間充質(zhì)干細胞來源的外泌體治療糖尿病足潰瘍的機制研究進展

盧潔，許紅梅

濱州醫(yī)學院護理學院，山東濱州 256600

糖尿病足潰瘍（DFU）具有治療費用高和周期長的特點，是糖尿病患者截肢和死亡的主要原因［1］。局部潰瘍組織缺氧能顯著抑制低氧誘導因子（HIF）1α的活性，導致新生血管生成受阻［2］。同時，創(chuàng)面缺氧狀態(tài)下內(nèi)皮祖細胞（EPCs）募集、增殖和生長因子釋放功能也受損，從而加重局部慢性炎癥，抑制新血管形成［3］。目前DFU的治療措施如清創(chuàng)換藥［4］、傷口外用敷料［5］、高壓氧治療［6］及負壓吸引治療［7］等療效并不理想。間充質(zhì)干細胞（MSCs）是一種多功能干細胞，具有自我更新和多向分化能力［8］，能通過旁分泌功能促進傷口愈合［9］。外泌體，特別是MSCs來源外泌體（MSCs-Exos），在促進傷口愈合方面顯示出巨大潛力［10］。因外泌體具有良好的穩(wěn)定性和低免疫原性，MSCs-Exos已經(jīng)逐步應用于惡性腫瘤、心血管及呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌代謝疾病、骨關節(jié)炎、子宮內(nèi)膜損傷等的治療，可能比直接使用MSCs治療更安全［11］。一般情況下，皮膚傷口的愈合過程主要包括止血、炎癥、增殖和重塑階段［12］。外泌體在不同的傷口愈合階段所發(fā)揮的功能是不同的［13］?，F(xiàn)就MSCs-Exos治療DFU的機制研究進展綜述如下。

1 促進凝血

研究表明，外泌體參與止血過程調(diào)控，其主要通過激活血小板發(fā)揮促凝功能［13］。在血管損傷時，組織因子與凝血因子Ⅶa形成復合體，后者能夠激活凝血因子Ⅹ，進一步將凝血酶原轉化為凝血酶，發(fā)揮促凝功能［14］。組織缺氧條件下產(chǎn)生的外泌體通過進一步上調(diào)組織因子活性、促進凝血酶轉化及纖維蛋白生成，從而提高其促凝功能［15］。在大鼠模型中，EPCs來源外泌體（EPCs-Exos）可高度富集miR-21-5p并特異性抑制受體內(nèi)皮細胞中的血管生成抑制劑血小板反應蛋白表達，從而促進內(nèi)皮細胞的修復［16］。循環(huán)外泌體中表達的豐富miRNA可能參與了炎癥反應和凝血級聯(lián)反應，這表明外泌體miRNA可能參與損傷器官修復［17］。還有研究證實，人類臍帶來源的MSCs-Exos在體外可誘導凝血［18］。

2 抑制炎癥反應

巨噬細胞在創(chuàng)面愈合過程中同時扮演促炎和抗炎的角色。創(chuàng)面組織中高血糖和氧化應激狀態(tài)均可引起巨噬細胞發(fā)生M1極化，M1型巨噬細胞通過分泌促炎因子在炎癥反應的早期階段發(fā)揮重要作用。巨噬細胞M1極化被認為是傷口愈合延遲的主要因素［19］。外泌體miRNA可維持創(chuàng)面組織穩(wěn)態(tài)，通過調(diào)節(jié)免疫細胞分化和發(fā)育，降低炎癥信號通路的活性，減少炎癥介質(zhì)分泌，加快創(chuàng)面愈合［20］。研究表明，外泌體在損傷部位通過調(diào)控免疫細胞活性來發(fā)揮抗炎功能，它可誘導巨噬細胞向抗炎作用強的M2型轉化；同時，外泌體可抑制B細胞的成熟和T細胞的增殖，激活調(diào)節(jié)型T細胞，降低炎癥因子水平，促進傷口愈合［21］。進一步研究顯示，外泌體通過調(diào)節(jié)巨噬細胞中的Nrf2/HO-1信號軸使巨噬細胞發(fā)生極化［22］。Nrf2有助于維持細胞中的氧化還原穩(wěn)態(tài)［23］。研究顯示，2型糖尿病并發(fā)DFU患者創(chuàng)面組織中Nrf2表達顯著下調(diào)；大鼠糖尿病模型實驗表明，Nrf2過表達能夠增強脂肪干細胞來源外泌體抵抗葡萄糖誘導EPCs衰老的作用，其機制可能與抑制氧化反應和炎癥因子表達有關［24］。還有學者發(fā)現(xiàn)，生長抑制特異性基因5在糖尿病局部組織炎癥微環(huán)境的外泌體中過表達，并能促進創(chuàng)面愈合［25］。

