超聲場強化脂肪酶催化反應(yīng)的研究進(jìn)展

夏韓碩，閔偉紅，張小涵，周明春，滕超，李秀婷

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（長春 130118）；2. 北京工商大學(xué)食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心（北京 100048）

脂肪酶是生物催化最常用的酶制劑之一，廣泛存在動植物的各個組織及多種微生物。脂肪酶能催化甘油三酯水解成甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸；而在無水條件下發(fā)生逆向合成反應(yīng)，酶能在酯化、醇解和酯交換反應(yīng)下合成新的分子。用酶代替化學(xué)催化劑，使生物化工制品的加工和制備過程中更加綠色，同時還可以減少酶促反應(yīng)過程中的副反應(yīng)。脂肪酶因其獨特的催化活性而被廣泛地應(yīng)用到食品、皮革、生物能源、飼料添加等工業(yè)生產(chǎn)中[1]，在理論研究和實際應(yīng)用方面都具有著重要意義。

酶促反應(yīng)的主要障礙是反應(yīng)過程中的內(nèi)部傳質(zhì)，這可能降低反應(yīng)速率。有研究顯示超聲波的引入，可能誘使常態(tài)下不能發(fā)生的反應(yīng)發(fā)生，或顯著提高某些反應(yīng)的催化速率[2]，可以在一定程度上促進(jìn)反應(yīng)，克服體系中的傳質(zhì)限制。超聲耦合酶促反應(yīng)是近些年興起的技術(shù)，基于脂肪酶的催化特性及超聲的作用特點可以極大的解決催化過程的生產(chǎn)瓶頸，實現(xiàn)制備效率的提升及轉(zhuǎn)化產(chǎn)品進(jìn)程的優(yōu)化。

該文總結(jié)并討論脂肪酶的來源、結(jié)構(gòu)、催化機制，超聲波作用機理以及超聲-脂肪酶耦合催化酶促反應(yīng)。

1 脂肪酶

1.1 脂肪酶的來源

脂肪酶來源廣泛，大多存在于動物、植物和微生物中。動物胰臟和脂肪組織中含有較多的脂肪酶，各類脂肪酶都具有非常重要的作用，比如控制消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；植物油料種子中含有較多的脂肪酶，當(dāng)種子發(fā)芽時，脂肪酶能協(xié)同其他酶發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所需的養(yǎng)料和能量；微生物脂肪酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、酵母中[3]。

由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用pH、溫度范圍及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶[4-5]，適合于工業(yè)化生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶通常會作為工業(yè)用脂肪酶的重要來源（見表1）。

表1 部分微生物脂肪酶及酶學(xué)性質(zhì)

1.2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)

脂肪酶的催化活性中心是由Ser-His-Asp/Glu組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。活性中心氨基酸殘基通過一個縫隙與酶分子表面相通，在酶分子表面有一個α-螺旋形成的“蓋子”覆蓋在活性中心上方[18]?！吧w子”的外表面相對親水，而內(nèi)表面則相對疏水，該結(jié)構(gòu)不僅影響酶活性，而且影響酶對底物的特異性和穩(wěn)定性。脂肪酶蛋白分子的3D結(jié)構(gòu)（見圖1）得到初步闡明。

圖1 脂肪酶3D結(jié)構(gòu)[19]

當(dāng)脂肪酶在油-水界面暴露時，“蓋子”結(jié)構(gòu)被打開，由封閉形式變?yōu)殚_放形式，活性中心被暴露出來。這時，底物更容易進(jìn)入疏水通道與脂肪酶的活性部位結(jié)合，形成酶-底物復(fù)合物[20]，促使酶促反應(yīng)進(jìn)行。

2 脂肪酶酶促反應(yīng)

脂肪酶酶促反應(yīng)具有溫和的反應(yīng)條件、低能耗的要求、最少的廢物處理、可持續(xù)的EFA因子、產(chǎn)物的選擇性等優(yōu)點[21]，在工業(yè)中應(yīng)用廣泛。

