發(fā)芽法富集蒜米γ-氨基丁酸的關(guān)鍵技術(shù)

高紅俠，白青云*，趙立，盧河?xùn)|，王雨

淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院（淮安 223003）

大蒜（Allium sativumL）又名胡蒜，屬百合科蔥屬植物。大蒜鱗莖除含有碳水化合物、蛋白質(zhì)等基本營養(yǎng)素外，還富含維生素、含硫化合物，以及鍺和硒等多種微量元素[1]。藥理學(xué)研究表明，大蒜提取物具有廣譜抗菌作用，能阻斷人體內(nèi)亞硝胺合成等作用，對直腸癌、食道癌等有預(yù)防作用，同時還能提高免疫力、抗血栓、保護(hù)肝臟等功能[2]。

大蒜食用時存在去皮困難、費時等問題，因此大蒜去皮后的蒜米受到消費者青睞。蒜米是具有新陳代謝能力的活體，對蒜米進(jìn)行發(fā)芽處理能富集γ-氨基丁酸（GABA）。GABA是生物體內(nèi)廣泛存在的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶（GAD）轉(zhuǎn)化而來[3]。GABA是哺乳動物腦和脊髓中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、抗癌、抗腫瘤、改善腦功能等功效[4]。最新研究表明，體內(nèi)GABA水平與帕金森患者的記憶力呈正相關(guān)[5]。我國已批準(zhǔn)GABA為新食品原料[6]，動植物性食物原料中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，很難從天然食物中大量攝取。因此，食物中富集GABA成為功能食品研究熱點之一。

試驗選用種植面積廣、功能豐富的蒜米作為原料，采用發(fā)芽法，研究蒜米富集GABA的關(guān)鍵技術(shù)，為開發(fā)功能性大蒜產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜，市售；GABA標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma化學(xué)品公司；谷氨酸鈉（MSG）、維生素B6（VB6）、氯化鈣（CaCl2）、乙醇、乙酸、四硼酸鈉、苯酚、次氯酸鈉等，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

722N可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；TDL-40B型離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；PHSJ-3F臺式酸度計（上海雷磁酸度計）；HHS-2S恒溫水浴鍋（上海虞龍儀器設(shè)備有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BCD-185HFA型冰箱（澳柯瑪股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理方法

挑選一定量完好的新鮮大蒜，剝?nèi)ネ馄ぃ礊樗饷?，?%次氯酸鈉溶液消毒30 min，取出用清水沖洗后吸去明水，擺放在墊有紗布的白瓷盤中，用去離子水或不同pH的緩沖液（檸檬酸-磷酸氫二鈉）浸漬淹沒蒜米，置于黑暗環(huán)境在一定溫度下培養(yǎng)一定時間。屆時將蒜米取出用吸水紙吸干表面液體，測定其GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（鮮重）。

1.2.2 蒜米富集GABA的培養(yǎng)工藝試驗

首先對蒜米富集GABA的培養(yǎng)工藝進(jìn)行單因素試驗，設(shè)定培養(yǎng)溫度20～35 ℃、培養(yǎng)時間0～60 h、緩沖液pH 4.6～6.2，測定蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，對培養(yǎng)工藝的三因素進(jìn)行優(yōu)化，選出蒜米富集GABA的最佳培養(yǎng)工藝。

1.2.3 蒜米富集GABA的培養(yǎng)液中外源添加物試驗

為進(jìn)一步提高蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在最佳培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)液中添加促進(jìn)GAD活性的物質(zhì)或GABA合成的底物。谷氨酸鈉（MSG）質(zhì)量濃度設(shè)為 6～18 mg/mL；維生素B6（VB6）質(zhì)量濃度設(shè)為0.01～0.04 mg/mL；CaCl2濃度設(shè)為1.0～4.0 mmol/L。所有溶液都由10 mmol/L的檸檬酸緩沖液配制而成，調(diào)節(jié)初始pH至5.8。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對外源添加物組分進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的培養(yǎng)液中外源添加物濃度。