3 促進細胞增殖和血管生成

外泌體所包含的RNA（包括mRNA、miRNA、tRNA）被認為是調(diào)節(jié)受體細胞活動的主要物質(zhì)［26］。MSCs-Exos中的RNA或蛋白能夠發(fā)揮細胞歸巢作用，并調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化，可以限制損傷、調(diào)節(jié)免疫反應并促進細胞損傷后的自我修復和組織再生［27］。如富含長鏈非編碼RNA（lncRNA）H19的MSCs-Exos可以促進抑癌基因同源性磷酸酶—張力蛋白表達，并顯著提高成纖維細胞的增殖和遷移能力，加速創(chuàng)面愈合［28］。lncRNA H19還可通過抑制p53的活性和生長分化因子的釋放，促進皮膚成纖維細胞增殖和受損皮膚中巨噬細胞浸潤，促進創(chuàng)面愈合。此外，外泌體釋放的miRNA（如miR-132和miR-146a）可顯著上調(diào)促血管生成因子表達，提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖率和血管形成率［29］。ZHU等［30］研究證實，Wnt/β-catenin信號通路與糖尿病慢性潰瘍病灶中血管內(nèi)皮細胞的增殖狀態(tài)密切相關，糖尿病慢性不愈合創(chuàng)面中該通路活性下調(diào)。有學者發(fā)現(xiàn)，DFU病灶中胎盤生長因子（PLGF）表達顯著下降［31］，而補充外源性PLGF后小鼠血管生成和組織修復顯著改善。同時，PLGF還可增加巨噬細胞數(shù)量，使其發(fā)生M2極化，促進DFU的血管生成及組織修復。研究表明，含有基質(zhì)金屬蛋白酶的外泌體通過促進細胞遷移和血管內(nèi)皮生長因子受體1的裂解，促進內(nèi)皮細胞增殖，從而加快創(chuàng)面新生血管的生成［32］。有研究表明，EPCs在血管內(nèi)皮細胞損傷和修復過程中主要借助兩種方式來發(fā)揮作用：一是直接分化為成熟內(nèi)皮細胞進行修復；二是通過旁分泌方式表達多種細胞因子，提高內(nèi)皮細胞的增殖和遷移活性，并提高血管內(nèi)皮細胞在損傷狀態(tài)下的存活率。李羅成等［34］以EPCs-Exos干預經(jīng)缺氧處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)缺氧內(nèi)皮細胞的增殖、遷移能力有一定程度的恢復，證實EPCs-Exos可改善缺氧內(nèi)皮細胞的增殖、遷移能力，減少內(nèi)皮細胞凋亡，減輕血管內(nèi)皮細胞的缺氧性損傷。

4 增加膠原沉積并減少瘢痕形成

細胞外基質(zhì)異常堆積是瘢痕形成最重要的因素之一。人脂肪干細胞來源外泌體（ADSCs-Exos）可促進成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、纖維連接蛋白、平滑肌肌動蛋白基因表達并有效抑制瘢痕中細胞外基質(zhì)產(chǎn)生［34］。ADSCs-Exos可通過其衍生的外源性miR-29a抑制TGF-β2/Smad3信號通路，從而減少瘢痕形成［35］。臍血來源間充質(zhì)干細胞外泌體也可通過miR-21-5p和mirR-125b-5p介導TGF-β受體通路，抑制創(chuàng)面愈合過程中瘢痕的形成［36］。之前研究也表明，ADSCs-Exos中富含miR-21、miR-23a、miR-125b及miR-145等，能夠在促進創(chuàng)面愈合的同時減少瘢痕形成。

MSCs-Exos因其來源廣泛、易獲取等優(yōu)點，逐漸引起研究人員的興趣，顯示出十分廣闊的應用前景。多項研究已證實，外泌體可以與其他藥物、生物材料、納米技術等聯(lián)合應用，并借助轉運、調(diào)控或緩釋藥物等多種方式提高藥物的治療效果。SUN等［37］研究證實，外泌體能夠聯(lián)合多功能集成納米試劑，通過減輕組織創(chuàng)面氧化損傷和炎癥反應、促進血管生成、抑制細菌感染，促進糖尿病感染傷口的愈合。LIU等［38］將脂肪源性MSCs-Exos加載到甲殼素納米纖維（β-ChNF）水凝膠中，β-ChNF水凝膠能夠增強外泌體中蛋白質(zhì)和miRNA的穩(wěn)定性，延長外泌體在體內(nèi)的停留時間，建立免疫隔離屏障，保護外泌體不被宿主免疫系統(tǒng)清除；與單獨使用β-ChNF水凝膠相比，負載ADSCs-Exos的β-ChNF水凝膠更有助于促進大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。有學者提取吡格列酮預處理的MSCs-Exos，發(fā)現(xiàn)其通過激活PI3K/AKT/eNOS通路促進高糖損傷環(huán)境中HUVECs的血管生成能力，從而加速DFU傷口愈合［11］。更重要的是，MSCs-Exos在治療重癥新型冠狀病毒肺炎患者也成效顯著，患者康復率接近80%［39］。然而，外泌體的臨床轉化中尚有些問題待解決：其一，不同研究采用的MSC外泌體純化、分離等技術差異可能導致研究結果不一致［40］；其二，不同組織來源的外泌體是否具有相同的生物學功效尚未證實；其三，雖然MSCs-Exos在DFU模型中表現(xiàn)出潛在的治療價值，但多數(shù)相關研究為基礎實驗，僅有少數(shù)臨床試驗報道了MSCs-Exos的治療效果［41］；其四，按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范/藥物臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》指南要求，外泌體尚不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)并應用于臨床治療［42］。另外，外泌體中的許多蛋白質(zhì)、RNA、脂質(zhì)和代謝酶的功能和作用機制尚不明確，值得進一步研究。未來還應建立統(tǒng)一規(guī)范的純化分離技術指導規(guī)范，獲得臨床應用許可，設計大樣本、多中心的臨床研究驗證外泌體在DFU治療中的安全性和有效性。