阿司匹林甲酯水解物2-羥基苯甲酸甲酯，可作為食品，化妝品，盥洗用品中的香料，還可以用作止痛劑；Chiplunkar等[22]利用南極假絲酵母脂肪酶B水解阿司匹林甲酯，水解率接近60%。植物甾醇可有效降低人體血清中的膽固醇含量，但游離型植物甾醇的溶解性較差，常通過將其與脂肪酸酯化的方法加以改善；湯桂云等[23]利用CRL催化合成大豆甾醇共軛亞油酸酯，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.94%。酚酸在化妝品、醫(yī)藥和食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，但是酚酸在疏水介質(zhì)中溶劑度低，通過酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)酯化成兩親性分子可以顯著提高酚酸在非水介質(zhì)中的溶解度；Gholivand等[24]利用CALB合成二氫咖啡酸酯，轉(zhuǎn)化率可接近100%。丙酸異丁酯在食品和調(diào)味品行業(yè)中具有廣泛應(yīng)用，Jaiswal等[25]利用CALB合成該酯，在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化率可達(dá)93%。

雖然脂肪酶在工業(yè)中應(yīng)用廣泛，但仍然存在成本高，產(chǎn)量低等。為解決這一問題，許多學(xué)者引入了超聲技術(shù)。

3 超聲-脂肪酶耦合催化

3.1 超聲波干預(yù)的一般機制

超聲波，一般指頻率為20～106kHz的聲波，具有傳播頻率高、方向性強、介質(zhì)振動強度大等特點。介質(zhì)在超聲波的作用下會形成交替的壓縮區(qū)和膨脹區(qū)。在這些區(qū)域中，介質(zhì)壓力的改變會產(chǎn)生微小泡，經(jīng)震蕩、生長、壓縮、崩潰等一系列動力學(xué)過程聚集超聲場能量，再瞬間釋放可在狹小的空間內(nèi)產(chǎn)生瞬間局部高溫和高壓。同時，聲波與介質(zhì)相互作用，可使超聲波的相位和振幅等發(fā)生變化，導(dǎo)致介質(zhì)的狀態(tài)、組成、結(jié)構(gòu)、功能等發(fā)生變化，這就是超聲波空化效應(yīng)[26-27]。

超聲波在產(chǎn)生空化效應(yīng)的同時，由于局部的高溫、高壓也會出現(xiàn)熱效應(yīng)和機械效應(yīng)。通過試驗測定[28]，超聲時爆裂的小泡核內(nèi)溫度達(dá)5 200 K，壓力達(dá)5.05×107Pa，小泡周圍極小的空間范圍內(nèi)的溫度也可達(dá)1 900 K。機械效應(yīng)是超聲波在介質(zhì)中傳播時，可使介質(zhì)質(zhì)點進(jìn)入振動狀態(tài)，加速質(zhì)量傳遞，從而促進(jìn)生物傳質(zhì)作用。

3.2 超聲-脂肪酶耦合進(jìn)行酶促反應(yīng)

酶促反應(yīng)的主要障礙是過程中的內(nèi)部傳質(zhì)。近年來，在化學(xué)合成中有些研究者引入超聲波系統(tǒng)以促進(jìn)反應(yīng)，克服體系中的傳質(zhì)限制[29]。

3.2.1 超聲-脂肪酶耦合催化酯水解反應(yīng)

Chiplunkar等[22]采用固定化南極假絲酵母脂肪酶B在三油酸、三氯甲烷和二氯甲烷三種溶劑中對乙酰水楊酸甲酯進(jìn)行間歇式超聲輔助水解，在超聲輔助的條件下可獲得65.3%的轉(zhuǎn)化率，比非超聲條件下提高6.4%。Soares等[30]對超聲波促進(jìn)脂肪酶催化山羊奶油水解進(jìn)行研究，利用米曲霉Resinase ? HT進(jìn)行催化，能使轉(zhuǎn)化率提高20%以上，且發(fā)現(xiàn)使用超聲波輔助山羊奶油水解可增加水解速率，在55，40和25 ℃條件下分別增加12%，23%和28%。Liu等[31]研究超聲波在無溶劑體系中對大豆油水解的影響，觀察到1，2，3，4和5 h的反應(yīng)產(chǎn)率分別比在恒溫槽中機械攪拌的產(chǎn)率提高94%，64%，58%，41%和34%。

綜上所述，在傳統(tǒng)脂肪酶水解反應(yīng)中引入超聲技術(shù)不僅可以增加轉(zhuǎn)化率，還能極大地縮短反應(yīng)時間。

3.2.2 超聲-脂肪酶耦合催化酯交換反應(yīng)