1.3 GABA測定方法

將蒜米樣品進(jìn)行充分磨碎，精確稱取1 g，參照白青云等[7]的方法，采用比色法測定樣品中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗進(jìn)行3次重復(fù)，避免出現(xiàn)偶然因素影響試驗結(jié)果。采用Design Expert 8.0設(shè)計軟件處理試驗數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)工藝對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.1 培養(yǎng)溫度對蒜米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖1可見：蒜米在溫度20～35 ℃范圍內(nèi)用去離子水培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)溫度對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響，呈先上升后下降的趨勢。25 ℃時蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.320 mg/g，分別比20 ℃時和35 ℃時提高43.50%和51.66%，說明在一定溫度范圍內(nèi)，適宜的培養(yǎng)溫度促進(jìn)蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，最適溫度為25 ℃。其原因是在一定溫度范圍內(nèi)，適宜的培養(yǎng)溫度可以增強(qiáng)GAD的活性，進(jìn)而促進(jìn)蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。調(diào)節(jié)發(fā)芽溫度可以使糙米有效地富集GABA[8]，此次研究結(jié)果與其一致。

圖1 培養(yǎng)溫度對蒜米富集GABA的影響

2.1.2 培養(yǎng)時間對蒜米發(fā)芽富集GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

從圖2可以看出：蒜米在25 ℃去離子水培養(yǎng)0～60 h范圍內(nèi)，蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先緩慢增加后急速降低的趨勢。培養(yǎng)48 h時GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.347 mg/g，是原料（0.143 mg/g）的2.43倍。因此，48 h是蒜米富集GABA的適宜時間。培養(yǎng)時間過短，GAD沒有得到充分的激活；培養(yǎng)時間過長，GABA則會因谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化形成琥珀酸半醛[9]。

圖2 培養(yǎng)時間對蒜米富集GABA影響

2.1.3 培養(yǎng)液pH對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

蒜米在溫度20 ℃培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)液pH對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖3。pH在4.6～5.8之間，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨pH的升高而緩慢升高；pH在5.8～6.2之間時則相反。蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在pH 5.8時最高，為0.373 mg/g，比原料提高了160.84%。由此可知，培養(yǎng)液pH 5.8對蒜米富集GABA的效果最佳。蔣振暉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，低酸性環(huán)境有利于激活GAD。此次研究也得出相似結(jié)論。

圖3 不同pH對蒜米富集GABA的影響

2.1.4 正交試驗法優(yōu)化蒜米富集GABA的培養(yǎng)工藝

正交試驗優(yōu)化的蒜米富集GABA的試驗設(shè)計和結(jié)果見表1。結(jié)果表明，蒜米富集GABA的最佳培養(yǎng)工藝為A1B1C2，即培養(yǎng)溫度為20 ℃、培養(yǎng)時間為36 h、培養(yǎng)液pH為5.8。由極差分析可知，培養(yǎng)液pH是最主要的影響因素，培養(yǎng)溫度次之，最后是培養(yǎng)時間。在最佳培養(yǎng)工藝下，蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.439 mg/g，是原料的3.07倍。

表1 蒜米富集GABA的培養(yǎng)工藝正交試驗結(jié)果

2.2 培養(yǎng)液中外源添加物對蒜米富集GABA的影響

2.2.1 MSG濃度對蒜米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖4可知：MSG在6～18 mg/mL濃度范圍內(nèi)，蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著培養(yǎng)液中MSG濃度的增加呈先上升后下降趨勢。當(dāng)MSG濃度為10 mg/mL時，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.705 mg/g，是最優(yōu)培養(yǎng)工藝下（0.439 mg/g）的1.61倍。MSG作為植物GAD的專一底物，可以促進(jìn)GABA的合成[11]。南瓜籽培養(yǎng)液中添加MSG可以提高GABA的富集量[12]，此次研究結(jié)果與其一致。

圖4 MSG濃度對蒜米富集GABA的影響

2.2.2 CaCl2濃度對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

培養(yǎng)液中添加CaCl2對蒜米中GABA富集的影響見圖5。

圖5 CaCl2濃度對蒜米富集GABA的影響

CaCl2在1～4 mmol/L濃度范圍內(nèi)，蒜米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。當(dāng)CaCl2濃度為3 mmol/L時，GABA富集量最高，為0.696 mg/g，比最優(yōu)培養(yǎng)工藝下提高58.54%。GAD末端有一個鈣調(diào)素結(jié)合域，并且GAD活性由鈣離子（Ca2+）或CaM調(diào)節(jié)[13]，因此增加胞質(zhì)Ca2+濃度可以刺激GAD活性，進(jìn)而促進(jìn)GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。

