Fig.1 The invasion rate at different temperature and different cell lines

    注:A,入侵前的子孢子(↑);B,共培養(yǎng)1 h附著于細(xì)胞表面的子孢子(↑);C,2 h后細(xì)胞入侵成功(↑);D,24 h后的子孢子長大,發(fā)育為滋養(yǎng)體(↑);E,52 h的第一代裂殖體(↑);F,56 h第一代裂殖體發(fā)育成熟(↑);G,H,60 h第一代裂殖子正在釋放出細(xì)胞(↑);I,72 h形成第二代裂殖體(↑)。Note: A, The sporozotie before invasion(↑); B, the sporozoite adhere to the cell after co-culture 1 h(↑); C, the sporozoite entered the cell after co-culture 2 h(↑); D, the trophozoite within parasitophorous vacuole after co-culture 24 h(↑); E, the developed schizont after co-culture 52 h(↑); F,the developed schizont after co-culture 56 h(↑); G, H, the merozoite released from cells after co-culture 60 h(↑); I, the second generation schizont formed after co-culture 72 h(↑).圖2 E. acervulina MDBK內(nèi)發(fā)育Fig.2 Development of E. acervulina in MDBK

    比較溫度對(duì)入侵率的影響,PK-15和MDBK 37 ℃的入侵率顯著高于41 ℃的入侵率, VERO、CEF、CK 41 ℃的入侵率顯著高于37 ℃的入侵率,但總體比較MDBK的入侵率無論是在41 ℃還是在37 ℃下培養(yǎng)入侵率都較高,見圖1。

    2.3 E. acervulina 在MDBK中發(fā)育情況

    染色后顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)1 h子孢子附著于細(xì)胞表面,2 h后子孢子入侵MDBK中,形成帶蟲空泡。24 h后子孢子轉(zhuǎn)化為早期第一代裂殖體,52 h開始形成第一代裂殖體,56 h形成成熟的第一代裂殖體,60 h第一代裂殖子釋放出細(xì)胞,72 h形成完整的第二代裂殖體,證明E.acervulina利用MDBK在37 ℃培養(yǎng)可以進(jìn)行胞內(nèi)繁殖,見圖2。

    3 討 論

    細(xì)胞對(duì)球蟲體外培養(yǎng)的影響很大,MDBK是來自牛的細(xì)胞系,適宜大部分艾美耳屬寄生蟲體外培養(yǎng),但不適合布氏艾美耳球蟲和肉孢子蟲的培養(yǎng)[6]。HCT-8和MDCK適宜小隱孢子蟲的培養(yǎng)[11],原代牛臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞適宜牛艾美耳球蟲和祖氏艾美耳球蟲的培養(yǎng)[21],因此,細(xì)胞對(duì)于體外培養(yǎng)寄生蟲的影響十分明顯,為了篩選出適宜E.acervulina體外培養(yǎng)的細(xì)胞,本試驗(yàn)選擇MDBK、PK-15、VERO、CEF和CK 5種細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)。

    41 ℃是雞的體溫,球蟲生活在雞的腸道,41 ℃比較適宜子孢子生長,對(duì)比41 ℃和37 ℃對(duì)入侵的影響。在三個(gè)傳代細(xì)胞系中,41 ℃都不利于細(xì)胞生長,溫度改變后細(xì)胞基本處于維持狀態(tài)無法進(jìn)行繁殖,不適宜體外培養(yǎng)E.acervulina,對(duì)于原代細(xì)胞41 ℃時(shí)只有入侵時(shí)間縮短,入侵率并沒有優(yōu)勢(shì)。原代細(xì)胞傳代中細(xì)胞發(fā)育不穩(wěn)定,一般認(rèn)為成纖維細(xì)胞可以傳代20次左右,但是在試驗(yàn)過程中無法保證每次傳代的生長效果完全一致,對(duì)于下一步的研究有一定的影響。

    Naciri-Bontemps用3日齡雞腎原代細(xì)胞體外培養(yǎng)E.acervulina時(shí),在EHT培養(yǎng)基培養(yǎng)44 h可見第一代裂殖體。感染54 h第一代裂殖子釋放出細(xì)胞。68 h,其入侵周圍的細(xì)胞并發(fā)育成第二代裂殖體。72~96 h,可以觀察到第三代和第四代裂殖子。第四代裂殖子可以發(fā)育成為配子體,當(dāng)把收集的配子體感染給雞45 h可以收獲卵囊[22]。E.acervulina子孢子和細(xì)胞共培養(yǎng)2 h才侵入細(xì)胞,在42 h第一代裂殖體發(fā)育完全,56 h才從細(xì)胞中釋放出來。72 h可見第二代裂殖子發(fā)育成熟。這可能與培養(yǎng)基中血清含量有關(guān)。有研究證明當(dāng)培養(yǎng)基成分為90% HBSS、5%乳清蛋白水解物和5%胎牛血清比用95% M199和5%胎牛血清,E.tenella入侵更多[23]。有研究曾比較雞血清,小牛血清,兔血清和豬血清對(duì)雞原代細(xì)胞的生長、子孢子入侵能力以及對(duì)E.tenella的第一代和第二代裂殖體的作用效果的影響,發(fā)現(xiàn),雞血清組子孢子入侵能力最強(qiáng),胎牛血清組第二代裂殖體比雞血清多,但雞血清組的卵囊比胎牛血清多[9]。有研究證明,在無血清培養(yǎng)基中,人隱孢子蟲和小隱孢子蟲可以發(fā)育,并能完成生活史[11]。

    MDBK培養(yǎng)E.acervulina可以形成第二代裂殖體,而VERO、PK-15只能發(fā)育到第一代裂殖體階段,CEF和CK中E.acervulina有第一代裂殖子的釋放,但未再次入侵,并且CEF和CK不易傳代,5種細(xì)胞中,MDBK最適宜E.acervulina培養(yǎng);與MDBK共培養(yǎng)1 h子孢子附著于細(xì)胞表面,2 h子孢子入侵,子孢子入侵24 h形成第一代滋養(yǎng)體,52~56 h形成第一代成熟裂殖體,60 h第一代裂殖子釋放出細(xì)胞,72 h形成第二代裂殖體,在VERO、MDBK、PK-15、CEF及CK這5種細(xì)胞中,MDBK是培養(yǎng)E.acervulina的最適宜細(xì)胞。

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