Yu等[32]用南極假絲酵母脂肪酶B催化大豆油和甲醇反應(yīng)，制備生物柴油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲作用下，產(chǎn)率在12 h內(nèi)就可達(dá)93%，而在最佳振動條件下產(chǎn)率僅62%。Gharat等[33]研究超聲波輔助Novozym ?435脂肪酶催化廢食用油與碳酸二甲酯的酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)超聲與攪拌同時輔助催化反應(yīng)進(jìn)行時，最終轉(zhuǎn)化率分別比單獨攪拌輔助和單獨超聲輔助提高48%和29%。Batistella等[34]利用Novozym ?435和RM IM脂肪酶催化大豆油與乙醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)。通過試驗發(fā)現(xiàn)RM IM與Novozym ?435酶在單獨超聲條件下產(chǎn)率分別是55%和37%，產(chǎn)率不是很高，但還是優(yōu)于無超聲輻照條件下的產(chǎn)率。

綜上所述，在脂肪酶催化酯交換反應(yīng)中引入超聲技術(shù)雖然可以增加轉(zhuǎn)化率，縮短反應(yīng)時間，但是單使用超聲輻照并沒有達(dá)到理想的結(jié)果，將超聲技術(shù)與攪拌技術(shù)相結(jié)合可以得到更好結(jié)果。

3.2.3 超聲-脂肪酶耦合催化酯合成反應(yīng)

Ajmal等[35]研究超聲空化對脂肪酶催化油酸與正己醇、油酸與正癸醇酯化反應(yīng)的影響，試驗表明，200 min內(nèi)超聲空化顯著提高轉(zhuǎn)化率達(dá)70%以上，而非超聲的轉(zhuǎn)化率僅10%左右。Gawas等[36]在研究超聲波和乙醇分段添加聯(lián)合作用促進(jìn)Novozym ?435脂肪酶催化合成月桂酸乙酯時，發(fā)現(xiàn)超聲和常規(guī)攪拌同時存在的情況下，月桂酸乙酯的轉(zhuǎn)化率可達(dá)96.87%，分別比只有常規(guī)攪拌和單獨超聲輔助的轉(zhuǎn)化率高約54%和20%。

Paludo等[37]研究超聲波和分子篩的聯(lián)合作用下，利用固定化羊毛熱霉菌脂肪酶TL IM催化合成丁酸乙酯，總收率可達(dá)80%以上，高于非超聲體系61%的轉(zhuǎn)化率。孟冠男等[38]利用Novozym ?435脂肪酶在無溶劑體系中催化雜醇油（異戊醇、異丁醇、正丙醇）與乙酸合成三種酯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲輔助反應(yīng)6 h產(chǎn)率比搖床反應(yīng)6 h提高了15%。

脂肪酶催化酯合成的反應(yīng)中引入超聲技術(shù)可以與其他輔助處理方式相結(jié)合，比如超聲與機械攪拌相結(jié)合、超聲與分子篩連用、使用固定化酶、在無溶劑體系中進(jìn)行反應(yīng)等。這些均可以進(jìn)一步提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。

3.3 超聲對酶的影響

Soares等[30]探討超聲波對山羊奶油水解過程中脂肪酶性能的影響時，分別對水解底物山羊奶油和米曲霉Resinase ? HT進(jìn)行超聲波預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理沒有誘導(dǎo)山羊奶油水解，但顯著提高了脂肪酶的活性。Shah等[39]研究超聲波預(yù)處理對脂肪酶在水和非水介質(zhì)中催化活性的影響時發(fā)現(xiàn)，超聲預(yù)輻照不影響酶的二級結(jié)構(gòu)，但會導(dǎo)致酪氨酸和色氨酸環(huán)境的擾動，增強了負(fù)帶強度，三級結(jié)構(gòu)輕微擾動。

由此可見，超聲波對催化反應(yīng)的影響，很大一部分原因是基于對酶的改變，超聲波會導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的改變，使酶變得更容易與底物結(jié)合，提高效率。

4 結(jié)語

超聲波作為一個新興的研究領(lǐng)域，在適當(dāng)條件下使用能顯著提高酶促反應(yīng)的產(chǎn)率及反應(yīng)速率，但是在實際應(yīng)用中仍存在挑戰(zhàn)。為實現(xiàn)超聲酶促技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，超聲改性和超聲輔助反應(yīng)的過程必須是可控的。關(guān)鍵問題包括確定特定酶過程中超聲波的有效范圍，找出普遍規(guī)律，以及找出這些過程的作用機理。