2.2.3 VB6對蒜米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響圖6顯示：添加VB6能有效促進(jìn)蒜米富集GABA。VB6在0.02 mg/mL時，蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.679 mg/g，比最優(yōu)培養(yǎng)工藝下提高54.67%。研究表明，VB6是GAD的輔基磷酸吡哆醛（PLP）的前體物質(zhì)，有激活GAD達(dá)到富集GABA的作用[14]。

圖6 VB6濃度對蒜米富集GABA影響

2.2.4 蒜米富集GABA的外源添加物組分優(yōu)化

Box-Behnken試驗設(shè)計的優(yōu)化蒜米富集GABA的培養(yǎng)液中外源添加物組分方案和結(jié)果見表2。

表2 蒜米富集GABA的培養(yǎng)液中添加物濃度試驗方案和結(jié)果

運用Design Expert軟件，對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得到蒜米富集GABA預(yù)測值的二次多項逐步回歸方程：

Y=-0.431 54+0.111 513X1+0.418 95X2+7.255 00X3+1.312 50E-003X1X2+0.337 50X1X3+0.900 00X2X3-6.489 06E-003X12-0.0743 25X22-305.750 00X32

運用方差分析上述回歸模型，模型的F=110.92，p＜0.000 1，因此該回歸模型是非常有效的，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.993 0，說明模型具有良好的相關(guān)性，可用于指導(dǎo)實踐。

由表3可見：MSG的一次項和二次項對蒜米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)有極顯著影響，CaCl2的二次項對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)有極顯著影響（p＜0.01），VB6的一次項和二次項對蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響（p＜0.05）。MSG和VB6兩者的交互作用對蒜米富集GABA的影響顯著（p＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析

在試驗設(shè)定的因素水平范圍內(nèi)，根據(jù)回歸分析法所得的二次方程，得到交互作用影響顯著的兩變量之間二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖，見圖7。當(dāng)CaCl2濃度為3.0 mmol/L時，在固定的MSG濃度下，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨VB6濃度的增加呈先增加隨后緩慢下降的趨勢。當(dāng)VB6濃度為0.029 mg/mL時，GABA富集量最大。當(dāng)MSG濃度為10.17 mg/mL時，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

圖7 MSG和VB6的交互作用對蒜米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)曲面圖

從Box-Behnken試驗結(jié)果得出，當(dāng)培養(yǎng)液中MSG濃度為10.17 mg/mL、CaCl2濃度為3.02 mmol/L、VB6濃度為0.029 mg/mL時，蒜米富集GABA最高，此即為最佳培養(yǎng)液中外源添加物濃度。在此條件下蒜米中GABA富集量預(yù)測值為0.827 mg/g，通過驗證試驗，測得的實際值為0.832 mg/g，預(yù)測值與實際值高度相符，從側(cè)面證明所建立模型可靠，可以預(yù)測響應(yīng)值和組分濃度之間的關(guān)系。在最佳培養(yǎng)液中外源添加物培養(yǎng)下，蒜米GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最優(yōu)培養(yǎng)工藝的1.90倍，是原料的5.81倍，說明培養(yǎng)液中添加了外源添加物后能顯著提高蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)論

采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了蒜米富集GABA的最佳培養(yǎng)工藝，即培養(yǎng)溫度20 ℃、培養(yǎng)時間36 h，培養(yǎng)液pH 5.8，三因素的影響順序依次為培養(yǎng)液pH＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間，此時蒜米中GABA的富集量為0.439 mg/g，是原料的3.07倍。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳培養(yǎng)液外源添加物濃度為MSG濃度10.17 mg/mL、CaCl2濃度3.02 mmol/L和VB6濃度0.029 mg/mL，此時蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.832 mg/g，是原料的5.81倍。由方差分析可知，MSG的一次項和二次項，CaCl2二次項，VB6的一次項和二次項以及MSG和VB6的交互作用均顯著影響蒜米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。